一种胆盐水解酶基因bsh及其重组原核表达载体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种胆盐水解酶基因BSH及其重组原核表达载体，该胆盐水解酶基因BSH保藏号为CGMCC?NO.6540，来自屎肠球菌含有的两个BSH基因BSH1、BSH2，经比对两个序列相似性为68.10％。所述重组原核表达载体是在pET-32a载体的多克隆位点中插入屎肠球菌胆盐水解酶基因BSH1、BSH2而获得；所述pET-32a载体表达量高，并带有Trx.Tag，His.Tag，S.Tag。本发明提供的胆盐水解酶基因在E.coliBL21(DE3)宿主菌中进行了高效表达，也为研究出具有高效降解胆固醇的基因工程菌株提供了理论支持，同时为BSH基因在不同表达系统中的高效表达和表达调控的研究奠定基础。
【专利说明】-种胆盐水解酶基因 BSH及其重组原核表达载体 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于基因【技术领域】，尤其涉及一种胆盐水解酶基因 BSH及其重组原核表达 载体。 【背景技术】
[0002] 胆盐水解酶（bile salt hydrolase, BSH)是微生物生长、繁殖过程中产生的一种 代谢产物。该酶能水解结合态牛磺酸胆盐和甘氨酸胆盐，最终将其转变成氨基酸和游离胆 酸，具有降低血清胆固醇的功能（KOCIUBINSKI G, PEREZ P, ANTONI G. Screening of Bile Resistance and Bile Peicipitation in LacticAcid Bacteria and Bifidobacteria[J]. Food Prot, 1999, 62:905 ?912 ;Coleman JP, Hudson LL. Cloning and characterization of a conjugated bile acid hydrolase gene fromClostridium perfringens. Appl. Environ. Microbiol, 1995,61:2518?2520. )BSH通常为胞内酶，微酸环境下的最适pH 值一般在5和6之间，对氧气不敏感，该酶已经从多种微生物中得到了分离和鉴定(李贵 节.降胆固醇乳杆菌的综合评价及胆盐水解酶活性研究.上海：上海交通大学.2008, 2;牛 治霞，刘恩梅.益生菌中胆盐水解酶（BSHs)研究进展.中国乳品工业，2007, 35 (9) : 35? 40 ；BinderH. J, B. Filburn, M. Floch. Bileacidinhibition of intestinal anaerobic organism.Am. J. Clin. Nutr, 1975,28(10) :119 ?125 ;KIM G B, LEE B H. Biochemical and Molecular Insights Into Bile Salt Hydrolase in the Gastrointestinal Microflora a Review Asian-Aust[J].AnitaSci, 2005, 18:1505 ?1512)。目前，发现的产胆盐水解酶 的菌株都是革兰氏阳性菌，其中包括部分的益生菌株，如：乳酸菌、双歧杆菌等；另外一部 分则是与宿主以共生的形式寄生于肠道中的菌株，如：类杆菌、梭状芽孢杆菌、肠球菌等，通 常生长在无胆盐的环境中菌株产生的BSH酶均不具有活性。
[0003] 迄今为止有关胆盐水解酶的研究报道相对较少，国内的研究主要集中在降胆固醇 机理、高产BSH酶优良菌株的筛选、BSH酶的纯化等方面；而国外也则正在进行有关BSH酶 微生物分子生物学等方面的研究，但还至今未见有突破性进展。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明实施例的目的在于提供一种胆盐水解酶基因 BSH及其重组 原核表达载体。
[0005] 本发明实施例是这样实现的，一种胆盐水解酶基因 BSH，该胆盐水解酶基因 BSH保 藏号为CGMCC N 〇 . 6540,来自屎肠球菌含有的两个BSH基因 BSH1、BSH2,经比对两个序列 相似性为68. 10%。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种含有上述屎肠球菌胆盐水解酶基因 BSHUBSH2 的重组原核高效表达载体，其特征在于：所述重组原核表达载体是在pET_32a载体的多克 隆位点中插入屎肠球菌胆盐水解酶基因 BSH1、BSH2而获得；所述pET-32a载体表达量高，并 带有 Trx. Tag, His. Tag, S. Tag。
