一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌bz25的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物，特别涉及降胆固醇、耐氧双歧杆菌。
【背景技术】
[0002] 胆固醇广泛存在于动物组织细胞中，是构成细胞的重要成分之一，在人体中发挥 着重要的生理作用。它在体内转化形成类固醇激素，是合成维生素 D以及胆汁酸的前体物 质。体内胆固醇主要有两个来源，一是食物，二是内源合成。有些人由于不合理膳食习惯， 血液胆固醇含量超过正常指标；而体内胆固醇含量过高会造成动脉粥样硬化、冠心病等心 脑血管疾病，严重威胁到人类健康。据报道，全球心脑血管疾病引起人类死亡的人数占总死 亡人数的29%。根据世界卫生组织预测，到2030年，心脑血管疾病仍将是导致人类死亡的 主要原因，而血清中的胆固醇过高是引发冠心病、动脉硬化、脑中风等心脑血管疾病的重要 因素。有研究发现与拥有正常血脂的人相比，高胆固醇血症的人患心脏病的风险是其正常 人的3倍。因此，通过降低血清胆固醇水平来对心脑血管疾病进行防治是一种实效可行的 研究方向，具有潜在的应用价值和广阔是市场空间。
[0003] 欲降低体内胆固醇，除了通过合理饮食以外，运用生物转化法，特别是运用益生菌 对胆固醇进行直接降解已成为研究的趋势。双歧杆菌作为人体肠道内的一类益生菌，其益 生作用有维持肠道内菌群平衡、降低血清胆固醇、抗肿瘤等益生作用。而贵州香猪是贵州省 特色资源，属于小型猪，其遗传稳定，器官结构和功能与人体相似。因此，从香猪中筛选出来 的双歧杆菌易于为人体所接受和利用。
[0004] 目前中国专利数据库中，涉及双歧杆菌的专利申请件很多，但涉及耐氧双歧杆菌 的专利申请件仅有浙江大学申请的ZL2009100965117号《一种耐氧性双歧杆菌》和天津科 技大学申请的ZL2011100894937号《一种耐氧耐酸性长双歧杆菌》2件。这两个双歧杆菌能 否降胆固醇不得而知。迄今为止，尚无涉及降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌的申请件。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌，使之有可能作为益生菌 进一步深度开发利用，添加到发酵乳制品中使其成为功能性食品，以降低人体胆固醇含量， 促进人类健康。
[0006] 发明人提供的香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌，该菌株为动物双歧杆菌乳亚种 (Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)，该菌株的纯培养物已于 2014 年 12 月 18 日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，该中心地址是：中国北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101 ;保藏编号 为CGMCC NO. 10225,简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ25。该菌株是从贵州特色资源小香猪的 肠道内溶物中筛选与分离纯化得到。
[0007] 上述动物双歧杆菌乳亚种BZ25的形态特征及生理生化特征菌均接近于双歧杆 菌属，其16S rRNA基因序列与动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. Lactis)的16S rRNA序列同源性在99%以上，根据《伯杰氏系统细菌学手册》中双歧杆 菌属的分类规定，动物双歧杆菌乳亚种BZ25属于放线菌门（Actinobacteria)、放线菌纲 (Actinobacteria)、放线菌亚纲（Act inobacteridae)、双歧杆菌目（Bifidoacteriales)、 双歧杆菌科（Bif idobacteriaceae)、双歧杆菌属（Bif idobacterium)，动物双歧杆菌乳亚 种（Bifidobacteriumanimalis subsp. Lactis)〇
[0008] 发明人提供的菌株是从贵州特色资源小香猪肠道内溶物中分离并初步筛选出 具有降胆固醇能力的双歧杆菌，并对所得的菌株以降胆固醇率、耐酸耐胆盐受性为指标进 行进一步的复筛，复筛出一株胆固醇去除率高且耐酸受性、耐胆盐受性均良好的双歧杆菌 菌株，然后对该菌株进行耐氧性能实验，最终通过对该菌株进行形态学、生理生化试验鉴 定和16S rRNA序列鉴定，最终鉴定出此菌株为动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animal is subsp.Lactis)〇
[0009] 为了验证本发明的菌株，发明人进行了如下实验：
[0010] ⑴样品的采集与分离纯化
[0011] 从贵州省特色资源小香猪的多个部位采样，包括小肠、大肠以及新鲜的小香猪粪 便中，编号并记录，并迅速带回实验室处理。取IOg的新鲜样品放入装有90mL的无菌生理盐 水中，人工摇匀后，在洁净工作台内用移液枪吸取IOOul混合液涂布于含有Li-Mupirocin 的MRS平板上，置于厌氧培养箱（厌氧环境为N2: CO2: H2= 90 : 5 : 5)中，37°C培养 48h，然后挑取单菌落接种于含有X-gal的PTYG平板上，放入37°C、20% CO2浓度的二氧化 碳培养箱中培养两天，观察菌落颜色、形态并进行革兰氏染色、镜检，记录菌株形态特征。将 疑似双歧杆菌菌株在PTYG平板上纯化传代4次后，甘油保藏于-80°C的超低温冰柜中。
[0012] 上述MRS琼脂培养基成分为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，吐 温 801mL，K2HP042g，醋酸钠 5g，柠檬酸二铵 2g，MgSO4 · 7H20 0· 58g，MnSO4 · 4H20 0· 25g，琼 月旨20g ;制法是将各成分加热溶解于IOOOmL蒸馏水中，调pH值至6. 5,121 °C灭菌15min，备 用。
[0013] 上述含有Li-Mupirocin的MRS (MUP-MRS)中，IOOmLMRS琼脂培养基含有5mg的莫 匹罗星锂盐（Li-Mupirocin)。
[0014] 上述PTYG液体培养基成分为：胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉10g，葡萄糖 l〇g，吐温801mL，盐溶液40mL ;制法是将各成分加热溶解于IOOOmL蒸馏水中，调pH值至 6. 5,121°C灭菌 15min，备用。
