一种红细胞裂解液及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种红细胞裂解液，所述裂解液包含以下组分：4.5～5.5mmol/L的氯化钠、0.8～1.2%（v/v）的曲拉通100、300～340mmol/L的葡萄糖和0.008～0.012mol/L的三羟甲基氨基甲烷。使用本发明中提供的红细胞裂解液，可有效裂解全血样本中的红细胞，分离并富集血液中的白细胞，有利于对白细胞的后续核酸提取操作，可以获得全血中白细胞DNA和白细胞内病毒的DNA。
【专利说明】一种红细胞裂解液及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种红细胞裂解液及其应用。
【背景技术】
[0002]红细胞也称红血球，在常规化验英文常缩写成RBC，是血液中数量最多的一种血细胞，正常成人每微升血液中红细胞数的平均值，男性约400万~500万个，女性约350万~450万个。同时红细胞也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介，另外还具有免疫功能。哺乳动物成熟的红细胞是无核的，这意味着它们失去了 DNA。但血液红细胞中含量为男性约120~150g/L和女性约105~135g/L的血红蛋白对PCR扩增有明显的抑制作用。故在对血液样本进行核酸提取时，首先需要去除血液样本中的红细胞。
[0003]目前，使用红细胞裂解液是一种去除红细胞最简便易行的方法，即用红细胞裂解液改变红细胞的渗透压，造成红细胞胀大破裂，而白细胞因其细胞膜的离子转运通道不同而不受影响，从而达到既不损伤白细胞又能充分的去除红细胞，并能分离富集血液中的白细胞的作用。经红细胞裂解液裂解得到的白细胞中不含红细胞，可进一步用于核酸的分离和提取等。
[0004]国内已出现多种红细胞裂解液，可以应用于全血的核酸提取。例如，CNl 635134A公开的红细胞裂解液由下列物质组成:10mmol/L Tr1-HCl, 5mmol/L MgCl2, lOmmol/LNaCl和超纯水I升。CN102676498A公开的红细胞裂解液含有碳酸氢钾12mmol/L，氯化铵155mmol/L，乙二胺四乙酸(EDT A)0.15mmol/L。CN102747035A公开的红细胞裂解液由7.47g/L的氯化铵+2.6g/L的三羟甲基氨基甲烷组成。然而，现有的红细胞裂解液从全血中分离纯化白细胞的方法存在很多缺点，例如:1)样本处理耗时长，红细胞裂解效果不佳，裂解不完全；
2)试剂体系不稳定，容易变质失效；3)处理步骤多，需要多次开盖换管、离心；4)白细胞获得率低，纯度低；上述缺点的存在势必会因红细胞裂解液的选择而导致对后续的核酸提取效果造成影响。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于解决现有红细胞裂解液的缺陷，提供一种操作快速简单、提取效率高、使用安全、制造成本低的人类血液白细胞分离试剂(红细胞裂解液)及其制备方法，应用该试剂分离得到的白细胞可以进行后续的核酸提取。
[0006]因此，本发明提供一种红细胞裂解液，所述裂解液包含以下组分:4.5~5.5mmol/L的氯化钠、0.8~1.2% (v/v)的曲拉通100、300~340mmol/L的葡萄糖和0.008~
0.012mol/L的三羟甲基氨基甲烷。
[0007]优选的，所述氯化钠的浓度为5mmol/L，所述曲拉通100的浓度为1.0%(ν/ν)，所述葡萄糖的浓度为320mmol/L，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.01Omol/L，余量为无菌水。
[0008]本发明还提供一种如上所述红细胞裂解液的制备方法，包括先在无菌水中加入上述四种组分，然后加无菌水定容至所需体积，充分混匀溶解；再使用氢氧化钠或盐酸溶液调节所得溶液的PH值至7.8~8.6，优选8.0~8.4，更优选8.2 ;最后灭菌2~30分钟，优选高压灭菌5~15分钟，即得到所述红细胞裂解液。
[0009]本发明还提供一种如上所述的红细胞裂解液或如上所述方法制备得到的红细胞裂解液在裂解全血样本中的红细胞并分离得到白细胞中的应用。
[0010]优选地，所述应用包括以下步骤:1)向全血中加入红细胞裂解液，充分震荡混匀，得到红色混合物；2)对上述混合物进行离心分离，去上清，留下的白色沉淀物即为白细胞。优选步骤I)中全血与红细胞裂解液的体积比为1:1~5。优选步骤2)中离心分离的转速为10000~13000转/分钟，离心分离的时间为I~3分钟。
[0011]使用本发明中提供的红细胞裂解液，可有效裂解全血样本中的红细胞，分离并富集血液中的白细胞，有利于对白细胞的后续核酸提取操作，可以获得全血中白细胞DNA和白细胞内病毒的DNA。本发明裂解红细胞的操作简单快速，且裂解完全；获得的白细胞纯度高，利于核酸提取和PCR扩增等下游实验；另外，本发明提供的红细胞裂解液制造成本低廉，无需使用特殊物料或仪器，仅需离心机和移液器，且使用安全。
【具体实施方式】
[0012]实施例1 [0013]1、红细胞裂解液及其配制方法:
[0014]称取氯化钠0.1461g，加入体积为5ml的曲拉通溶液，加入葡萄糖28.8256g，加入三羟甲基氨基甲烷0.6075g，加入无菌水定容至500ml，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节PH值至8.2。高压灭菌10分钟。
[0015]2、红细胞裂解液的应用:
[0016]红细胞裂解液的应用对象为100例全血样本。应用的具体操作步骤为:向每例200微升全血中加入800微升红细胞裂解液，充分震荡混匀10秒，得到红色透明清亮混合物；对上述混合物进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心分离时间为I分钟，去上清，留白色沉淀物。所得白色沉淀物即为白细胞，可用于核酸提取。
