油藏中微生物菌体的提取方法及分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于油田采油技术领域，具体涉及一种油藏中微生物菌体的提取方法及分 析方法，能直接从原油中提取微生物，保证在含水极低的油藏中依然可以对油样中的微生 物进行充分提取和分析。
【背景技术】
[0002] 微生物提高采收率相关技术，从1976年提出至今，经过30年的发展，已成为继化 学驱油、气体驱油、热力驱油后的第四种驱油、提高原油采收率的方法。油藏中的微生物大 多以碳源（蜜糖、烷烃）为其生长和繁殖的营养物。只要这些营养物质充足，微生物就能源 源不断地生产有利于提高石油采收率的代谢产物。微生物提高采收率技术的机理主要有以 下五种：
[0003] 1)微生物在代谢过程中产生有机酸：这些酸可以溶解油层中碳酸盐岩，提高地层 渗透作用；
[0004] 2)微生物在代谢过程中产生气态物质：主要包含甲烷、氢气二氧化碳、硫化氢等， 这些气体在油层中聚集提高地层压力，增大驱油能力，起到了气体混相驱或非混相驱的作 用；
[0005] 3)微生物在代谢过程中产生生物表面活性剂和生物乳化剂：主要成分为脂肪酸 及其脂类，降低稠油分子粘度，增加原油流动性；
[0006] 4)微生物繁殖产生生物聚合物：微生物产生的聚合物主要是多糖，它们能选择性 地堵塞地层大孔道，提高注水波及体积系数，提高驱油效率；
[0007] 5)微生物产生溶解地层原油的溶剂：包含有丙醇、丁醇、丙酮、甲醛等，这些溶剂 可以将地层原油稀释，提高单位时间的石油产量。
[0008] 在微生物采油技术中，主要是通过微生物的筛选，甄别并判定在油藏开采中的有 益菌和有害菌。对有益菌根据其功能研宄和了解其在提高采收率上的作用和机理；而对于 有害菌，则通过相关研宄制定防范和控制措施。但是所有这些相关的研宄，最初始和最关键 步骤就是油藏中菌群的提取。不同样品中提取微生物的难易度以及微生物种类的多样性， 将直接关系和影响到后期一些列微生物的相关研宄。
[0009] 目前国内外在微生物提高采收率方面的研宄中，对油藏中菌群的提取都是基于对 油样中所含水里的微生物进行提取。而油田样品大多是油水混合物，加上聚合物驱油后产 生了很多悬浮物，或者当待分析的原油中自然分水量较少时（例如稠油油藏），都会出现样 品很难进行油水分离的情况，这就完全限制了微生物的提取。此外，油藏样品中菌浓较低， 而且很多菌种都是分布在油水界面上，油样直接进行油水分离会使一部分菌种丢失，从而 影响微生物多样性分析结果。
[0010] 文献"油藏微生物多样性的分子生态学研宄进展"（李辉等，《微生物学通报》，2008 年5月，第35卷第5期，803-808页）公开了一种油藏微生物的收集方法，其中记载了先用 极性较弱的有机溶剂洗涤萃取油类物质，使细胞体尽量转入水相中，再用冷冻超速离心方 法收集大部分细胞体，以最大限度地收集到样品中的微生物细胞。然而，此方法是用有机溶 剂萃取（确切来说不是萃取，而是富集），这样是能将原油中的少量菌提出DNA，但是有机溶 剂是养料，细菌接触后会生长，这将破坏整个菌落的分布状况和分布比例。利用该方法收集 到的油藏微生物，可以用来分析油藏菌落多样性，但由于油藏原始菌落分布已被后期生长 破坏了，并无法分析原始菌落的分布比例。
[0011]因此，如能有效地从油藏中充分提取菌群并保持原始菌群分布状况，对于促进油 藏微生物研宄发展具有重大意义。
【发明内容】
[0012] 本发明的主要目的在于针对现有技术中难以有效从油藏特别是含水量较少的原 油中全面提取微生物并保持原始菌群分布状况的缺失，提供一种能直接从原油中提取微生 物、保证在含水极低的油藏中依然可以对油样中的微生物进行较全面的充分提取并且能保 持原始菌群分布状况的方法。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种油藏中微生物菌体的分析方法。
