白喉棒状杆菌荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 在本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中白喉棒状杆菌核酸的 试剂盒，属于白喉棒状杆菌的体外诊断领域。
【背景技术】
[0002] 白喉棒状杆菌(C. diphtheriae)是引起小儿白喉的病原菌，棒状杆菌属。白喉棒状 杆菌可存在于假膜、鼻及鼻咽分泌物中，主要通过呼吸道传播，也可通过污染的物品如玩具 等传播。白喉棒状杆菌侵入易感者上呼吸道，在鼻咽部等处黏膜上繁殖，产生外毒素，引起 感染的局部黏膜上皮细胞坏死、血管扩张、白细胞和纤维蛋白渗出形成灰白色假膜，导致白 喉病。在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测 为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感 性的基础。
[0003] 本发明针对白喉棒状杆菌基因序列的保守区域特异的靶序列设计引物和Taqman 探针，利用real-time PCR的方法，用来快速检测样品中是否存在白喉棒状杆菌的核酸。
【发明内容】
[0004] 在本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在白喉棒状杆菌， 提供一种特异性检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒。
[0005] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 一种特异性检测样品中白喉棒状杆菌核酸的试剂盒，其组分包括PCR反应液、酶混合 液、阴性质控品和阳性质控品，其中PCR反应液主要含有相关的引物和探针、反应缓冲液、 Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无 RNase和DNase水，阳性质控 品为含有白喉棒状杆菌检测靶序列的重组质粒。
[0006] 其中PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对白喉棒状杆菌基 因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物;PCR反应液中用于荧光信号 监测的寡核苷酸探针为ProbeUProbel为针对白喉棒状杆菌基因组群特异性保守序列设计 并经预实验筛选出的特异性探针，其中荧光报告基团XiSFAM，荧光淬灭基团YiSEclipse (见表1)。
[0007 ]表1检测白喉棒状杆囷的引物和探针序列
本发明的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测白喉棒状杆菌的应用方法， 包括： 试剂盒选用的PCR反应体系为20 μL，包括2XPCR缓冲液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ 1、25_〇1/1引物各0.5 yUlOymol/L探针0.2 μL、热启动Taq酶混合液0.4 μL、样品DNA 2 μL，加灭菌水至终体系20 μL。
[0008] 试剂盒的PCR反应循环参数为94°C，2min;进入循环阶段:94°C变性10s，56°C退火 50s，72°C延伸15s，共反应40个循环。
[0009] 质量控制:每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无 Ct值(或Ct值为0)，阳性对照 Ct值< 30，否则实验结果不成立。
[0010] 结果判读： 阳性：出现"S"型扩增曲线，Ct值< 35;可疑：出现"S"型扩增曲线，但Ct值> 35;阴性:没 有出现"S"型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈"S"型;对可疑结果，应重复实验， 如果重复实验还是出现"S"型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
[0011] 样本要求：临床样本类型包括咽拭子和培养物；临床样本采集后应带冰运输，-20 °C保存，不能反复冻融;从临床样本提取DNA，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体 方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的DNA应立即检测，否则，应将DNA分装后-80°C~_ 20°C保存。
[0012] 本发明提供的试剂盒具有很好的特异性，可以检出白喉棒状杆菌，但不能检出非 白喉棒状杆菌病原体的核酸;对白喉棒状杆菌核酸的检测下限为10拷贝每反应体系；只需 要2小时即可完成检测，可为白喉棒状杆菌的疾病监测和临床诊断提供实验依据。
【附图说明】
[0013] 图1为单重实时荧光PCR检测白喉棒状杆菌阳性标准品的扩增曲线图。从左至右的 每组曲线对应浓度依次为2X 106-2 X 102C〇pieSAil，试剂盒对白喉棒状杆菌的检测限均为 10拷贝每反应体系。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的A Rn值。
[0014] 图2为单重实时荧光PCR检测体系检测10种细菌基因组DNA的扩增曲线图。10种细 菌包括：白喉棒状杆菌和9种阴性对照微生物。白喉棒状杆菌出现S型扩增曲线，而其他9种 病原微生物未出现S型扩增曲线。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出 的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使 用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人 员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。
[0016] 引物和TaqMan探针的设计与合成 利用Blast工具对Genbank和国内外文献中的白喉棒状杆菌基因组序列进行分析，分别 选择其稳定的保守区域作为检测靶序列。白喉棒状杆菌检测靶序列来源于白喉毒素假基 因；并针对检测靶序列设计和合成引物和探针(见表1)。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝 生物公司合成，白喉棒状杆的检测探针5 '端标记FAM荧光基团；3 '端标记Eel ipse荧光淬灭 基团。
