3号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性qtl紧密连锁的ssr标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与水稻抗黑条矮缩病主效QTL紧密连锁的分子标记。本发明的实质是根据连锁分离规律，以特特勃和RBSDV感病品种杂交后代F2群体为作图群体，通过抗病性鉴定结果和SSR标记数据间的连锁分析，获得了3号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的SSR标记RM5626和RM7097。通过检测特特勃及其衍生品种(系)与RBSDV感病品种杂交组合后代单个水稻植株的SSR标记带型，可以判断该植株是否具有水稻黑条矮缩病抗性，将其应用于特特勃及其衍生品种(系)/RBSDV感病品种水稻黑条矮缩病抗病品种的辅助选择育种中，可以克服常规育种中水稻黑条矮缩病抗性鉴定稳定性和重复性差、费时费力和技术门槛高等缺点，其结果可以简化选择方法和提高育种效率，进而加快抗黑条矮缩病水稻病品种的选育进程。
【专利说明】3号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性QTL紧密连锁的SSR
标记及其应用
【技术领域】:[0001]本发明涉及3号染色体上一种与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记RM5626和RM7097,可应用于分子标记辅助育种,属于水稻抗病育种和分子生物学领域。
【背景技术】:[0002]水稻黑条矮缩病，病原为水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwavf virus, RBSDV)，是一种由灰飞虱以持久性不经卵方式传播的恶性病毒病。感染RBSDV水稻病株大都不能抽穗，减产严重，除水稻外，还危害小麦、玉米、大麦及高粱等作物。20世纪 60,90年代后期该病害在华北、华东等地暴发成灾，近年来，感病品种的广泛种植及稻麦轮作方式的推广和冬季气候变暖等环境条件的变化使传毒介体灰飞虱的发生量不断上升，导致该病害在华东稻区大面积发生。迄今为止，几乎没有能有效防治病毒病的化学药剂，治虫防病的应急措施无法作为一项长期策略，利用品种自身抗病性是防治病毒病最为经济、 有效的方法。目前，对于水稻黑条矮缩病抗性遗传的研究报道较少，研究结果(作物学报， 2009,35(12):2213-2217 ;作物学报，2010，36 (8):1258-1264 ；Molecular Breeding, 2012, 29(4):925-938)多表现数量性状的特征，但不同研究的抗性基因位点不相同，也有研究 (Treat ofCrop Res, 2007 (8):105-115)发现普通野生稻导入系对水稻黑条矮缩病的抗性由一对显性核基因控制，其抗性为质量性状。这表明不同来源的水稻资源中可能存在差异化的水稻黑条矮缩病抗性机制，而且遗传机制较为复杂。[0003]水稻黑条矮缩病重病区田间鉴定方法方便快捷，但因其易受环境条件、年度和区域间灰飞虱发生情况(发生量和带毒率)不一致等因素影响了结果的重演性，导致不同研究间抗性鉴定结果相去甚远，另外重病区田间鉴定极易受到同时由灰飞虱传播的水稻条纹叶枯病的干扰。人工接种鉴定方法(植物保护学报，2011，38 (4) =301-305)是在可控条件下开展的一种抗性鉴定，利用其评价水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平，除了可以很好地克服田间鉴定中难以规避的两个问题外，还可以拓宽鉴定时间，但是由于RBSDV不经灰飞虱卵传，使得该方法相对费时费力。导致抗性鉴定成为水稻黑条矮缩病育种工作进展缓慢的重要原因之一。[0004]分子标记辅助育种技术有效的解决了这一问题，通过构建重要抗源的遗传连锁图谱和数量性状位点(Quantitative Trait Locus,QTL)分析,可以有效的找到与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记，使用这些标记可以对该抗源的后代及其衍生品系在苗期进行早世代筛选，淘汰感病植株，不仅节约了成本，还提高了育种效率。
【发明内容】
:[0005]本发明针对上述研究背景，以筛选到的水稻黑条矮缩病抗病品种特特勃和感病主栽品种淮稻5号为材料,在842对(http://www.gramene.0rg)微卫星标记中筛选到160个多态性SSR标记，从中选用127个SSR标记对淮稻5号/特特勃F2群体进行分析，构建水稻遗传连锁图谱，将其与F2:3家系的抗病性鉴定结果进行连锁分析，获得了 3号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记RM5626和RM7097，可应用于水稻黑条矮缩病抗病品种的辅助选择育种。
[0006]本发明所提供的3号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记RM5626和RM7097，是通过以下方法获得的:
[0007]I)感病品种淮稻5号(早)与抗病品种特特勃(色)杂交获得杂种FpF1自交得 F2作图群体单株收获F2:3家系种子用于抗病性鉴定；
[0008]2) CTAB法提取亲本、F1及F2群体DNA ；
[0009]3)利用选出的127对SSR引物对亲本、F1及F2群体进行PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，获得分子标记数据，构建遗传连锁图；
[0010]4)采用人工接种鉴定方法测定F2:3家系的抗病性，以发病与否区分为抗病和感病；
