专利名称：：具有对阿尔茨海默病和帕金森病的预防或治疗有用的新组合的银杏叶提取物及其提取和...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种银杏叶提取物，其包含相对于所述提取物总重量10-14重量％(优选11-13重量％和最优选12重量％)的碎内酯、20-30重量％的银杏黄酮苷和少于5ppm的银杏酸，其在抑制NO(—氧化氮)的产生和治疗阿尔茨海默病和帕金森病中，优于包含标准银杏叶提取物(德国药典2000)的常规银杏叶提取物，并且本发明还涉及其提取和纯化方法以及含有其作为活性组分的药物组合物。
背景技术：
：银杏叶提取物有效的用于治疗外周动脉闭塞疾病、眩晕、血管性耳鸣和退行性耳鸣、器质性脑病综合征，并且在德国、法国及当前的世界范围内被开始用作药物治疗。银杏叶提取物含有多种活性成分，例如银杏黄酮苷(槲皮素，山奈酚和异鼠李黄素)，碎内酯(terpenetrilactone)(银杏苦内酯A、银杏苦内酯B、银杏苦内酯C和银杏内酯)，并且已知该提取物的药物活性归功于它们的组合[药物研发(DrugsR.D.)vo1.4(3)，188-193,2003]。标准化的银杏叶提耳又物(德国药典DAB2000)5-7%的辟内酯、22-27%的银杏黄酮苷和少于5ppm的银杏酸。这些组分中，银杏黄酮苦减少自由基，且碎内酯可有效对抗血小板活化因子(PAF)并抑制血小板聚集和一氧化氮的产生，还伴有神经保护活性[药靶研究最新进展(CumDrugTargets),Vol.Jul:1(1),25-58,2000]。银杏酸已知可引起变态反应和癌症。特别地，关于银杏叶提取物的神经保护作用已有研究。DeFeudisF.V.等报道了黄酮和银杏苦内酯减少自由基和活性氧部分并抑制脂质过氧化，并且银杏内酯改善线粒体中呼吸商[Curr.DrugTargets,Vol.Jul:1(1),25-58,2000]。BealM.F.等报道了帕金森氏病的发作与脑细胞线粒体退化有关，并且银杏叶提取物改善由线粒体退化引起的帕金森氏病[神经病学年报(Ann.Neurol.)，Vol.53Suppl3,39-47,2003]。类似地，YangS.F.等报道了银杏叶提取物在由MPTP(1-曱基_4_苯基_1,2,3,6-四氢吡啶(tetrahydropyrine))诱导的帕金森氏病的动物模型上显示了出众的治疗有效性[中国药理学才艮(ActaPharmacol.Sin.)，Vol.22(12),1089-1093,2001]。进一步地，卩-淀粉样蛋白因为促进神经元自由基的产生，被认为是与阿尔茨海默病有关的问题。据Sm池J.V.等报道，银杏叶提取物有效降低(3-淀粉样蛋白诱导的自由基[阿尔茨海默病杂志(J.AlzheimersDis).,Vol.5(4),287-300,2003]。如上所述，4艮杏叶提取物具有神经保护活性且可有效治疗血管性痴呆和阿尔茨海默病并改善认知能力，且长期被用于治疗器质性脑病综合征和外周动脉闭塞疾病。已进行多种尝试致力于开发具有更佳活性的银杏叶提取物的新的提取或纯化方法。例如，德国专利号DE-B1767098公开了用于制备含有大量黄酮苦的银杏叶提取物的方法。美国专利号6,844,451公开了从银杏叶中纯化萜内酯(银杏苦内酯和银杏内酯)的方法。然而所得的方法仅为制备与常规提取物含量类似的银杏叶提取物。特别地，鉴于银杏叶提取物表现出功效不是通过一种或特定类型的组分，而是通过银杏黄酮苷和萜内酯的组合物，上述提取物及其因此，活性优于标准化的银杏叶提取物(DAB)的银杏叶提取物直到现在仍未被开发出来，且如何从银杏叶中直接提取和纯化上述提取物仍未见报道
