专利名称：一种蒲公英均一多糖及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种蒲公英均一多糖及其制备方法和用途，属于中药技术领域。
背景技术：
蒲公英(Herba Taraxaci )是菊科多年生草本,别名黄花地丁,黄花三七。具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋，用于疔疮肿毒，乳痈，瘰疬，目赤，咽痛，肺痈，肠痈，湿热黄疸，热淋涩痛。现代药理研究表明，蒲公英具有利胆保肝，抗内毒素，抗癌，降血糖，抗凝血，利尿，健脾胃，益生元，广谱抑菌和免疫促进等作用。蒲公英作为药用植物在国内外研究已有很久的历史，蒲公英有丰富的营养价值， 含有蛋白质、脂肪、碳水化合物及维生素等。(许丹等，蒲公英的化学研究，中国中药杂志，2004，29 (3) : 229-230)。迄今为止，已见报道的蒲公英化学成分主要有黄酮类、三萜类、植物甾醇类、香豆素类、长链脂肪族类、倍半萜内酯类、色素类、挥发油、胆碱、こ酰酯类、酚酸类、绿原酸、咖啡酸、有机酸、氨基酸以及矿物质等(袁瑾等，野生植物蒲公英营养成分的研究，氨基酸和生物资源，2006，28 (2) : 22-23)，具体如蒲公英留醇(Taraxasterol)、胆碱(Choline)、菊糖(Inulin)、果胶(Pectin);蒲公英醇(Taraxol)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-香树脂醇(β-Amyrin)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、蒲公英赛醇(taraxerol)、蒲公英素(Taraxacerin)、蒲公英苦素(Taraxacin)和维生素A、B、C等。补体系统是人体重要的免疫防御系统之一。补体系统的正常激活在消灭外来微生物、清除肌体内损伤或死亡的细胞和组织以及維持机体的平衡等生理过程中起着重要作用。然而该系统的非正常激活会引起人体免疫系统的过度反应，导致人体自身正常组织的损伤和炎症反应，是炎症反应的重要介质。研究表明，与补体过度激活相关的疾病涉及类风湿性关节炎、老年性痴呆、急性呼吸窘迫综合征以及系统性红斑狼疮等多种疾病。有报道，重症非典型肺炎(SARS)和由H5N1型病毒感染引起的禽流感，临床上可发现免疫系统的过度反应症状，如ARDS，败血症休克及Reyes综合征等，上述反应症状被人与细胞免疫、体液免疫过度激活有夫。鉴于补体过度激活在引发人类许多危重疾病中的重要作用，因此，对补体系统激活的抑制性治疗具有十分重要的临床意义。天然药物中广泛存在具有抗补体作用的活性成分，国内外已完成部分天然药物如麻黄、人參、杜仲等的筛选，发现自然界中广泛存在的某些多糖、蛋白质、多肽、留类、萜类和生物碱等化学物具有显著的抗补体活性，其中以糖基化蛋白和多聚糖化合物为多。肝素是有糖醛酸和氨基葡萄糖聚合而成的ー个硫酸化多糖，是研究较早、较成熟的补体抑制齐U。但由于肝素具有抗凝血作用，在生物体内需较高浓度才能发挥药效，且副作用大，限制了其临床用途。申请号为200710046222. 7的中国专利文献公开了ー种具有抗补体活性的植物多糖，采用五种多糖的杂多糖，由鱼腥草、野菊花、茵陈、佩兰和草果制备，作用于补体Clq, Clr, Cls, C2、C3、C4、C5、C9组分，且不具有抗凝血作用。申请号为200710044099. 5的中国专利文献公开了ー种自杜仲提取的木制素在制备抗补体药物的用途。申请号为200910201362.6的中国专利文献公开了ー种自苦參提取的黄酮类在制备抗补体药物的用途，所得的黄酮类化合物对补体系统的经典途径和旁路途径均有较强的抑制作用。但至今未见蒲公英及其多糖的抗补体活性的相关研究报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供ー种蒲公英均一多糖及其制备方法和用途，以拓宽蒲公英多糖的应用。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下ー种蒲公英均一多糖，由蒲公英全草经水提醇沉、透析截取分子量大于10000道尔顿的组分，然后经阴离子交换柱层析分离，再经葡聚糖凝胶层析柱纯化而得；所述均一多糖的分子量为I. 