[0007] 本发明提供了一种屎肠球菌胆盐水解酶基因 BSH的两个不同的序列，分别命名 为基因 BSHI、BSH2,经比对两个序列相似性为68. 10%，具有如SEQIDNo. 1所示的核苷酸 序列，还公开了含有该基因的重组原核表达载体，实验结果表明胆盐水解酶基因在E.coli BL21(DE3)宿主菌中进行了高效表达，也为研究出具有高效降解胆固醇的基因工程菌株提 供了理论支持，同时为BSH基因在不同表达系统中的高效表达和表达调控的研究奠定基 础。 【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1为基因 BSH1温度梯度PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定，1泳道 为 DL2,000DNA Marker，2 ?9 泳道依次为 65 °C，64.2 °C，63 °C，61. 1 °C，58.7 °C， 56. 9°C，55. 7°C，55°C温度梯度扩增产物；
[0009] 图2为基因 BSH2温度梯度PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定，1泳道 为 DL2,000DNA Marker，2 ?9 泳道依次为 65 °C，64.2 °C，63 °C，61. 1 °C，58.7 °C， 56. 9°C，55. 7°C，55°C温度梯度扩增产物；
[0010] 图3为阳性克隆PMD19T-BSH的PCR、酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定，1泳道为 DL2, 000DNA Marker，2泳道为基因 BSH1回收产物(对照)，3-5泳道为pMD19T-BSHl菌落 PCR鉴定，6?8泳道为pMD19T-BSHl的EcoRI, Hindlll双酶切鉴定，9泳道为DL2, 000DNA Marker, 10泳道为基因 BSH2回收产物(对照)，11?13泳道为pMD19T-BSH2菌落PCR鉴定， 14?16泳道为pMD19T-BSH2的BamHI, Hindlll双酶切鉴定；
[0011] 图4为阳性克隆pET-32a-BSH的琼脂糖凝胶电泳鉴定，1泳道为DL2, 000DNA Marker，2?6泳道为pET-32a-BSHl EcoRI, Hindlll双酶切鉴定，7泳道为BSH1回收产物 (对照），8 泳道为 DL2, 000DNA Marker，9 ?13 泳道为 pET-32a-BSH2 的 BamHI, Hindlll 双酶 切鉴定，14泳道为BSH2回收产物(对照）；
[0012] 图5为BL21 (DE3)-pET-32a-BSHl表达产物SDS-PAGE分析，1泳道为蛋白 maker，2泳道为BL21 (DE3) -pET-32aIPTG诱导（阴性对照)，3泳道为未经IPTG诱导的 BL21 (DE3) -pET-32a-BSHl 重组菌（阴性对照），4 ?8 泳道为 BL21 (DE3) -pET-32a-BSHl IPTG 诱导2, 4, 6, 8, 10h结果；
[0013] 图6为为BL21 (DE3) -pET-32a-BSH2表达产物SDS-PAGE分析，1泳道为蛋白 maker，2泳道为BL21 (DE3) -pET-32aIPTG诱导（阴性对照），3泳道为未经IPTG诱导的 BL21 (DE3)-pET-32a-BSH2 重组菌（阴性对照），4 ?8 泳道为 BL21 (DE3)-pET-32a-BSH2IPTG 诱导2, 4, 6, 8, 10h结果；
[0014] 图7为基因 BSH1原核表达蛋白的Western-blot检测结果；
[0015] 图8为基因 BSH2原核表达蛋白的Western-blot检测结果；
[0016] 图9为融合蛋白纯化后SDS-PAGE检测，1泳道为蛋白maker，2泳道为 BL21 (DE3) -pET-32a-BSHl 表达产物纯化结果，3 泳道为 BL21 (DE3) -pET-32a-BSHl 表 达产物未纯化对照，4泳道为BL21 (DE3) -pET-32a-BSH2表达产物纯化结果，5泳道为 BL21 (DE3)-pET-32a-BSH2表达产物未纯化对照；