[0014] 为实现上述目的，本发明提供了一种油藏中微生物菌体的提取方法，该方法包括 步骤：
[0015] 1)配制微生物萃取液，每升该萃取液的组成为！K2HPO4O. 3?0· 5g，KH2PO4O. 25? 0· 4g，MgSO4O. 1 ?0· 3g，MnSO4L 5 ?2. 5mg，Fe2 (SO4) 32. 0 ?3. Omg，NaCl 0· 1 ?0· 2g，柠檬 酸钠0. 3?0. 6g，葡萄糖0. 8?I. 2g，水余量；
[0016] 2)将微生物萃取液与油藏样品按照1:0. 5?3的体积比混合，充分振荡接触；使 萃取液可以很好的和微生物接触；
[0017] 3)将上述微生物萃取液与油藏样品的混合物置于50_60°C静置10?30分钟，混 合物分为油层和水层，分离出水样；该过程中，所设置的温度适合激活和维持绝大多数油藏 中微生物的活性，油藏中的微生物逐渐恢复活性，并同时开始向适合生存的环境中（微生 物萃取液）迀徙转移；
[0018] 4)将油层与水层分离，在分离出的油样中再次加入0. 5?3倍提及的微生物萃取 液，置于50-60°C静置10?30分钟，使混合物分为油层和水层，分离出水样；
[0019] 5)反复上述萃取步骤3?7次，合并所分离出的水样，从中提取微生物菌体。
[0020] 本发明的油藏中微生物菌体的提取方法，主要是使用无机萃取液，并特别添加了 一定浓度的柠檬酸钠和葡萄糖，可直接从油藏样品例如原油中萃取微生物，本发明的萃取 液可以为油藏中微生物提供良好的生存环境，让微生物维持生命，但在本发明的萃取条件 下不会繁殖，从而，本发明的方法能够最大限度地对油藏样品中的微生物进行充分提取，且 能保持原始菌群分布状况，所提取的微生物菌体既可以用来分析细菌的多样性，也能用来 分析细菌分布发育比例。
[0021] 根据本发明的具体实施方案，本发明的油藏中微生物菌体的提取方法中，所述油 藏样品可以为原油（包括稠油等）、油泥或是油水混合样品。
[0022] 根据本发明的具体实施方案，本发明的油藏中微生物菌体的提取方法中，所述微 生物萃取液的配料可以以K 2HP04、KH2P04、MgS04、MnS0 4、Fe2 (SO4) 3、NaCl、柠檬酸钠、葡萄糖 等试剂与水配制而成，其中所述MgS04、MnS0 4、Fe2 (SO4) 3可以采用无水试剂或带结晶水的试 剂，本发明中前述萃取液中各组分含量是以纯有效物质计，可以理解，当采用带结晶水的试 剂时，其用量应进行适当换算。在本发明的一优选具体实施例中，所述微生物萃取液的配料 组成为：以每升萃取液计，K2HPO 4O. 4g，KH2PO4O. 3 ?0· 35g，MgSO4O. 15 ?0· 25g，MnSO4L 5 ? 2. 5mg，Fe2 (SO4) 32. 0 ?3. Omg，NaCl 0· 13g，梓檬酸钠 0· 4 ?0· 5g，葡萄糖 I. Og，水余量。
[0023] 根据本发明的具体实施方案，本发明的油藏中微生物菌体的提取方法中，步骤2) 中微生物萃取液与油藏样品的混合物的总体积为IOOml?1000ml。样品或萃取液太少不利 于有效萃取，过多不利于操作。优选地，步骤2)中微生物萃取液与油藏样品的混合比例为 80ml?500ml :80ml?200ml。普通实验室操作通常微生物萃取液与油藏样品各取80ml? 120ml〇
[0024] 根据本发明的具体实施方案，本发明的油藏中微生物菌体的提取方法中，步骤3)、 步骤4)中，微生物萃取液与原油