6X IO4道尔顿，其单糖组成为D-阿拉伯糖占25. 4wt%、D-葡萄糖占 17. 7wt%、D-半乳糖占44. 5wt%、D-木糖占4. lwt%、D-鼠李糖占3wt%、D_甘露糖占5. 3wt%。一种所述蒲公英均一多糖的制备方法，包括如下步骤a)首先将蒲公英全草用こ醇回流脱脂，然后过滤，挥干药渣中的こ醇；加水浸泡、煎煮提取；合并提取液，浓缩，离心，收集上清液；加入こ醇进行沉析；离心得沉淀，并挥干其中的こ醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量为10000道尔顿的透析袋在水中透析24 72小时；浓缩透析液，冷冻干燥，得蒲公英多糖提取物粗品；b)将上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，离心；将沉淀再加水加热溶解，离心；合并两次离心所得上清液，上样于ニこ胺基こ基(DEAE)阴离子交換柱，依次用蒸馏水、O. 2、
O.5,0. 8、I. Omol/L的NaCl溶液洗脱，收集由I. Omol/L的NaCl溶液洗脱的洗脱液；减压浓缩，然后用截留分子量为3500道尔顿的透析袋进行流水透析24小时；上样于凝胶层析柱，以O. 2mol/L的NaCl溶液为洗脱液，流速I. lmL/min，示差折光检测，蛋白纯化系统在线成像，根据凝胶分离图谱收集均一多糖，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋进行去离子水透析48小时，浓缩透析液，冷冻干燥，即得所述的蒲公英均一多糖。作为进ー步优选方案，所述回流脱脂的操作如下向蒲公英全草中加入体积百分含量为95%的こ醇，加入的こ醇体积为蒲公英全草质量的2 4倍；然后进行回流I 3小时。作为进ー步优选方案，所述提取的操作如下向药渣中加入去离子水，于室温浸泡I 3小时，然后加热煮沸进行煎煮2 4小时，过滤，对所得药渣再重复上述操作I 3次；每次加水体积为药渣质量的8 10倍。作为进ー步优选方案，将提取液浓缩到在60 80°C的相对密度为I. O I. 5。作为进ー步优选方案，所述沉析的操作如下在不断搅拌下向上清液中加入体积百分含量为95%的こ醇，こ醇的加入体积为上清液体积的2 4倍；加毕，在O 5°C静置12 24小时。本发明所述的蒲公英均一多糖的ー种用途，是以所述蒲公英均一多糖作为抗补体活性成分用于制备保健食品或药物制剂。本发明所述的蒲公英多糖提取物的另ー种用途，是以所述蒲公英均一多糖作为抗氧化活性成分用于制备保健食品或药物制剂。所述的药物制剂可以是任何一种适合于临床使用的剂型，包括固体制剂(如胶囊、片剂、颗粒剂等)、半固体制剂(如软膏等)、液体制剂(如□服液、混悬剂、乳剂等)、注射剂等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果药效学实验表明本发明所提供的蒲公英均一多糖经典途径抗补体活性的CP5tl值是O. 0126mg/mL，与阳性药肝素O. 0206mg/mL相比，表现出非常好的抗补体活性；旁路途径抗补体活性的AP5tl值是O. 05885mg/mL，与阳性药肝素O. 0887mg/mL相比也表现出非常好的抗补体活性；其抗补体活性靶点为Clq、Clr、Cls、C2、C3、C4和C5 ;另外，本发明所提供的蒲公英均一多糖对DPPH自由基有效清除率高达63%。因此，本发明所述的蒲公英均一多糖可望作为抗补体活性成分或/和抗氧化活性成分用于制备保健食品或药物制剂，使用安全，无副作用之忧，且制备エ艺简单，质量稳定，适于规模化生产，具有广阔的应用前景和市场价值。