[0017] 图 10 为纯化产物的 Western-blot 检测；1 为 BL21 (DE3)-pET-32a-BSHl 纯化结果 检测，2为BL21 (DE3) -pET-32a-BSH2纯化结果检测。 【具体实施方式】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0019] 以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0020] 优选实施例中使用的材料：屎肠球菌筛选保存；高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA聚 合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、pMD19-T载体、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、 蛋白质分子量标准及蛋白质双色预染Marker、DNA Marker III购自天根生化科技（北京） 有限公司；氨节青霉素（Ampicillin，Amp)和卡拉霉素（Kanamycin，Kan)为Sigma公司产 品；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国 生物技术有限责任公司；大肠杆菌JM109、BL21(DE3)由本实验室保存。
[0021] 本发明在前期研究的基础上，根据网上已公布BSH基因序列设计引物进行PCR扩 ±曾，克隆得到两个BSH基因，经比对，两序列相似性为68. 10%。并分别对两个基因进行了原 核表达，实现了该基因的商效表达。
[0022] 一、BSH基因的克隆与测序
[0023] 根据GenBank已公布的BSH基因序列，利用Primer5. 0和01igo6. 0软件设计分别 设计了特异引物:h游引物 BSH1F :5' -CCGGAATTCCGGATGTGTACATCCATTGTTTATG-3' (SEQ ID No. 2)，下划线部分为 EcoRI 酶切位点；下游引物 BSH1R :5'-CCCAAGCTTGGGTTATTTGTTTAAAT AATGTATTTGT-3'（SEQ ID No. 3)，下划线部分为 Hind III 酶切位点；上游引物 BSH2F :5'-C GCGGATCCGCGATGTGTACGTCTATTACTTA
[0024] TGTAAC-3'（SEQIDNo. 2)，下划线部分为 BamHI 酶切位点；下游引物 BSH2R :5' -CC CAAGCTTGGGCTAATTTATATATTTAATTTGTTGTTT-3, (SEQIDNo. 3)，下划线部分为 Hind III 酶切 位点。参照CTAB菌基因组DNA提取方法提取屎肠球菌基因组DNA。以基因组DNA为模板， 用特异性引物进行PCR扩增，扩增体系及条件如下：PCR反应条件：95°C预变性3min，95°C 变性30s，55°C _65°C退火30s，72°C延伸lmin，循环数35,72°C充分延伸10min。PCR反应体 系为25yL:上下游混合引物lyL，模板lyL，Mix (加酶）12.5yL，ddH2010.5yL。采用温 度梯度PCR方法扩增扩增结果均在约1000bp处呈单一特异性条带，与GenBank报道的基因 BSH大小相符，如图1、图2所示。
[0025] 将PCR产物进行1. 0%(g/mL)琼脂糖凝胶电泳检测，再按照DNA凝胶回收试剂盒说 明书进行切胶回收纯化；纯化的DNA片段与pMD19-T载体在T4DNA连接酶的作用下于16°C 连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳 性克隆，提取质粒，酶切鉴定片段大小后测序，得重组载体PMD19T-BSH1、pMD19T-BSH2。
[0026] 重组载体pMD19T-BSHl、pMD19T-BSH2的菌落PCR鉴定及酶切鉴定结果如图3所 示，可见 PMD19T-BSH1 和 pMD19T-BSH2 用 PCR 鉴定及 EcoRI/Hindlll、BamHI/Hindlll 双酶 切均可得到约l〇〇〇bp的目的片段，与预期结果相符，证实目的片段已连入pMD19-T载体且 为正向连接。
[0027] 测序结果显示，胆盐水解酶基因 BSH1全长为978bp，BSH2全长975bp，分别编码 325、324个氨基酸，经比对BSH1、BSH2编码的氨基酸序列相似性为67. 69%。
[0028] 二、BSH基因重组原核表达载体的构建
[〇〇29] 根据原核表达载体pET_32a表达量高，并带有Trx. Tag，His. Tag，S. Tag，有利于 表达产物的纯化等特点，在其多克隆位点处分别通过限制性内切酶EC〇RI/HindIII、BamHI/ Hindlll引入胆盐水解酶基因 BSH1、BSH2,实现基因的重组原核表达。
