用于敲低vps11的小分子干扰rna、重组载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于敲低VPS11的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒和宿主细胞及其应用，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白VPS11的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。本发明提供的重组慢病毒载体能在宿主细胞内稳定、长期地转录得到VPS11-shRNA；本发明提供的VPS11-shRNA经过宿主细胞加工后可生成能沉默VPS11表达的小分子干扰RNA；本发明提供的小分子干扰RNA能靶向突触融合蛋白VPS11的mRNA，并导致所述mRNA降解，并导致基因沉默效应，降低VPS11的表达水平。
【专利说明】用于敲低VPS11的小分子干扰RNA、重组载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学、基因工程技术以及生物医药领域，具体涉及一种用于敲低VPSll的小分子干扰RNA、重组载体及其应用。
【背景技术】
[0002]VPSll蛋白在细胞囊泡运输过程中起着极其重要的作用，细胞囊泡运输又是细胞内及细胞间的物质运输的主要途径之一，所以研究VPSll蛋白在细胞囊泡运输中的信号通路对研究各项细胞、组织、器官及生物体生命活动都有重要意义的，而研究VPSll在信号通路中的作用有必要提供一种敲低VPSll的表达水平的方法以及稳定敲低VPSll的表达水平的细胞系。
[0003]RNA干扰(RNA interference, RNAi)可诱发的基因沉默。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种降低目标蛋白表达水平的有效途径。
[0004]因此，有必要提供一种采用RNA干扰技术对VPSll进行基因沉默的方法以及一种稳定敲低VPSll的表达水平的细胞系。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，本发明提供了一种用于敲低VPSll的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒和宿主细胞及应用。
[0006]本发明提供的小分子干扰RNA能直接特异性靶向VPSll的mRNA并导致mRNA降解，产生基因沉默效应；本发明提供的shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒能通过促使宿主细胞中VPSll的mRNA降解间接地沉默VPSll的表达，降低VPSll的表达水平。
[0007]本发明涉及的英文缩写及其中文释义如下:
[0008]VPSll:所述 VPSll 蛋白的 Genebank 登录号为 ΝΜ_021729.4 ；
[0009]mRNA:信使 RNA ；siRNA:小分子干扰 RNA ；shRNA:短发夹 RNA ；
[0010]VPSll-shRNA:具有靶向VPSll蛋白的信使RNA的短发夹RNA ；
[0011]第一方面，本发明提供了一种小分子干扰RNA，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白VPSll的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。
[0012]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。
[0013]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0014]第二方面，本发明提供了一种shRNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
[0015]优选地，本发明第二方面提供了的一种shRNA，为具有茎环结构的单链RNA，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，其中，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白VPSll的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。
[0016]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。[0017]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0018]第三方面，本发明提供了一种shRNA的编码DNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
[0019]优选地，本发明第三方面提供了的一种shRNA的编码DNA，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，其中，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白VPSll的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。
[0020]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。
[0021]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0022]优选地，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID NO: 3或4所示的核苷酸序列。
[0023]具体地，在此优选条件下，所述SEQ ID NO:3 (5，_3，)为:
[0024]GCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAAACAGC TTTTT ；
[0025]所述SEQ ID NO:4 (5，_3，)为:
[0026]AAAAAGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAA ACAGC。
[0027]进一步优选地，所述SEQ ID N0:3和4所示的核苷酸序列的5’端或3’端具有酶切位点。
[0028]更进一步优选地，所述SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位点分别为 Age I 和 EcoR I。
