专利名称：阿尔茨海默病外周细胞中pkc同工酶加工的异常改变的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断阿尔茨海默病或确认对象是否存在阿尔茨海默病的方法。本发明还涉及筛选可用于开发治疗或预防阿尔茨海默病的治疗剂的先导化合物的方法。本发明还涉及用稳定或磷酸化的PKC同工酶水平构建的算法比来检测某些PKC同工酶加工的变化从而诊断对象中阿尔茨海默病的方法。本文所述方法用于诊断阿尔茨海默病、监控阿尔茨海默病发展并用于鉴定先导化合物的筛选方法。本发明还涉及选择对阿尔茨海默病的治疗响应提闻的患者的方法。发明背景 ^ -淀粉样蛋白(AP)是神经炎性斑的主要组分，其与神经原纤维团一起为阿尔茨海默病(AD)的生理标记。Katzman,N Eng J Med. 1986 ；314 :964-973 ;Bush等，PharmacolTher. 1992 ;56 :97-117。淀粉样前体蛋白(APP)的突变形式促使不同脑区域中AP的过度释放，造成其在神经炎块中的积累。Wallace,Biochim Biophys Acta. 1994 ；1227 :183_187。在包括成纤维细胞在内的许多来自AD组织的细胞类型中，已证明涉及钙稳态、离子通道渗透性、环化AMP和磷酸肌醇代谢物的信号转导系统中发生变化。还显示A 3的生成改变。此夕卜，AP自身能影响相同转导系统。蛋白激酶C(PKC)是蛋白激酶的最大基因家族之一。Liu和Heckman，CellularSignalling. 1998 ; 10 (8) :529-42。数种 PKC 同工酶在脑中表达，包括 PKC-a、PKC-P 1，、PKC- ^ II、PKC- 6、PKC- e和PKC- y。PKC主要是胞浆蛋白质，但刺激后其移位到膜上。已表明PKC参与大量有关AD的生化过程。PKC活化在学习能力和记忆提高中起关键作用，且已表明PKC激活剂提高记忆和学习能力。Sun和Alkon，Eur J Pharmacol. 2005 ；512 :43-51 ;Alkon 等，Proc Natl Acad Sci USA. 2005 ；102 :16432-16437。还显示 PKC 活化诱导大鼠海马区的突触发生，这表明神经变性病症期间可能发生PKC介导的抗凋亡和突触发生。Sun和 Alkon，Proc Natl Acad Sci USA. 2008 ； 105 (36) :13620-1362511((:激活剂苔藓抑素-I的缺血/低氧后治疗有效地恢复突触发生、神经营养活性以及空间学习和记忆中缺血诱导的缺陷。Sun和Alkon，Proc Natl Acad Sci USA. 2008。该效应伴随有突触蛋白树突棘素(spiniophilin)和突触小泡蛋白的水平上升和突触形态的结构改变。Hongpaisan和Alkon,Proc Natl Acad Sci USA. 2007 ; 104 :19571-19576。用于长期联想记忆的苔藓抑素诱导的突触发生也受到PKC活化的调节。Hongpaisan和Alkon，PNAS 2007。PKC还活化神经营养蛋白生产。神经营养蛋白，具体是脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)是受损神经元和突触起始修复和再生长的关键生长因子。一些PKC同工酶，具体是PKC- e和PKC-a的活化能保护免受神经损伤，其最可能是通过上调神经营养蛋白的生成而实现。Weinreb 等，The FASEB Journal. 2004 ;18 :1471-1473)。还报道 PKC 激活剂诱导酪氨酸羟化酶的表达并诱导神经元存活和神经突长出。Du和Iacovitti, J Neurochem. 1997 ；68 564-69 ;Hongpaisan 和 Alkon，PNAS 2007 ;Lallemend 等，J Cell Sci. 2005 ;118 :4511_25。PKC基因家族目前由11种基因组成，它们分成以下4个亚组1)经典PKC-a、-M、-￠2(0 I和￠2是同一基因的选择性剪接形式)和_Y，2)新的PKC- S、- e、- n 和-0 ;3)非典型的 PKC- €、-入、-n 和-I ;和 4) PKC- U。PKC- U类似于非典型的PKC同工酶，但不同之处是具有推定的跨膜域。Blohe等，CancerMetast. Rev. 1994 ； 13 :411 ；Ilug 等，Biochem J. 1993 ；291 :329 ；Kikkawa 等，Ann. Rev.Biochem. 1989 ;58 :31。- a、- @ ^ 0 2和-Y同工酶是Ca2+、磷脂和二酰甘油依赖性的，它们代表PKC的经典同种型，而其他同工酶能被磷脂和二酰甘油激活，但不依赖Ca2+。所有同工酶均包括5个可变区(V1-V5)，且a和Y同工酶含有高度保守的四个(C1-C4)结构域。除PKC-a、和-Y-外，所有同工酶均缺少C2结构域，且-X、-n和同工酶也缺少二酰甘油结合的Cl中两个富含半胱氨酸锌指结构域中的九个。