[0030] 将含有基因 BSH1、BSH2 的重组载体用 pMD19T-BSHl、pMD19T-BSH2 分别用 EcoRI/ Hindlll、BamHI/Hindlll 双酶切，回收基因 BSH1、BSH2 片段，再与同样经 EcoRI/Hindlll、 BamHI/Hindlll双酶切的pET-32a载体在T4DNA连接酶的作用下于16°C连接过夜，连接产 物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有卡拉霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒， PCR和酶切鉴定，即得基因 BSH1、BSH2重组原核表达载体pET-32a-BSHl、pET-32a-BSH2。随 后将 pET-32a-BSHl、pET-32a-BSH2 转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，-80°C保存备用。
[0031] 基因 BSH1、BSH2重组原核表达载体pET-32a-BSHl、pET-32a-BSH2的PCR鉴定和酶 切鉴定结果如图4所示，结果显示目的片段已经连入pET-32a载体中，并将重组子进行了测 序鉴定，保证连入片段的准确性。测序结果与前期测序结果完全相同，可用于表达。
[0032] 三、重组蛋白的诱导表达及鉴定
[0033] 设空载体pET-32a转化BL21 (DE3) IPTG诱导组、重组菌未诱导组作为阴性对照。将 经鉴定含有重组质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)接种于5mLLB (含氨苄青霉素)中，37°C培养过 夜，按1:100的比例转接到新鲜的LB(含氨苄青霉素)中，37°C培养2-3h至0D600=0. 5-0. 8之 间，加入IPTG至终浓度ImM于30°C继续培养，摸索最佳诱导培养时间，收集菌体。SDS-PAGE 检测蛋白表达情况，结果如图5、图6所示。预测N端融合了表达载体标签的重组蛋白大小 约为45KD。比较对照组与重组菌诱导组可见在预期位置有一带，且随诱导时间的加长诱导 产物明显增加，且6h为最佳诱导时间。文献报道，融合表达有时会产生两种表达产物，一种 是融合表达目的蛋白，一种是断裂的目的蛋白，就是丢失了融合部分的目的蛋白。因此由检 测结果推断目标基因是以融合蛋白的形式表达，没有断裂的目的蛋白表达。
[0034] 重组菌经IPTG诱导培养后，将培养物4°C下5000r/min离心lOmin，收集粗酶液。 为了确定目的蛋白质的表达形式，采用超声波并结合溶菌酶破碎细胞的方法分别对表达菌 体的裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。结果表明，目的蛋白主要分布在裂解沉淀中，表 明表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在。
[0035] 融合蛋白Western blot检测：诱导后菌体蛋白和纯化后的融合蛋白经
[0036] 120g/L的分离胶SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上膜上，进行
[0037] Western blot印迹分析。一抗为鼠抗人Anti_6XHis( 1:1000稀释)，二抗为辣根 过氧化物酶偶联的羊抗鼠 IgG抗体（1:5000稀释)，采用ECL化学发光法显影，曝光后在预 期大小处可见清晰条带，分子量约45KD出现黑色条带，与预期的所要表达的6 XHis融合蛋 白分子量大小相符，表明目的蛋白得到正确的表达。Western-blot检测如图7、图8所示。
[0038] 融合蛋白的纯化：按QIAGEN公司的Ni-NTAAgarose包涵体纯化步骤进行，纯化结 果进行SDS-PAGE检测，并进行Western-blot检测，在正确位置检测到目标蛋白，大小一 致。检测结果如图9、图10。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发 明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。 [0039]
【权利要求】
1. 一种胆盐水解酶基因 BSH，其特征在于，该胆盐水解酶基因 BSH保藏号为CGMCC N 〇 .6540,来自屎肠球菌含有的两个BSH基因 BSH1、BSH2,经比对两个序列相似性为 68. 10%。
2. -种含有权利要求1所述屎肠球菌胆盐水解酶基因 BSHUBSH2的重组原核高效表达 载体，其特征在于：所述重组原核表达载体是在pET-32a载体的多克隆位点中插入屎肠球 菌胆盐水解酶基因 BSH1、BSH2而获得；所述pET-32a载体表达量高，并带有Trx. Tag，His. Tag, S. Tag。
【文档编号】C12R1/01GK104087606SQ201310576384
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年2月1日
【发明者】李晓辉, 包凌霞 申请人:李晓辉