[0029]在此优选条件下，所述编码shRNA的DNA具有如SEQ ID N0:5或6所示的核苷酸序列。
[0030]具体地，所述SEQ ID NO:5 (5，_3，)为:
[0031 ] CCGG GCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAAACAG CTTTTT O
[0032]所述SEQ ID NO:6 (5，_3，)为:
[0033]AATTCAAAAAGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTT AAACAGC0
[0034]其中，双划线标识的碱基处为酶切位点，波浪线表示的序列为SiRNA的正义链，单划线标识的序列为siRNA的反义链，斜体标识的序列为形成shRNA发卡时的环区序列。
[0035]优选地，所述编码shRNA的DNA还包括RNA聚合酶III启动子。
[0036]进一步优选地，所述RNA聚合酶III启动子为人源的U6启动子或人源的Hl启动子。
[0037]进一步优选地，所述RNA聚合酶III启动子为鼠源的U6启动子或鼠源的Hl启动子。
[0038]第四方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体为在所述重组载体为在pLK0.1质粒的多克隆位点、pEN-hHlc质粒的多克隆位点或pDSL-hpUGIP质粒的重组位点插入如第三方面所述的编码shRNA的DNA得到的重组载体。
[0039]优选地，本发明第四方面提供了的一种重组载体，所述重组载体为在所述重组载体为在pLK0.1质粒的多克隆位点、pEN-hHlc质粒的多克隆位点或pDSL-hpUGIP质粒的重组位点插入编码shRNA的DNA得到的重组载体，其中，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，其中，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白VPSll的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。
[0040]优选地，所述pLK0.1质粒的多克隆位点为Age I和EcoR I酶切位点。[0041 ] 优选地，所述pEN-hHlc质粒的多克隆位点为BamHI和XhoI酶切位点。
[0042]优选地，所述pDSL-hpUGIP质粒的重组位点为attRl和attR2，其中，attRl位于pDSL-hpUGIP 质粒的 2614 ~2738bp 位点，attR2 位于 pDSL-hpUGIP 质粒的 4194 ~4318bp位点。
[0043]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。
[0044]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0045]优选地，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID NO: 3或4所示的核苷酸序列。
[0046]具体地，在此优选条件下，所述SEQ ID NO:3 (5，_3，)为:
[0047]GCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAAACAGC TTTTT ；
[0048]所述SEQ ID NO:4 (5，_3，)为:
[0049]AAAAAGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAA ACAGC。
[0050]进一步优选地，所述SEQ ID N0:3和4所示的核苷酸序列的5’端或3’端具有酶切位点。
[0051]更进一步优选地，所述SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位点分别为 Age I 和 EcoR I。
[0052]在此优选条件下，所述编码shRNA的DNA具有如SEQ ID N0:5或6所示的核苷酸序列。
[0053]具体地，所述SEQ ID NO:5 (5，_3，)为:
[0054]CCGGGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAAA CAGCTTTTTG ；
[0055]所述SEQ ID NO:6 (5，_3，)为:
[0056]AATTCAAAAAGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTT CTTAAACAGC。
[0057]在此优选条件下，将目的基因VPSll-shRNA插入到慢病毒pLK0.1质粒的Age I和EcoR I 位点，得到 pLK0.1-VPS11-shRNA 载体。
[0058]优选地，所述编码shRNA的DNA还包括RNA聚合酶III启动子。
[0059]进一步优选地,所述RNA聚合酶III启动子为人源的U6启动子或人源的Hl启动子。
[0060]进一步优选地，所述RNA聚合酶III启动子为鼠源的U6启动子或鼠源的Hl启动子。
[0061]本发明构建的pLK0.1-VPSlΙ-shRNA慢病毒载体具有很高的感染效率以及转录效率，载体上编码shRNA的DNA基因片段能通过重组作用插入宿主基因组，从而持续、稳定地沉默VPSll的表达。
[0062]第五方面，本发明提供了一种重组慢病毒，是如第四方面所述重组载体与包膜载体psPAX2和包装载体pMD2.G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。
[0063] 优选地，本发明第五方面提供了的一种重组慢病毒，是重组载体与包膜载体psPAX2和包装载体pMD2.G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒，其中，所述重组载体为在pLK0.1质粒的多克隆位点插入编码shRNA的DNA得到的重组载体，其中，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白VPSll的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。
[0064]优选地，所述pLK0.1质粒的多克隆位点为Age I和EcoR I酶切位点。[0065]优选地，所述pEN-hHlc质粒的多克隆位点为BamHI和XhoI酶切位点。