发明内容技术方案泛研究，旨在保持常规的标准银杏叶提取物活性的同时显示更佳的治疗活性。最终，他们发现与常规的银杏叶提取物相比，含有较多的萜内酯和同样量的银杏黄酮的银杏叶提取物可实现该目的。进一步地，作为另外的广泛研究的结果，本发明的发明人开发了直接从银杏叶中提取和纯化上述银杏叶提取物的方法。然而，本发明的优点不仅限基于组分中碎内酯含量的增加，还发现了最优配比，因此能够开发一种银杏叶提取物，其具有对阿尔茨海默病模型和帕金森病模型提高了的有效性。筒而言之，本发明提供了具有抗氧化活性和抑制自由基的银杏叶提取物，及其制备方法和含有该银杏叶提取物的药物组合物。与常规的银杏叶提取物相比，本文的银杏叶提取物含有相似含量的银杏黄酮苷和较高含量的萜内酯，因此可有效预防或治疗与神经元损伤有关的疾病，例如阿尔茨海默病和帕金森氏病。本发明旨在提供一种具有治疗或预防例如阿尔茨海默病和帕金森病的脑机能障碍提高的有效性的、具有新组合的银杏叶提取物，及其制备方法和含有该才是耳又物的药物组合物。为完成上述目的，本发明提供了一种具有新组合的银杏叶提取物，其在例Irf_*~/一、>trtl、^2-一，/人Jr/rt、一I—/.1>TTA_i"l7*/、/>""fTrf、—1-七frTl.1-■/，，口.、Y，.，-TT-口鬥w》欠〉母茅夂妈，甲日^^采祸曰3月西T儿恥r早力于日7《打7f口丁贝r万丫衣"6出i凡开'/百'r玍，及从银杏叶中提取和纯化银杏叶提取物的方法。特别地，本发明实施方式涉及一种银杏叶提取物，其含有相对于所述提^f又物总重量10-14重量％(优选11-13重量％且最优选12重量％)的萜内酯、20-30重量％的银杏黄酮苷和少于5ppm的银杏酸。本发明另一实施方式涉及从银杏叶中提取和纯化银杏叶提取物的方法，其包括(1)通过将银杏叶浸入例如丙酮、C,-C5醇及它们的混合物的有机溶剂中，或者浸入20-80体积％的所述有机溶剂的含水溶液中，之后在5-140。C下提取并过滤，获得第一提取液，(2)通过使用庚烷或己烷对第一提取液进行分级萃取，并弃去溶于庚烷或溶于己烷的部分，获得第二提取液，(3)通过使用体积比为1:2-2:1的丁醇和曱苯混合溶剂对第二提取液进行分级萃取，获得第三提取液，其溶于丁醇-曱苯混合物中，(4)通过将第三提取液置于5-3(TC下2-24小时，获得第四提取液，随后过滤，以及(5)将已过滤的第四提取液减压浓缩并千燥所述浓缩物，从而获得用于预防或治疗阿尔茨海默病和帕金森氏病的银杏叶提取物，其含有相对于从银杏叶中得到的提取物总重量10-14重量％(优选11-13重量％且最优选12重量％)的萜内酯，20-30重量。/。的银杏黄酮苷和少于5ppm的银杏酸。更详细地，在步骤(l)中，干燥的银杏叶粉末浸于相对于所述银杏叶重量的约1-30倍体积、优选5-10倍体积的选自丙酮以及诸如曱醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇的d-Cs醇中的至少一种有机溶剂中，或者浸于相对于所述银杏叶重量的约1-30倍体积、优选5-10倍体积的约20-80体积％(v/v%)(优选40-70体积％和更优选50-60体积％)所述有机溶剂的含水溶液中。提取在约5-140。C(优选所述溶剂沸腾温度附近)的温度下进行约1-24小时(优选10-18小时)，从而提供一种银杏叶的粗提取物。过滤后，所述提取物被减压浓缩至少于相对初始总重量的10重量％。可选^l奪地，由此获得的浓缩物通过加入水稀释，以致于该浓缩物等于总含水溶液的10-50重量°/。，并冷却至低于2(TC的温度，然后沉淀脂溶性成分并过滤。步骤(2)中，至此获得的第一提取溶液通过加入0.1-10倍(优选0.3-1.0倍)体积的庚烷(或己烷)得到分级萃取，以移除溶于庚烷(或溶于己烷)部分，至此获得的第二提取溶液，不含有已知可引起变态反应和癌症的银杏酸。步骤(3)中，至此获得的第二提取溶液可通过使用体积混合比为2:1-1:2(优选1:1)的丁醇-甲苯混合物，进行多次(优选2-3次)分级萃取，至此获得溶于丁醇_曱苯混合物中的第三提取溶液。步骤(4)中，将第三提取溶液置于5-30。C中2-24小时，至此获得第四提取溶液。步骤(5)中，将纯化的第四提取溶液蒸发并干燥，至此最终提供具有想要获得的组4、的才是耳又物，即一种《艮杏叶才是耳又物，其相对于所述才是耳又物总重量含有10-14重量％(优选11-13重量％和最优选12重量％)的萜内酯，20-30重量％的银杏黄酮苷和少于5ppm的4艮杏酸。