[0017]3、对红细胞裂解液应用的效果检测和评价:
[0018]使用β -Actin管家基因检测试剂对上述白细胞进行核酸提取和检测。结果是，采用本发明中的红细胞裂解液提取100例全血样本DNA后检测其中的β-Actin管家基因，100例均有扩增曲线，说明本发明提供的红细胞裂解液能有效富集全血样本中的有核白细胞。
[0019]实施例2
[0020]1、本实施例中的红细胞裂解液及其配制方法同实施例1。
[0021]2、红细胞裂解液的应用:
[0022]红细胞裂解液的应用对象为含EB病毒DNA浓度为I X IO4IU的全血样本。应用的具体操作步骤为:向200微升全血中加入800微升红细胞裂解液，充分震荡混匀10秒，得到红色透明清亮混合物；对上述混合物进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心分离时间为I分钟，去上清，留白色沉淀物。所得白色沉淀物即为白细胞，可用于核酸提取。
[0023]3、对红细胞裂解液应用的效果检测和评价:
[0024]使用商售的EB病毒核酸定量检测试剂盒对上述白细胞进行核酸提取和检测。结果是，采用本发明中的红细胞裂解液6次重复提取全血样本DNA后检测其中的浓度为IXlO4IU的EB病毒DNA，从扩增曲线看，基线平整，指数区明显，同一样本6次检测的Ct值的变异系数〈2%，浓度变异系数〈50%，重复性好。说明本发明提供的红细胞裂解液能够有效收集到白细胞中的病毒DNA。
[0025]对比例
[0026]使用CN102747036A中公开的红细胞裂解液处理全血样本。
[0027]1、红细胞裂解液及其配制方法:
[0028]原液一号:10g/L的葡萄糖、0.6g/L 的磷酸二氢钠、3.58g/L 的 Na2HPO4.7H20、0.1g/L酚红溶液；原液二号:1.86g/L的CaCl2.H20,4.0g/L氯化钾、80g/L氯化钠、1.04g/L氯化镁和2.0g/LMgS04.7H20。红细胞裂解液的应用液1# =IOml原液一号、IOml原液二号，加双蒸水定容至100ml。应用液2#:20ml原液一号、20ml原液二号，加双蒸水定容至100ml。应用液3#:lml原液一号、Iml原液二号，加双蒸水定容至100ml。
[0029]2、红细胞裂解液的应用:
[0030]红细胞裂解液的应用对象为与实施例1中相同的100例全血样本。应用的具体操作步骤为:向每例100微升全血样本中加入2ml应用液3#’混匀15~20秒；加入2ml应用液2#，混匀15~20秒；加4ml应用液1#，混匀15~20秒；300 X g离心2分钟，弃上清，收集沉淀。所得沉淀物用于核酸提取。
[0031]3、对红细胞裂解液应用的效果检测和评价:
[0032]使用β -Actin管家基因检测试剂对上述沉淀物进行核酸提取和检测。结果是，采用对比例中的红细胞裂解液提取100例全血样本DNA后检测其中的β-Actin管家基因，100例均有扩增曲线。
[0033]但对比例与实施例1中的检测数据对比时发现，对于每一例不同的全血样本，对比例中检测得到β -Actin管家基因的目标曲线Ct值较实施例1中的检测Ct值均靠后，对比例中的Ct值数据一般要比实施例1中的Ct值数据大1-4，且对比例较实施例1样本处理时间长了近I个小时。说明本发明提供的红细胞裂解液富集全血样本中的有核白细胞的能力优于现有技术中公开的红细胞裂解液。另外，本发明操作简单快速，大大节约样本处理时间，且本发明所用试剂的配制更简单。
【权利要求】
1.一种红细胞裂解液，其特征在于，所述裂解液包含以下组分:4.5~5.5mmol/L的氯化钠、0.8 ~1.2% (v/v)的曲拉通 100,300 ~340mmol/L 的葡萄糖和 0.008 ~0.012mol/L的三羟甲基氨基甲烷。
2.根据权利要求1所述的红细胞裂解液，其特征在于，所述氯化钠的浓度为5mmol/L，所述曲拉通100的浓度为1.0%(ν/ν)，所述葡萄糖的浓度为320mmol/L，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.01mol/L，余量为无菌水。
3.—种如权利要求1或2所述红细胞裂解液的制备方法，其特征在于，在无菌水中加入上述四种组分，然后加无菌水定容至所需体积，充分混匀溶解；再使用氢氧化钠或盐酸溶液调节所得溶液的pH值至7.8~8.6，优选8.0~8.4，更优选8.2 ;最后灭菌2~30分钟，优选高压灭菌5~15分钟，即得到所述红细胞裂解液。
4.如权利要求1或2所述的红细胞裂解液或如权利要求3所述方法制备得到的红细胞裂解液在裂解全血样本中的红细胞并分离得到白细胞中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤: 1)向全血中加入红细胞裂解液，充分震荡混匀，得到红色混合物； 2)对上述混合物进行离心分离，去上清，留下的白色沉淀物即为白细胞。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤I)中全血与红细胞裂解液的体积比为1:1~5。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中离心分离的转速为10000~13000转/分钟，离心分离的时间`为I~3分钟。
【文档编号】C12N15/10GK103789298SQ201310746148
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】戴立忠, 唐瑶, 吴康 申请人:湖南圣湘生物科技有限公司