[0066]优选地，所述pDSL-hpUGIP质粒的重组位点为为attRl和attR2，其中，attRl位于pDSL-hpUGIP 质粒的 2614 ~2738bp 位点，attR2 位于 pDSL-hpUGIP 质粒的 4194 ~4318bp位点。
[0067]优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21~27bp。
[0068]优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0069]优选地，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID NO: 3或4所示的核苷酸序列。
[0070]具体地，在此优选条件下，所述SEQ ID NO:3 (5，_3，)为: [0071]GCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAAACAGC TTTTT ；
[0072]所述SEQ ID NO:4 (5，_3，)为:
[0073]AAAAAGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAA ACAGC。
[0074]进一步优选地，所述SEQ ID N0:3和4所示的核苷酸序列的5’端或3’端具有酶切位点。
[0075]更进一步优选地，所述SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位点分别为 Age I 和 EcoR I。
[0076]在此优选条件下，所述编码shRNA的DNA具有如SEQ ID N0:5或6所示的核苷酸序列。
[0077]具体地，所述SEQ ID NO:5 (5，_3，)为:
[0078]CCGGGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAAA CAGCTTTTTG ；
[0079]所述SEQ ID NO:6 (5，_3，)为:
[0080]AATTCAAAAAGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTT CTTAAACAGC。
[0081]在此优选条件下，将目的基因VPSll-shRNA插入到慢病毒pLK0.1质粒的Age I和EcoR I 位点，得到 pLK0.1-VPS11-shRNA 载体。
[0082]优选地，所述编码shRNA的DNA还包括RNA聚合酶III启动子。
[0083]进一步优选地,所述RNA聚合酶III启动子为人源的U6启动子或人源的Hl启动子。
[0084]进一步优选地，所述RNA聚合酶III启动子为鼠源的U6启动子或鼠源的Hl启动子。
[0085]优选地，将本发明提供的pLK0.1-VPSl Ι-shRNA慢病毒表达载体和包装载体PSPAX2以及包膜载体pMD2.G转染293T细胞进行慢病毒包装，即可得到所述重组慢病毒。
[0086]本发明通过将编码VPSll-shRNA的DNA构建到慢病毒载体的多克隆位点之间或重组位点之间，得到重组慢病毒表达载体后，通过转染细胞、筛选稳定表达细胞系，可构建得到稳定表达的细胞系，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于对VPSll的RNA干扰研究。
[0087]此外，本发明提供的慢病毒载体还可连同慢病毒包装质粒一起侵染宿主细胞后，得到有活性的能够转录VPSll-shRNA的重组慢病毒。所述重组慢病毒侵染宿主细胞后，能将编码VPSlΙ-shRNA的基因整合到宿主细胞基因组，有助于编码VPSlΙ-shRNA的基因稳定、长期地在宿主细胞内进行转录，从而得到小分子干扰RNA，对VPSll的mRNA进行降解，并导致基因沉默效应，降低VPSll的表达水平。[0088]本发明提供的重组慢病毒不仅具有很高的感染效率，还具有更广泛的宿主范围，能侵染神经元、肌细胞、肝细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体的免疫反应，应用范围十分广泛。
[0089]第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，包括如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体和如第五方面所述的重组慢病毒中的至少一种。
[0090]优选地，所述宿主细胞为293T细胞或Hela细胞。
[0091]优选地，所述宿主细胞为稳定敲低VPSll的表达水平的细胞系。
[0092]进一步优选地，所述宿主细胞为稳定敲低VPSll的表达水平的Hela细胞系。
[0093]第七方面，本发明提供了一种如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体或如第五方面所述的重组慢病毒在制备抑制突触融合蛋白VPSll基因表达的药物中的应用。
[0094]本发明提供的所述小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒或宿主细胞及其应用具有如下有益效果:
[0095]本发明提供的编码shRNA的DNA构建到慢病毒载体的多克隆序列位点之间或重组位点之间可得到重组慢病毒载体，该重组慢病毒载体转染宿主细胞后，或连同慢病毒包装质粒一起侵染宿主细胞后，能将编码VPSll-shRNA的基因整合到宿主细胞基因组，有助于编码VPSll-shRNA的基因稳定、长期地在宿主细胞内进行转录得到VPSll-shRN ；
[0096]本发明提供的VPSll-shRNA经过宿主细胞加工后可生成能沉默VPSll表达的小分子干扰RNA ；
[0097]本发明提供的小分子干扰RNA能靶向突触融合蛋白VPSll的mRNA，并导致所述mRNA降解，并导致基因沉默效应，降低VPSll的表达水平。
[0098]综上，本发明为降低VPSll的表达水平提供了一种有效的RNA干扰方案，该方案优选为采用本发明提供的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒或宿主细胞进行RNA干扰。
【专利附图】
【附图说明】
[0099]图1为本发明实施例采用的的pLK0.1载体的质粒图谱；
[0100]图2为本发明实施例4提供的Hela细胞VPSll的mRNA的RT-PCR检测结果；
[0101]图3为本发明实施例4提供的Hela细胞VPSll表达量的western blot检测结果。
【具体实施方式】