[0017] 检测菌种的准备 本实施例中所使用的白喉棒状杆菌以及其他阴性对照菌株(溃疡棒状杆菌，假白喉棒 状杆菌，溶血棒状杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，大肠杆菌，微小棒状杆菌，流感嗜血 杆菌，炭疽芽孢杆菌)均购买于中国药品生物制品检定所。
[0018] 菌株DNA的抽提 选用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit(货号：51306)提取菌株DNA。具体步骤试剂盒参 考操作说明书。
[0019] 引物和探针的筛选 采用设计的引物和探针检测提取的白喉棒状杆菌和阴性对照菌株的基因组DNA，经反 复实验，筛选出灵敏度、特异性和重复性最佳的引物探针组合。（见序列表，白喉棒状杆菌 (正向引物P1、反向引物P2和探针Probe 1) 标准品的构建与制备 利用P1和P2引物扩增白喉棒状杆菌基因组DNA，将PCR产物克隆至pMD-18T载体，转化 DH5a大肠杆菌，利用碱裂解法提取阳性克隆质粒，利用紫外可见分光光度计分别测定在波 长260nm处、280nm处DNA的吸光率，然后计算质粒浓度与纯度。然后10倍梯度稀释至200拷贝 每微升，制备白喉棒状杆菌的阳性标准品。
[0020] 反应条件优化 对引物、探针、酶等要素逐一优化，确定的反应体系为：2XPCR缓冲液10 μ1、10_〇?Α dNTP 1.0yl、25ymol/L引物各0.5 yl、10ymol/L 探针0.2 yl、Takara聚合酶混合物0.4 μL、 模板2 μL，加灭菌水至终体系20 μL。
[0021] 根据扩增片段长短、引物和探针的退火温度以及酶的特性，主要对反应的退火温 度和延伸时间进行了优化，最终确定循环参数为:94°C，2min;进入循环阶段:94°C变性10s， 56°C退火50s，72°C延伸15s，40个循环，每个循环在退火阶段采集荧光信号。
[0022]在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。
[0023]检测限的评价 以上述5中的阳性标准品评价本发明提供的试剂盒的检测限，阳性标准品浓度为:2X lC^copies/yl、2 XlC^copies/yl、2 X104copies/yl、2 X lC^copies/yl、2 X 102copies/yl，本 发明提供的试剂盒对白喉棒状杆菌核酸的检测下限为10拷贝每反应体系。
[0024] 检测特异性的评价 以上述菌株DNA为模板评价了本试剂盒的特异性。对白喉棒状杆菌DNA进行检测时均可 见明确扩增曲线，对上述9种其他咽部常见病原微生物DNA检测时，未产生阳性扩增曲线，说 明我们使用的探针和引物与我们选定的其他菌株之间不存在交叉反应。
[0025] 尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方 式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本 发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如， 本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光 报告基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如 物;或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧 光双杂交探针等荧光探针标记技术;或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LC Green等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定性或定量检测目的 基因的存在，进而特异性地检测白喉棒状杆菌的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的 改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要 求书限定。
[0026] 序列表
【主权项】
1. 在一种用于特异性检测样品中白喉棒状杆菌核酸的试剂盒，其中包括PCR反应液、酶 混合液、阴性质控品和阳性质控品;PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下： PI：5'- GCTCGGAGAAAATTCATTCTAATG -3', P2:5'_ TCCACTGTTTTCTGGTACCCAA -3'， PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下： Probe：5'-Xi- TTTCGTCGGATTCCATAGGCGTTC -Υι -3', Probe荧光报告基团X^FAM，焚光淬灭基团Y^Eclipse。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR反应体系为20 μL，包括2 XPCR缓冲液 10 yl、10mmol/L dNTP 1.0yl、25ymol/L引物各0.5 yl、10ymol/L 探针0.2 μL、热启动Taq 酶混合液〇.4μ1、样品DNA 2μ1，加灭菌水至终体系20 μL。
【专利摘要】本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中白喉棒状杆菌核酸存在的试剂盒。利用本发明的试剂盒，可快速检测样品中是否存在白喉棒状杆菌核酸。该试剂盒对白喉棒状杆菌核酸的检测限为10拷贝每反应体系，整个反应可在2小时内完成，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。
【IPC分类】C12R1/16, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105524995
【申请号】CN201610019376
【发明人】不公告发明人
【申请人】江苏和创生物科技有限公司
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月13日