10135中分离获得、从重组表达所述醛缩酶的重组表达载体的质粒中扩增获得或 者人工合成获得。
[0019] 本发明的技术方案之四是：一种包含所述醛缩酶的重组表达载体。
[0020] 本发明所述重组表达载体由通过本领域常规方法将所述醛缩酶的基因连接于 各种骨架载体上构建而成；较佳地，可通过下述方法制得：将通过PCR所得的醛缩酶的基 因的扩增产物与载体PMD-18T连接，形成克隆载体，之后将所述克隆载体和所述骨架载 体pET28a用限制性内切酶EcoRI和Hind III双酶切，形成互补的粘性末端，再经连接酶 连接，形成含有所述醛缩酶的基因的重组表达载体pET28a-LbDERA、pET28a-LbDERA T29A、 pET28a-LbDERAE78K* pET28a-LbDERA F163V。所述骨架载体可为本领域常规的各种载体，如市 售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，较佳地为质粒pET28a。
[0021] 本发明的技术方案之五是：一种包含所述醛缩酶的基因的重组载体的转化体。
[0022] 本发明所述转化体由通过本领域常规方法将所述重组表达载体转化至宿 主微生物中制得；较佳地，将所述重组表达质粒pET28a-LbDERA、pET28a-LbDERA T29A、 pET28a-LbDERAE78K*pET28a-LbDERAF163V转化至E. coli BL21 中，即可。所述宿主微生物可为 本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足所述重组表达载体可稳定地自行复制，且所携 带的醛缩酶的基因可被有效表达即可；较佳地为大肠杆菌，更佳地为大肠埃希氏菌E. coli BL21 或 E. coliDH5a。
[0023] 本发明的技术方案之六是：一种所述醛缩酶的制备方法，其包括如下步骤：培养 所述转化体，从培养液中获得醛缩酶。
[0024] 本发明所述醛缩酶通过将所述转化体培养后得到。所述培养的方法和条件为本领 域常规的方法和条件，可以根据宿主类型和培养方法等因素进行适当的选择，只要使转化 体能够生长并产生所述醛缩酶即可；较佳地，为下述方法：将所述重组表达转化体接种至 含50 μ g/mL卡那霉素的所述LB培养基中35?40°C、160?200rpm振荡培养，当培养液的 光密度OD6c?达到0. 8?1. 2时，按0. 8?1. 5 % (v/v)的接种量装入有IOOmL所述LB培养 基的500mL三角瓶中，加入终浓度为0. 05?0. 2mmol/L的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖 苷（IPTG) 18?22°C诱导20?36小时，离心、收集细胞后洗涤获得静息细胞并悬浮，超声 破碎后离心收集上清即得所述缩醛酶的粗酶液；更佳地，将所述重组表达转化体接种至含 50 μ g/mL卡那霉素的所述LB培养基中37°C、180rpm振荡培养，当培养液的光密度OD6c?达 至IJ 1时，采用终浓度为〇. lmmol/L的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷20°C诱导24小时。 所述培养所用的培养基为本领域任何可使所述转化体生长并产生所述醛缩酶的培养基；较 佳地为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，pH7. 0。
[0025] 本发明中，较佳地，所述诱导后有对所述醛缩酶进行纯化的步骤：将所述缩醛酶的 粗酶液上样，用A液洗脱杂蛋白，然后用B液洗脱目标蛋白醛缩酶，根据聚丙烯酰胺凝胶电 泳的检测结果收集纯化后的目标蛋白，所述A液为：Tris-HCl缓冲液（20mM，pH8.0)，含有 0· 5M NaCl、20mM 咪唑和 10% (w/v)的甘油；所述B 液为：Tris-HCl 缓冲液（20mM, pH 8. 0)， 含有0.5M NaCl、500mM咪唑和10% (w/v)的甘油。
[0026] 本发明的技术方案之七是：一种具有光学活性的他汀中间体（3R，5S)
[0027] _6_氯_2, 4, 6_二脱氧-D-赤型批喃己糖苷的制备方法，包括以下步骤，在缓冲 液中，在如上所述醛缩酶的作用下，将如化学式I所示的化合物乙醛和如化学式II所示的 化合物氯乙醛进行缩合反应，制得具有光学活性的如化学式III所示的化合物他汀中间体 (3R, 5S) -6-氯-2, 4, 6-二脱氧-D-赤型批喃己糖苷：
[0028]
【主权项】
1. 一种短乳杆菌（Lactobacillusbrevis),其特征在于，其保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO. 10135。
2. -种醛缩酶，其特征在于，其是如下（a)或（b)的蛋白质： (a) 如序列表中SEQIDNo. 2所示氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 由SEQIDNo. 2所示氨基酸序列在第29位、第78位或第163位替换一个氨基酸而 形成的氨基酸序列组成的蛋白质。