Cl结构域也含有所有同工酶中高度保守的假底物序列，它通过阻断底物结合位点产生该酶的无活性构象而起到自身调节功能。House 等，Science. 1987 ；238 :1726。由于这些结构特征，认为各种PKC同工酶在响应生理刺激的信号转导中具有高度 特化的功能。各种PKC同工酶对刺激的响应已在AD中研究。例如，AD患者中PKC主要下游底物Erkl/2的PKC-a / e -介导的憐酸化水平降低。Khan和Alkon, Proc Natl Acad SciUSA. 2006 ；103 :13203-13207。此外，对正常成纤维细胞的A 3应用降低PKC活性，因为A 3直接下调PKC a / e。已提出PKC激活剂，尤其是对PKC a / e特异的那些能抵消A ^的效应，从而逆转或阻止AP诱导的改变。还证实了 PKC调控APP过程。已显示PKC激活剂能显著增加细胞分泌的非淀粉样可溶性APP(sAPP)的相对含量。PKC活化还逆转异常的MAP激酶磷酸化和AD成纤维细胞中
水平的伴随升高。参见美国专利申请公开号US-2007-0082366。此外，发现一种有效的PKC激活剂苔藓抑素降低含人AD基因的转基因小鼠脑中的AP (1-42)水平。相反，还表明々0肽相较非AD成纤维细胞差异性影响AD成纤维细胞中的PKC同工酶。Favit 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ；1998. 95 :5562_67。用纳摩尔浓度的 A3 (1-40)处理非AD (AC)成纤维细胞使PKC- a下降75%，其在AD成纤维细胞中已下降，但不是PKC- y的免疫反应性。相反，在AD成纤维细胞中，(1-40)引起PKC-Y下降70%而非PKC-a的免疫反应性。用PKC激活剂处理恢复了 AC细胞中的PKC- a信号，但其没有逆转对AD细胞中PKC-Y的影响。用蛋白合成抑制剂处理没有抑制AD细胞中AP (1-40)的效应但抑制PKC激活剂处理的AC细胞中的效应，表明正常细胞而非AD细胞中PKC的激活通过蛋白从头合成发挥保护作用。本发明提供研究外周细胞中AP诱导的变化对各种PKC同工酶水平的影响的方法。测量水平稳定状态和/或磷酸化的PKC同工酶以及AP诱导的变化可用于诊断AD、监控AD发展或非AD状态到AD的发展、并用于发现治疗AD疗法的筛选方法。发明概述本发明涉及确定或证实对象中是否存在阿尔茨海默病的方法。在一个实施方式中，本方法包括i)确定有和没有AP肽时候选对象的细胞中第一 PKC同工酶的稳定状态蛋白水平，生成第一比例；ii)确定有和没有AP肽时第二 PKC同工酶的稳定状态蛋白水平，生成第二比例，其中所述第二 PKC同工酶是否受AP肽调节未知；iii)通过将所述第一比例除以第二比例生成PKC同工酶指数。在一个实施方式中，所述AP肽是AP (1-42)，尽管可用任何AP肽。在另一实施方式中，所述第一 PKC同工酶是PKC-a、和/或PKC-e且所述第二 PKC同工酶是PKC-Y。在一个具体实施方式
中，稳定状态的PKC同工酶水平的差分处理，即PKC同工酶指
数，按照下述公式确定
权利要求
1.一种确定候选对象有或没有阿尔茨海默病的方法，所述方法包括 i)确定有和没有AP肽时候选对象的外周细胞中第一PKC同工酶的蛋白水平，生成第一比例； ii)确定有和没有AP肽时候选对象的外周细胞中第二PKC同工酶的蛋白水平，生成第二比例，其中所述第二 PKC同工酶在AD细胞中相较非AD细胞是否受A ^肽的差异调节未知； iii)通过所述第一比例除以第二比例生成PKC同工酶指数，其中约I.O或更低的PKC同工酶指数表示诊断有阿尔茨海默病，而大于I. O的PKC同工酶指数表示没有阿尔茨海默病。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述PKC同工酶指数用下式I表示的稳定状态水平的PKC同工酶生成 I [PKC-x]/[PKC-x]^ =pKC_x [PKC-z]/[PKC-z]a/j 其中“x”代表所述第一 PKC同工酶、“z”代表所述第二 PKC同工酶、且AP代表与A 3肽接触的细胞。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述PKC同工酶指数用下式II表示的磷酸化水平的PKC同工酶生成 II [P-PKC-xMp-PKC^ pKc_x 指数[p-PKC-z]/[p-PKC-z]A^ 其中“x”代表所述第一 PKC同工酶、“z”代表所述第二 PKC同工酶、且AP代表与A 3肽接触的细胞、且p-PKC-x和p-PKC-z代表磷酸化的PKC同工酶。