[0015] 上述培养基中的盐溶液成分为：无水CaCl2O. 2g，K2HPO4L Og，KH2PO4L Og，MgSO4 ·7Η 20 0. 48g，Na2CO3IOg, NaCl 2g ;制法是将 CaClJP MgS04 · 7Η20 混合在 300mL 蒸馏水中直至 溶解，加入500mL水，搅拌同时缓慢加入其他盐类，直至溶解；再加入200mL蒸馏水，混合后 贮存于4°C，备用。
[0016] 上述PTYG琼脂培养基制法为：在每IOOOmL的液体培养基中加入20g琼脂粉，加热 煮沸，121°C灭菌15min后倾注平板，备用。
[0017] 上述含有X-gal的PTYG (PTYG-X)培养基制法为：在每IOOOmL的改良PTYG培养基 中加入X-gal 40mg，由于X-gal不耐高温，直接用无菌水稀释浓度为20mg/mL，每个PTYG平 板涂布40 μ L,备用。
[0018] (2)胆固醇去除率的测定
[0019] 将初筛所得的菌株采用邻苯二甲醛法（OPA)测其胆固醇去除率。
[0020] (3)待测菌悬液的制备
[0021] 将保藏在_80°C的超低温冰柜中的菌株活化，划线纯化3次后，接种于PTYG液体培 养基中进行富集培养，然后将菌悬液离心，收集菌泥，将菌液浓度调至10 8CFU/mL，菌悬浮液 带用于体外耐受实验。
[0022] (4)酸耐受性实验
[0023] 将待测菌悬液按5 % (体积比）接种量分别接种于pH3. 0和pH7. 0的灭菌PTYG液 体培养基中，混匀后37°C下静置2h，进行平板计数。
[0024] (5)胆盐耐受性实验
[0025] 将待测菌悬液按5% (体积比）接种量分别接种于添加0· 3% (质量/体积）牛 胆盐的灭菌PTYG液体培养基和不含牛胆盐的灭菌PTYG液体培养中，37°C恒温二氧化碳培 养箱中培养，分别于Oh和24h进行活菌计数。
[0026] (6)耐氧性能实验
[0027] 将经过耐酸性和胆盐耐受性的菌株接种到PTYG培养基中分别在普通培养箱和 20% CO2的二氧化碳培养箱中培养24h后，进行平板计数。对两者生长去进行对比以判断 其耐氧性。
[0028] 通过上述采样、分离纯化的初筛实验以及以菌株的降胆固醇率，耐受性为指标进 行复筛，最终得到一株菌株BZ25,其降胆固醇率高，达到36. 32 %，且耐酸受性和耐胆盐受 性好，并对氧有较好耐受性。
[0029] (7)菌株的鉴定
[0030] 对所得菌株进行生理生化鉴定以及种属的鉴定，了解其生理生化特征，对有效地 应用文献、指导进一步研究和应用有重要作用。因此，对本发明中的菌株BZ25进行了生理 生化实验鉴定以及16S rRNA序列的鉴定。
[0031] 形态特征：将菌株接种于PTYG平板上，37°C培养48h，其菌落形态为菌落较小、光 滑、凸圆、边缘整齐、白色或乳白色不透明且质地柔软，在PTYG-X平板上则呈现出深蓝色的 菌落。挑取其菌落进行革兰氏染色，其革兰氏染色呈阳性，且在光学显微镜下观察其细胞形 态呈多形态杆状，符合双歧杆菌细胞形态特征。其生理生化实验结果见表1。
[0032] 表1细胞形态及理化试验结果
[0033]
【主权项】
1. 一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌BZ25,其特征在于该菌株为动物双歧杆菌乳 亚种（Bifidobacteriumanimalis subsp. Lactis)，该菌株的纯培养物已于 2014 年 12 月 18 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，该中心地址是：中国 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101 ;保藏编 号为CGMCC NO. 10225,简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ25。
2. 如权利要求1所述的香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌BZ25,其特征在于所述 杆菌BZ25的形态特征及生理生化特征菌均接近于双歧杆菌属，其16S rRNA基因序列 与动物双歧杆菌乳亚种（AiAWoAacteria? subsp. Zacii1S)的 16S rRNA 序 列同源性在99%以上，根据《伯杰氏系统细菌学手册》中双歧杆菌属的分类规定，动物 双歧杆菌乳亚种BZ25属于放线菌门（Actinobacteria)、放线菌纲（Actinobacteria)、 放线菌亚纲（Actinobacteridae)、双歧杆菌目（Bifidoacteriales)、双歧杆菌 科（Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌属（Bifidobacterium)，动物双歧杆菌乳亚种 {Bifidobacterium animal is subsp. Lactis)。
【专利摘要】一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌BZ25，该菌株为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium？animalis？subsp.Lactis)，该菌株纯培养物于2014年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该中心地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101；保藏编号为CGMCC？NO.10225，简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ25。该菌株不仅降胆固醇能力高、耐酸受性、耐胆盐受性、耐氧性能良好和具有益生特性，能作为益生菌添加到发酵乳制品中使其成为功能性食品，丰富了双歧杆菌菌种资源，对双岐杆菌保健产品的开发有积极意义。CGMCC NO.1022520141218
【IPC分类】C12N1-20, C12R1-01, A23C9-12
【公开号】CN104560829
【申请号】CN201510018130
【发明人】何腊平, 张玲
【申请人】贵州大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月14日