[0102]以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。 [0103]下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual K Sambrookj J., Russell, David W., MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。[0104]本发明采用的pLK0.1载体购自Open Biosystems公司，pLK0.1载体的质粒图谱分别如图1所示；oligo dT、各种限制性内切酶和Taq酶均购自TaKaRa公司，T4DNA连接酶购自NEB公司，胶回收试剂盒和质粒少量抽提试剂盒购自OMEGA公司，质粒大量抽提试剂盒购自Nucleo Bond公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自HyClone公司；转染试剂Magetran购自Origene公司；倒置显微镜为Olympus产品，荧光倒置显微镜为Nikon公司产品。
[0105]本发明实施例的Hela细胞培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。
[0106]若无特别说明，本发明采用的其他试剂均为市售商品。
[0107]实施例1
[0108]一种制备编码VPSll-shRNA的DNA的方法，包括如下步骤:
[0109]根据GeneBank序列库中已有的人VPSll序列和shRNA设计原则，利用siRNA在线设计工具(http://www.sirnawizard.com/index, php)对人 VPSll 序列的编码 DNA (干涉片段)进行设计，并在NCBI网站对设计的片段进行BLAST验证，保证人的其它基因(VPS11除外)中没有此片段的同源序列，得到如下序列:
[0110]VPSll-shRNA (SEQ ID NO:3) (5，-3，):
[0111]GCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAAACAGC TTTTT ；
[0112] VPSll-shRNA (SEQ ID N0:4) (5’ -3’):
[0113]AAAAAGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAAAC AGC ；
[0114]并分别引入限制性内切酶Age I和EcoR I的酶切位点，合成得到如下VPSll-shRNA的引物序列:
[0115]VPSl 1-shRNA-F (SEQ ID N0:5) (5’-3’):
[0116]CCGG GCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAAA CAGCTTTTT Q；
[0117]VPSl1-shRNA-R (SEQ ID NO:6) (5，-3，):
[0118]AAAAAGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTT AAACAGC ；
[0119]在所述SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6中，下划线部分分别为Age I和EcoR I的酶切位点。
[0120]实施例2
[0121]一种慢病毒重组载体pLK0.1-VPSl Ι-shRNA的构建方法，通过应用DNA亚克隆技术的方式，将合成的干涉片段VPSl1-ShRNA-F和VPSll_shRNA-R进行混合并退火后，通过粘性末端连接到载体pLK0.1的Age I和EcoR I多克隆微点，得到pLK0.1-VPSl 1-shRNA慢病毒重组载体，将得到慢病毒重组载体pLK0.1-VPSl Ι-shRNA进行测序鉴定。
[0122]具体包括以下步骤:
[0123]1、干涉片段退火
[0124]将新合成的成对干涉片段溶解为50uM溶液，分别吸取IOuL于PCR管中混匀后，放入95°C水浴锅lOmin，随即关闭水域自然降温至室温。
[0125]反应体系如下:
[0126]
总体系20 μ I
[0127]
【权利要求】
1.一种小分子干扰RNA，其特征在于:所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白VPSll的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19~27bp。
2.如权利要求1所述的小分子干扰RNA，其特征在于，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 2 所示。
3.一种shRNA，为具有茎环结构的单链RNA，其特征在于，所述shRNA具有如权利要求1或权利要求2所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
4.一种编码shRNA的DNA，其特征在于，所述shRNA具有如权利要求1或权利要求2所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的编码shRNA的DNA，其特征在于，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的编码shRNA的DNA，其特征在于，所述编码shRNA的DNA还包括RNA聚合酶III启动子。
7.—种重组载体，其特征在于，所述重组载体为在pLK0.1质粒的多克隆位点、pEN-hHlc质粒的多克隆位点或pDSL-hpUGIP质粒的重组位点插入如权利要求4~6任一所述的编码shRNA的DNA得到的重组载体。
8.—种重组慢病毒，其特征在于，是如权利要求7的b)所述的重组载体与包膜载体psPAX2和包装载体pMD2.G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。
9.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求3所述的shRNA、如权利要求4所述的编码shRNA的DNA、如权利要求7的b)所述的重组载体和如权利要求8的所述的重组慢病毒中的至少一种。`
10.如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求3所述的shRNA、如权利要求4所述的编码shRNA的DNA、如权利要求7的b)所述的重组载体和如权利要求8的所述的重组慢病毒中的至少一种在制备抑制突触融合蛋白VPSll基因表达的药物中的应用。
【文档编号】C12N5/10GK103695427SQ201310746080
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】杨诗涵, 俞谦, 李红昌 申请人:深圳先进技术研究院