4.权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括存在PKC激活剂时确定步骤i和ii中所述第一和第二 PKC同工酶的蛋白水平。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-a且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-e且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-a且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-e且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-a且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一PKC同工酶是PKC-e且所述第二PKC同工酶是PKC-Y。
11.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述A3肽是A3(1-40)或六@ (1-42)。
12.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述外周细胞是皮肤细胞、皮肤成纤维细胞、血液细胞或口腔颊粘膜细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述外周细胞是皮肤成纤维细胞。
14.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述AP肽以约I.OnM-IOii M的浓度存在。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述AP肽以约I.Oy M的浓度存在。
16.一种监控对象阿尔茨海默病发展的方法，所述方法包括 i)按照权利要求I所述的方法在第一时间点从测试对象的外周细胞中生成PKC同工酶指数以获得所述对象的参考PKC同工酶指数，其中所述测试对象已被诊断患有阿尔茨海默病； ii)在第一时间点后的一个或多个时间点从相同对象的外周细胞中生成同样的PKC同工酶指数； iii)确定获自第一时间点后的所述一个或多个时间点的PKC同工酶指数相比所述第一时间点的PKC同工酶指数是否降低； 其中获自第一时间点后的所述一个或多个时间点的PKC同工酶指数相比所述第一时间点的PKC同工酶指数降低表明阿尔茨海默病的发展。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述测试对象在所述第一时间点已被诊断为早期阿尔茨海默病。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述测试对象在所述第一时间点已被诊断为轻度阿尔茨海默病。
19.一种监控对象从非阿尔茨海默病症向阿尔茨海默病发展的方法，所述方法包括 i)按照权利要求I所述的方法在第一时间点从测试对象的外周细胞中生成PKC同工酶指数以获得所述对象的参考PKC同工酶指数，其中所述测试对象未被诊断患有阿尔茨海默病； ii)在第一时间点后的一个或多个时间点从相同对象的外周细胞中生成同样的PKC同工酶指数； iii)确定获自第一时间点后的所述一个或多个时间点的PKC同工酶指数相比所述第一时间点的PKC同工酶指数是否降低； 其中获自第一时间点后的所述一个或多个时间点的PKC同工酶指数相比所述第一时间点的PKC同工酶指数降低表明向阿尔茨海默病的发展。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述阿尔茨海默病症是轻度认知障碍。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述轻度认知障碍是健忘认知障碍。
22.一种药盒，所述药盒含一种或多种AP肽；至少一种对PKC同工酶特异的抗体，已知所述PKC同工酶在AD细胞中相较非AD细胞受到AP肽的差异调控；至少一种对PKC同工酶特异的抗体，所述PKC同工酶在AD细胞中相较非AD细胞是否受到AP肽的差异调控未知；和用于确定PKC同工酶指数的说明。
23.如权利要求22所述的药盒，其特征在于，所述AP肽是AP(1-40)或八0 (1_42)。
24.如权利要求22所述的药盒，其特征在于，所述已知在AD细胞中受到AP肽差异调控的PKC同工酶为PKC-a。
25.如权利要求22所述的药盒，其特征在于，所述已知在AD细胞中受到AP肽差异调控 的PKC同工酶为PKC- e。
26.如权利要求22所述的药盒，其特征在于，所述在AD细胞中是否受到AP肽差异调控未知的PKC同工酶为PKC- y。
全文摘要
本发明提供通过用PKC同工酶指数从非AD病症中诊断AD的方法，所述指数通过缺失和存在β-淀粉样肽及任选存在PKC激活剂时确定测试对象的外周细胞中不同PKC同工酶之比的比例来获得。
文档编号G01N33/68GK102741696SQ201080055143
公开日2012年10月17日 申请日期2010年10月1日 优先权日2009年10月2日
发明者D·L·阿尔康, T·K·卡恩 申请人:布朗歇特 洛克菲勒神经科学研究所