图I为本发明中所述的蒲公英均一多糖的凝胶分离图；图2为本发明实施例I制得的蒲公英均一多糖的HPLC-GPC液相图谱；图3为本发明实施例I制得的蒲公英均一多糖的GC-MS图；图4为本发明实施例I制得的蒲公英均一多糖进行甲基化后的GC-MS图；图5为本发明实施例I制得的蒲公英均一多糖的经典途径溶血活性曲线图；图6为本发明实施例I制得的蒲公英均一多糖的旁路途径溶血活性曲线图；图7为本发明实施例I制得的蒲公英均一多糖的抗补体活性靶点分析结果图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步详细、完整地说明。实施例I取蒲公英全草置于提取器内，加入体积百分含量为95%的こ醇，加入的こ醇体积为蒲公英全草质量的2倍；进行回流脱脂2小时，过滤，挥干药渣中的こ醇；向药渣中加入去离子水，于室温浸泡3小时，然后加热煮沸进行煎煮4小吋，过滤，对所得药渣再重复上述操作3次；每次加水体积为药渣质量的10倍；合并提取液，将提取液浓缩到在80°C的相对密度为I. 2，离心，收集上清液；在不断搅拌下向上清液中加入体积百分含量为95%的こ醇，こ醇的加入体积为上清液体积的4倍；加毕，置入4°C冰箱静置12小时；离心得沉淀，并挥干其中的こ醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量为10000道尔顿的透析袋在水中透析72小吋，以除去其中的小分子多糖、蛋白、こ醇及盐和ー些水溶性杂质；浓缩透析液，冷冻干燥，得蒲公英多糖提取物粗品，得率约为全草质量的7. 13%。将上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，于8500rpm离心IOmin ;将沉淀再加水加热溶解，再次于8500rpm离心IOmin ;合并两次离心所得上清液,上样于ニこ胺基こ基(DEAE)阴离子交換柱，依次用蒸馏水、O. 2,0. 5,0. 8、I. Omol/L的NaCl溶液洗脱，收集由
I.Omol/L的NaCl溶液洗脱的洗脱液；减压浓縮，然后用截留分子量为3500道尔顿的透析袋进行流水透析24小时；进ー步用凝胶层析柱superdex-200 (60cm, 26mm)分离纯化，以O. 2mol/L的NaCl溶液为洗脱液，流速I. lmL/min, shodex示差折光检测，蛋白纯化系统Versatiler system在线成像，根据凝胶分离图谱(见图I所示)收集均一多糖，用截留分子量为3500道尔顿的透析袋进行去离子水透析48小时，浓缩透析液，冷冻干燥，即得所述的、蒲公英均一多糖，得率约为蒲公英多糖提取物粗品质量的5. 32%。一、进行纯度和分子量检测以高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测，流动相为纯水或者O. 2mol/L NaCl溶液，流速为O. 8mL/min,柱温为40°C，检测器为示差检测器，色谱柱为Shodex KS-805和KS-804串联。以不同分子量的葡聚糖标准品制作标准曲线，然后根据样品的洗脱时间与标准曲线对照，用Agilent GPC软件计算其分子量。图2为所获得的蒲公英均一多糖的HPLC液相图谱，可见为单一对称峰(以O. 2mol/L NaCl溶液为流动相)，表明其为均一多糖；Agilent GPC软件测得所得均一多糖的分子量为I. 6X IO4道尔顿(以葡聚糖标准品为參考标准)。
ニ、单糖组成检测I)仪器和试剂Thermo fisher DSQ 气相色谱仪，(305mX0. 32mmX0. 5 μ m)色谱柱。こ醇、こ腈、氯仿、こ酸酐、无水硫酸钠、三氯こ酸、三氟こ酸、4-甲基吗啡硼烷均为分析纯。2)对照品D-鼠李糖、L-岩操糖、D-木糖、D-阿拉伯糖，D-甘露糖、D-匍萄糖、D-半乳糖、对照品(sigma公司)。3)对照品溶液的制备用还原水解法进行糖组成分析精密称定各单糖对照品I. Omg置于长试管中，カロ入新鲜配制的浓度为80mg/mL的4-甲基吗啡啉硼烧水溶液50 μ L和3mol/L的三氟こ酸水溶液200 μ L，混匀后于80°C加入热5分钟；待溶液冷却后再加入50 μ L 4-甲基吗啡啉硼烷水溶液，120°C加热I小时；待溶液冷却后再加入100 μ L 4-甲基吗啡啉硼烷水溶液，50°C蒸干，再加入3mLこ腈蒸干3次；然后加入醋酐和三氟こ酸各100 μ L，于50°C水浴中こ酰化10分钟，加入蒸馏水2mL和氯仿2mL萃取，再用水洗三次，过无水硫酸钠柱，进行GC-MS分析。