3. 如权利要求2所述的醛缩酶，其特征在于，所述蛋白质（b)为将如序列表中SEQID No. 2所示的氨基酸序列的第29位的苏氨酸残基替换为丙氨酸残基而形成的氨基酸序列组 成的蛋白质、将如序列表中SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列的第78位的谷氨酸残基替换为 赖氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质或将如序列表中SEQIDNo. 2所示的氨基酸 序列的第163位的苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质。
4. 一种醛缩酶的基因，其特征在于，其 (1) 核苷酸序列如序列表中SEQIDNo. 1所示；或 (2) 编码如序列表中SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或编码由SEQID No. 2所示氨基酸序列在第29位、第78位或第163位替换一个氨基酸而形成的氨基酸序列 组成的蛋白质。
5. 如权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因（2)编码将如序列表中SEQID No. 2所示的氨基酸序列的第29位的苏氨酸残基替换为丙氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋 白质、编码将如序列表中SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列的第78位的谷氨酸残基替换为赖 氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质或编码将如序列表中SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列 的第163位的苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
6. -种包含如权利要求4所述的醛缩酶的基因的重组载体。
7. -种包含如权利要求6所述的重组载体的转化体。
8. -种醛缩酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养如权利要求7所述的转化 体，从培养液中获得醛缩酶。
9. 一种具有光学活性的他汀中间体（3R，5S)-6-氯-2, 4, 6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖 苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，在缓冲液中，在如权利要求2所述醛缩酶的作 用下，将如化学式I所示的化合物乙醛和如化学式II所示的化合物氯乙醛进行缩合反应， 制得具有光学活性的如化学式III所示的化合物他汀中间体（3R，5S)-6-氯-2, 4, 6-三脱 氧-D-赤型吡喃己糖苷：
10. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为pH4-10的缓冲液；较 佳地为选自PH4-6的柠檬酸钠缓冲液、pH6-8的磷酸钾缓冲液、pH8-9的Tris-HCl缓冲液和 PH9-10的Na2C03-NaHC03缓冲液的任一种；更佳地为pH6. 0的磷酸钾缓冲液；所述氯乙醛的 浓度为50?lOOOmM，较佳地为100?700mM;所述乙醛的摩尔浓度为所述氯乙醛的两倍；和 /或，所述反应的温度为20°C?65°C;较佳地为30?40°C。
【专利摘要】本发明公开了一种短乳杆菌(Lactobacillus？brevis)、醛缩酶、及其基因和制备他汀中间体的方法，所述的短乳杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC？NO.10135。所述的短乳杆菌可以产生醛缩酶，与现有技术相比，所述的醛缩酶具有更高的活性、热稳定性以及底物耐受性，使用所述醛缩酶及其突变体催化制备他汀中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧-D-赤型吡喃糖苷具有反应条件温和、底物浓度高、催化剂用量少等优点，因此在工业生产中具有很好的应用前景。CGMCC NO. 1013520141208
【IPC分类】C12P17-06, C12N15-60, C12N1-20, C12N9-88, C12R1-24
【公开号】CN104560832
【申请号】CN201510023924
【发明人】许建和, 焦学成, 潘江, 陈琦, 孔旭东
【申请人】华东理工大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月16日