有10-14重量％(优选11-13重量％和最优选12重量％)的萜内酯、20-30重量％的银杏黄酮苷，其在抑制一氧化氮(NO)的产生，以及预防或治疗阿尔茨海默病和帕金森氏病中优于传统的银杏叶提取物。进一步地，此处的银杏叶提取物含有少于5ppm的已知的会引起变态反应和癌症的银杏酸。叶提取物的药物组合物可按照常规方法通过使用药学可接受的载体例如稀释剂、赋形剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂，被制成粉剂、颗粒剂、片剂、硬胶嚢，软胶嚢或注射剂。药学上可接受的载体的实例诸如稀释剂、赋形剂、崩解剂、粘合剂和润滑齐寸，包括但不限于韩国药典(KP)、美国药典(USP)、日本药典(JP)和德国药典(DAB)中的那些示例。上述资料和专利均被全文引用在此作为参考。药物组合物优选本发明银杏叶提取物的含量为每单位剂型(perunitdosageform)含20-240mg(更优选40-120mg)。尽管此处药物组合物日剂量取决于给药途径和治疗条件，优选成年人的每日给药频率为l-4次。图1显示了测试物(GBE、YY-1224和YY-1824)抗一氧化氮生成的抑制活性。图2显示了通过蛋白质印迹法观察的iNOS蛋白结果。图3显示了通过RT-PCR法观察的iNOSmRNA结果。图4显示了平均逃离潜伏期，其为工作记忆试验的结果，所述工作记忆试验在以50mg/kg的剂量口服给予测试物至ICR小鼠7天后，然后脑室内(i.c.v.)给予400pmol的p-淀粉样蛋白完成。图5显示了环状穿越(annuluscrossing)数，其为探针试验结果，所述探针试验在以50mg/kg的剂量口服给予测试物(每种银杏叶提取物)至COX-2(+/+)小鼠7天后,然后脑室内(i.c.v.)给予400pmol的P-淀粉样蛋白完成。图6显示了银杏叶提取物对改善MPTP诱导的运动能力降低的疗效。特别地，图6显示了小鼠的运动能力(locomoteractivity),所述小鼠被给予测试物(50mg/kg,p.o.)8天，并以1天的间隔给予能减少运动能力并引起神经毒性的MPTP(25mg/kg,i.p.)6次。仅给予MPTP组(辦)显示了运动能力有意义的减少，而》会予GBE、YY-0924、YY-1224和YY-1824的组(*)显示了运动能力的增加。图7为显微照片，其显示了MPTP减少黑质(substantianigra)中酪氨酸羟化酶的表达，而测试物增加了酪氨酸羟化酶的表达。图8为显示了有关酪氨酸羟化酶免疫反应的图。MPTP减少了酪氨酸羟化酶在黑质中的表达(##)、而GBE，YY-1224和YY-1824增加了酪氨酸羟化酶的表达(*,**，*)。图9为显^t照片，显示MPTP增加了炎症应答，即增加小神经月交质细胞在黑质中增殖，而测试物减少了小神经胶质细胞的增殖。图10为显示关于小神经胶质细胞增殖的免疫应答的图。MPTP增加了炎症应答，即增加了黑质中小神经胶质细胞的增殖(##)，而GBE、YY-1224和YY-1824减少了小神经胶质细胞的增殖(**)。图ll为显微照片，其显示了MPTP增加了炎症应答，即紋状体中小神经胶质细胞的增殖，而测试物减少了所述小神经胶质细胞的增殖。图12显示了关于小神经胶质细胞增殖的免疫应答。MPTP增加了炎症应答，即增加了紋状体中小神经胶质细胞的增殖(##),而GBE、YY-1224和YY-1824减少了所述小神经胶质细胞的增殖(**)。图13为显微照片，显示了曱基苯异丙胺减少了酪氨酸羟化酶在黑质中的表达，而测试物增加了酪氨酸羟化酶的表达。图14为显示了关于酪氨酸羟化酶免疫应答的图(Y轴表达酪氨酸羟化酶的细胞数量)。曱基苯异丙胺减少了黑质中酪氨酸羟化酶的表达(絲)，而GBE、YY-1224和YY-1824增加了酪氨酸羟化酶的表达(*，**,*)。图15为显微照片，其显示了曱基苯异丙胺增加了炎症应答，即增加了小神经胶质细胞在黑质中的增殖，而测试物减少了小神经胶质细胞的增殖。图16显示了关于小神经胶质细胞增殖的免疫应答。曱基苯异丙胺增加了炎症应答，即增加了小神经胶质细胞在黑质中的增殖(絲)，而GBE、YY-1224和YY-1824减少了小神经胶质细胞的增殖(**)。