4)供试品溶液的制备用还原水解法进行单糖组成分析精密称定所得均一多糖I. Omg置于长试管中，加入新鲜配制的浓度为80mg/mL的4-甲基吗啡啉硼烷水溶液50 μ L和3mol/L的三氟こ酸水溶液200 μ L，混匀后于80°C加热5分钟；待溶液冷却后再加入50 μ L 4-甲基吗啡啉硼烷水溶液，120°C加热I小时；待溶液冷却后再加入100 μ L 4-甲基吗啡啉硼烷水溶液，50°C蒸干，再加入3mLこ腈蒸干3次；然后加入醋酐和三氟こ酸各100 μ L，于50°C水浴中こ酰化10分钟，加入蒸馏水2mL和氯仿2mL萃取，再用水洗三次，过无水硫酸钠柱，进行GC-MS分析。5)气相色谱条件GC-MS 分析条件为TR-5MS (Thermo)色谱柱(60mX0. 25mmX0. 25 μ m);程序升温条件为从140°C柱温开始，以2°C /min升温至198°C,保温4min,再以4°C /min升温至214°C，然后以1°C /min升温至217°C，保持4min，最后以3°C /min升温至250°C，保持5min ；进样ロ温度为250°C ;载气为He，流速为lmL/min。6)测定采用气相色谱法分别测定各对照品与供样试品溶液，得到的供样试品图谱与标准单糖的图谱对照。通过保留时间的比较可知，所述均一多糖的单糖组成主要为D-阿拉伯糖和D-葡萄糖、D-半乳糖，此外含有少许D-木糖，D-鼠李糖，D-甘露糖。图3为所述的蒲公英均一多糖的GC-MS图，通过面积归ー化法可知D_阿拉伯糖占25. 4wt%、D-葡萄糖占17. 7wt%、D-半乳糖占44. 5wt%、D-木糖占4. lwt%、D-鼠李糖占3wt%、D-甘露糖占 5. lwt%三、甲基化分析I)甲基化反应取所得均一多糖20mg放于25mL三角瓶中，在放有五氧化ニ磷的干燥器中干燥过夜，加入2mL ニ甲基亚砜(DMSO)搅拌溶解lOmin，如样品不溶于DMS0，可在40KHz超声频率下超声lOmin，再加入研成粉末的NaOH 200mg，超声10min(40KHz)，25°C室温搅拌反应I小时；逐滴加入CH3I I. 5mL,加完后放在暗处揽祥反应I小时；最后加入2mL蒸懼水分解残留的CH3I,搅拌反应lOmin,用蒸懼水洗至60mL分液漏斗中，用氯仿萃取三次,合并萃取液,用蒸馏水洗三次，分出氯仿层，低温旋干，然后干燥，重复上述甲基化反应3次，得到完全甲基化的均一多糖样品。2)试样品准备取完全甲基化的均一多糖样品2mg,加入3mL 2mol/L的三氟こ酸水溶液中溶解，转入IOmL安瓿瓶中，封ロ，121°C烘箱中水解反应2小时，取出，减压蒸干，再加入甲醇蒸干三次，重复操作以完全除尽TFA ;水解后残余物加入IOOmg NaBH4和2mL水，室温还原反应过夜；加入冰醋酸反应以除去过量的NaBH4，于旋转蒸发仪上浓缩至粘稠液体，加入甲醇-冰醋酸(体积比5:1) 3 5mL，蒸干三次，再加入甲醇蒸干两次，得白色粉末，放入烘箱1050C 15min以除去水分，加入3mLこ酸酐，于101°C烘箱中こ酰化反应I小时，取出，多次加入甲苯50°C水浴减压共沸蒸干至粉末状；加入适量水溶解，加入氯仿萃取三次，合并氯仿层，用水洗涤三次，分出氯仿层，用无水硫酸钠干燥、浓缩后进行GC-MS分析。3)色谱条件GC-MS 分析条件为TR-5MS (Thermo)色谱柱(60mX0. 25mmX0. 25 μ m);程序升温条件为从140°C柱温开始，以2°C /min升温至180°C，再以1°C /min升温至200°C，最后以30C /min升温至250°C，保持5min ;进样ロ温度为250°C;载气为He，流速为lmL/min。具体GC-MS图谱见图4所示。4)分析结果具体分析结果见表I所示。表I所述均一多糖的甲基化分析结果
連接方式甲基化的糖残基摩尔比tR/min
I-Rha2，3，4-Me3-Rhap5.2121. 5
I-Ara2，3，5-Me3-Araf2.0418. 51
I，5-Ara2，3-Me2-Araf3. 4119. 权利要求