[0011 ] 5)根据标记带型用Mapmaker/Exp3.0软件计算出标记间连锁遗传距离，并用 Mapdraw软件根据各标记在染色体上的位置画图，构建水稻遗传连锁图谱；
[0012]6)采用基于复合区间作图法的软件Windows QTL Cartographer V2.5检测水稻黑条矮缩病的抗性QTL。LOD值的阈值定为2.0，按P = 0.005概率值检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置。
[0013]3号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记RM5626和 RM7097的应用包括:以特特勃其衍生品种(系)与RBSDV感病品种杂交组合后代的单个水稻植株为对象，通过检测其3号染色体上RM5626和RM7097标记的带型数据，可以预测该植株对水稻黑条矮缩病的抗性。
[0014]本发明能克服常规育种中水稻黑条矮缩病抗性鉴定稳定性、重复性较差及费时费力等缺点，其结果可以简化选择方法和提高育种效率，进而加快抗病品种的育种进程。
【专利附图】
【附图说明】:
[0015]图1利用淮稻5号/特特勃F2群体构建的分子连锁图谱
[0016]图2特特勃中水稻黑条矮缩病抗性QTL遗传连锁群定位分析示意图
[0017]其中:包含QTL的连锁群区段被显示，左侧为标记间遗传距离(CM);右侧为标记名称。
【具体实施方式】:
[0018]下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0019]实施例1，与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记的获得
[0020]1、植物材料
[0021]2008年在江苏省农科院大田种植亲本淮稻5号和特特勃，并杂交获得杂种F1,次年？:自交得F2种子，2009年在海南繁殖F2群体，作为作图群体。F2单株编号，分蘖期取亲本、杂种F1及F2群体各单株的部分叶片，_70°C冰箱保存用于SSR分析，F2群体单株收种， 以备表型鉴定。2010年对感病主栽品种淮稻5号、抗病品种特特勃、F1和F2:3家系进行人工接种鉴定(植物保护学报，2011，38 (4):301-305)。[0022]2、传毒介体的筛选
[0023]于江苏盐城、徐州、连云港等水稻黑条矮缩病重病区采集表现RBSDV症状(浙江农业科学，1984，(4) =185-192.)的水稻病株，通过RT-PCR方法(江苏农业学报，2009，25 (6): 1263-1267)检测病株是否携带RBSDV，利用水稻条纹叶枯病毒(RSV)外壳蛋白基因对应的引物(CP-F:ATGGGTACCAACAAGCC, CP-R:CTAGTCATCTGCACCTT)检测病株，选取不携带 RSV 的 RBSDV病株作为毒源。将1-2龄无毒灰飞虱若虫在毒源上饲毒2-3d，而后移入育有武育粳3 号秧苗的烧杯中饲养使其度过循回期，12-13d后从每杯中随机取出30头经DIBA方法(南京农业大学硕士论文，2012，杜琳琳)测定其带毒率，用于测算有效接种虫量[有效接种虫量(虫)=接种虫量(虫)X带毒率(％)]。
[0024]3、DNA 提取(CTAB 法)
[0025]I)称取500mg水稻叶片置于2.0mL Eppendorf管中，将离心管置于液氮中冷却，灌满液氮后迅速取出，用研磨棒研磨成粉末状；
[0026]2)65°C条件下水浴 1-1.5h，15min 震荡 I 次；
[0027]3)4°C条件下13，OOOrpm离心lOmin，取上层水相；
[0028]4)加入900 u L氯仿:异戊醇溶液(24: I)，充分混匀震荡至溶液颜色由绿色变为白色；
[0029]5)4°C条件下13，OOOrpm离心lOmin，取上层水相；
[0030]6)加入等体积异丙醇 (或2倍体积无水乙醇)，_20°C条件下静置20_30min，沉淀出絮状DNA ；
[0031]7)4°C条件下13，OOOrpm离心lOmin，弃上清，加入lmL70%乙醇洗涤，4°C条件下 13，OOOrpm离心5min,弃上清并用滤纸吸干,置于超净台上晾干。
[0032]8)加30 ii L去离子水溶解DNA，4°C保存备用。
[0033]用Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪测定OD值和浓度,将各样品 DNA稀释至20ng/ u L备用。
[0034]4、SSR标记分析
[0035](I) PCR 扩增
[0036]采用10 ii L的PCR反应体系，如表1 ;
[0037]表1PCR反应体系
【权利要求】
1.一种与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于:以RBSDV 感病品种/特特勃杂交后代F2群体为作图群体，通过简单重复序列标记(SSR)数据和抗病性鉴定结果间的连锁分析，获得3号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL连锁的分子标记 RM5626 和 RM7097。
2.按照权利I所获得一种与RBSDV感病品种/特特勃组合中水稻黑条矮缩病抗性主效 QTL连锁的分子标记的应用，其特征在于:以特特勃及其衍生品种(系)与R BSDV感病品种杂交后代的单个水稻植株为对象，通过检测其分子标记RM5626和RM7097的带型数据，可以判断该植株是否具有水稻黑条矮缩病抗性。
【文档编号】C12Q1/68GK103555718SQ201310576578
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】周彤, 杜琳琳, 周益军, 王英, 王跞姣, 兰莹, 孙枫 申请人:江苏省农业科学院