图17为显微照片，其显示了曱基苯异丙胺增加炎症应答，即增加小神经胶质细胞在紋状体中的增殖，而测试物减少了所述小神经胶质细胞的增殖。图18显示了关于小神经胶质细胞的免疫应答。MPTP增加了炎症应答，即增加小神经胶质细胞在紋状体中的增殖(##),而GBE、YY-1224和YY-1824减少了小神经胶质细胞的增殖(**)。具体实施例方式本发明通过下述实施例被更为明确地描述。此处实施例仅旨在举例说明本发明，但决不限制所要求的发明，对照实施例1将银杏叶的干燥粉末(10kg)置于容器中，加入100L丙酮水溶液(60体积°/。)提取。12小时后进行加压过滤，将滤液減压浓缩至IOL。该浓缩物加水稀释至20L并剧烈地搅拌(vigorouslyagitate)。此后将所述稀释溶液于15。C放置12小时，且上清液与沉淀分离，随后过滤。所得滤液减压浓缩并干燥，由此制得252g银杏叶提取物。实施例1将银杏叶的干燥粉末(5kg)置于容器中，加入50L乙醇水溶液(50体积%)提取。12小时后进行加压过滤，并将滤液减压浓缩至5L。该浓缩物加水^^f王丄UL开/'J,"、J:"12W见^f于。-。/5^1""|^1亏;^，平-/务收，丄〕L刀人且丄么'J、HM,_tL_i_/fq液与沉淀分离，随后过滤。由此得到的水层(aqueouslayer)用5L庚烷处理3次，并且去除溶于庚烷的部分。留下的水层用IOL丁醇和曱苯(1:1,v/v)的混合溶剂处理3次。该混合溶剂层于15。C放置12小时后使用滤纸过滤。所得留下的溶液减压浓缩并干燥，由此制得57.3g纯化的银杏叶提取物。实施例2对照实施例1制备的银杏叶提取物100g溶解于1L乙醇水溶液(50v/v%)中。该溶液用500ml己烷处理三次，除去溶于己烷的部分。留下的水层用1L丁醇和曱苯(l:l，v/v)的混合溶剂处理三次。该混合溶剂层于15。C放置12小时后使用滤纸过滤。留下的溶液减压浓缩并干燥，由此制得54.7g纯化的银杏叶提取物。实施例3将银杏叶的干燥粉末(5kg)置于容器中，加入50L乙醇水溶液(50体积%)提取。12小时后加压过滤，并将滤液减压浓缩至5L。该浓缩物加水稀释至10L并剧烈地搅拌。此后将所得稀释溶液于15。C放置12小时，并且上清液与沉淀分离，随后过滤。由此得到的水层用5L己烷处理3次，并且去除溶于己烷的部分。留下的水层用10L丁醇和曱苯(1:1，v/v)混合溶剂处理3次。该混合溶剂层于15。C放置12小时后使用滤纸过滤。留下的溶液减压浓缩并干燥，由此制得48.7g纯化的银杏叶提取物。实施例4对照实施例1制备的4艮杏叶提取物100g溶解于1L乙醇水溶液(50v/v%)中。该溶液用500ml庚烷处理三次，除去溶于庚烷的部分。剩余的水层用1L丁醇和曱苯(1:2，v/v)的混合溶剂处理三次。该混合溶剂层于15。C放置12小时后使用滤纸过滤。留下的溶液减压浓缩并干燥，由此制得60.1g纯化的银杏叶提取物。对照实施例2将银杏叶的干燥粉末(5kg)置于容器中，加入50L乙醇水溶液(50体积%)提耳又。12小时后加压过滤，并将滤液减压浓缩至5L。该浓缩物加水稀释至IOL并剧烈地搅拌。此后将所得稀释溶液于15。C放置12小时，并且上清液与沉淀分离，随后过滤。由此得到的水层用5L庚烷处理3次，并且去除溶于庚烷的部分。留下的水层用IOL丁醇和曱苯(1:6;v/v)混合溶剂处理3次。该混合溶剂层于15。C放置12小时后使用滤纸过滤。留下的溶液减压浓缩并干燥，由此制得35.3g纯化的银杏叶提取物。对照实施例3对照实施例1制备的银杏叶提取物100g溶解于1L纯水中。该溶液用500ml的庚烷处理三次，并除去溶于庚烷的部分。留下的水层用1L丁醇和曱苯(1:4，v/v)的混合溶剂处理三次。该混合溶剂层于15。C放置12小时后使用滤纸过滤。留下的溶液减压浓缩并干燥，由此制得28.2g纯化的银杏叶提取物。对照实施例4将银杏叶的干燥粉末(5kg)置于容器中，加入50L乙醇水溶液(50体积%)提取。12小时后加压过滤，并将滤液减压浓缩至5L。该浓缩物加水稀释至10L并剧烈地搅拌。此后将所得稀释溶液于15。C放置12小时，并且上清液与沉淀分离，随后过滤。