1.ー种蒲公英均一多糖，其特征在干由蒲公英全草经水提醇沉、透析截取分子量大于10000道尔顿的组分，然后经阴离子交换柱层析分离，再经葡聚糖凝胶层析柱纯化而得；所述均一多糖的分子量为I. 6 X IO4道尔顿，其单糖组成为D-阿拉伯糖占25. 4wt%、D-葡萄糖占17. 7wt%、D-半乳糖占44. 5wt%、D-木糖占4. lwt%、D-鼠李糖占3wt%、D-甘露糖占5.3wt%0
2.—种权利要求I所述的蒲公英均一多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 a)首先将蒲公英全草用こ醇回流脱脂，然后过滤，挥干药渣中的こ醇；加水浸泡、煎煮提取；合并提取液，浓缩，离心，收集上清液；加入こ醇进行沉析；离心得沉淀，并挥干其中的こ醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量为10000道尔顿的透析袋在水中透析24 72小时；浓缩透析液，冷冻干燥，得蒲公英多糖提取物粗品； b)将上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，离心；将沉淀再加水加热溶解，离心；合并两次离心所得上清液，上样于ニこ胺基こ基(DEAE)阴离子交換柱，依次用蒸馏水、O. 2,0. 5、O. 8、I. Omol/L的NaCl溶液洗脱，收集由I. Omol/L的NaCl溶液洗脱的洗脱液；减压浓缩，然后用截留分子量为3500道尔顿的透析袋进行流水透析24小时；上样于凝胶层析柱，以O.2mol/L的NaCl溶液为洗脱液，流速I. lmL/min，示差折光检测，蛋白纯化系统在线成像，根据凝胶分离图谱收集均一多糖，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋进行去离子水透析48小时，浓缩透析液，冷冻干燥，即得所述的蒲公英均一多糖。
3.根据权利要求2所述的蒲公英均一多糖的制备方法，其特征在干，所述回流脱脂的操作如下向蒲公英全草中加入体积百分含量为95%的こ醇，加入的こ醇体积为蒲公英全草质量的2 4倍；然后进行回流I 3小时。
4.根据权利要求2所述的蒲公英均一多糖的制备方法，其特征在于，所述提取的操作如下向药洛中加入去离子水，于室温浸泡I 3小时,然后加热煮沸进行煎煮2 4小时，过滤，对所得药渣再重复上述操作I 3次；每次加水体积为药渣质量的8 10倍。
5.根据权利要求2所述的蒲公英多糖提取物的制备方法，其特征在于将提取液浓缩到在60 80°C的相对密度为I. O I. 5。
6.根据权利要求2所述的蒲公英均一多糖的制备方法，其特征在干，所述沉析的操作如下在不断搅拌下向上清液中加入体积百分含量为95%的こ醇，こ醇的加入体积为上清液体积的2 4倍；加毕，在O 5°C静置12 24小吋。
7.—种权利要求I所述的蒲公英均一多糖的用途，其特征在于以所述蒲公英均一多糖作为抗补体活性成分用于制备保健食品或药物制剂。
8.—种权利要求I所述的蒲公英均一多糖的用途，其特征在干以所述蒲公英均一多糖作为抗氧化活性成分用于制备保健食品或药物制剂。
全文摘要
本发明公开了一种蒲公英均一多糖及其制备方法和用途。所述均一多糖是由蒲公英全草经水提醇沉、透析截取分子量大于10000道尔顿的组分，然后经阴离子交换柱层析分离，再经葡聚糖凝胶层析柱纯化而得；所述均一多糖的分子量为1.6×104道尔顿，其单糖组成主要为阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和少许木糖、鼠李糖、甘露糖。药效学实验表明本发明所提供的蒲公英均一多糖经典途径抗补体活性的CP50值是0.0126mg/mL，旁路途径抗补体活性的AP50值是0.05885mg/mL，对DPPH自由基有效清除率高达63%；可望作为抗补体活性成分或/和抗氧化活性成分用于制备保健食品或药物制剂，具有广阔的应用前景和市场价值。
文档编号A61P37/06GK102653568SQ20121016925
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月28日 优先权日2012年5月28日
发明者刘飞, 施松善, 王宏伟, 王峥涛, 王顺春, 胡之璧, 范洪伟, 鲍斌 申请人:上海中医药大学