由此得到的水层用5L庚烷处理3次，并且去除溶于庚烷的部分。留下的水层用IOL丁醇和甲苯(4:1，v/v)混合溶剂处理3次。该混合溶剂层于15。C放置12小时后使用滤纸过滤。留下的溶液减压浓缩并干燥，由此制得80.2g纯化的银杏叶提取物。对照实施例5将银杏叶的干燥粉末(5kg)置于容器中，并加入50L乙醇水溶液(50体积％)提取。12小时后加压过滤，并将滤液减压浓缩至5L。该浓缩物加水稀释至10L并剧烈地搅拌。此后将所得稀释溶液于15。C放置12小时，并且上清液与沉淀分离，随后过滤。由此得到的水层用5L庚烷处理3次，并且去除溶于庚烷的部分。留下的水层用10L丁醇和曱苯(l:3，v/v)混合溶剂处理3次。该混合溶剂层于15t^文置12小时后使用滤纸过滤。留下的溶液减压浓缩并干燥，由此制得79.1g纯化的银杏叶提取物。将上述实施例和对照实施例中制备的银杏叶提取物，如德国药典DAB2000(银杏干燥提取物，标准化的)中描述的那样进行组分分析。表1[表]<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><制备实施例>制备含有银杏叶提取物的药物组合物本文中所使用的，"YY-1224"是指实施例2制备的银杏叶提取物，其含有约12重量％的碎内酯和约24重量％的银杏黄酮苷。制备实施例1根据常规方法通过压制和包衣下述组分制成的含有YY-1224的片齐ij。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>含有YY-1224的硬胶嚢<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><制备实施例3〉根据常规方法通过混合和填充下述组分制备的含有YY-1224的软胶嚢。表4[表4][表]<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>按照常规方法通过配制并加入下述组分制备的含有YY-1224的注射剂。表5[表〗含有YY-1224的注射剂<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><实验实施例>药理学评价下文提供了本发明的银杏叶提取物抑制NO(—氧化氮)产生以及抗痴呆和帕金森氏病的活性。本文所使用的，"GBE"(标准化的银杏叶提取物)是指含有6重量％碎内酯和约24重量％的银杏黄酮苷的银杏叶提取物；"YY-0924"是指含有约9重量％的碎内酯和约24重量％的银杏黄酮香的银杏叶提取物；"YY-1224"是指含有约12重量％的碎内酯和约24重量％的银杏黄酮苷的银杏叶提取物；以及"YY-1824"是指含有约18重量％的辟内酯和约24重量％的银杏黄酮苷的银杏叶提取物。<实验实施例1>抑制一氧化氮产生的活性除了作为重要的信号传递物质外，一氧化氮还与炎症、神经细胞损伤和阿尔茨海默病的发作相关。因此已开发了具有抑制归因于iNOS(诱导型一氧化氮合酶)的过多一氧化氮产生的活性的新药物。这些药物中，银杏苦内酯A、银杏苦内酯B和银杏内酯被报道抑制一氧化氮的产生。RAW264.7细胞是小鼠的巨噬细胞，可被接种并培养于96孔细胞培养板2小时，随后再加入不同浓度(1-1000/mL)的测试物和脂多糖(LPS)另外培养24小时。在与格里斯试剂(Griessreagent)反应后一氧化氮的产生用分光光度计由全自动定量绘图酶标仪在550nm定量测定。图1显示了GBE、YY-1224和YY-1824对一氧化碳产生的抑制活性，YY-1224是本发明的银杏叶提取物，与GBE(标准化的银杏叶提取物)相比显示出极为优良的活性。<实验实施例2>iNOS蛋白和iNOSmRNA的产生为了研究归功于YY-1224和YY-1824的抑制一氧化氮产生的机理，通过蛋白质印迹法和依据ChiYS等(生化药理学(Biochem.Pharmacol.)61,1195-1203，2001)的RT-PCR方法观察iNOS蛋白和iNOSmRNA,结果见图2和图3。图2显示了通过蛋白质印记法观察到的i—NOS蛋白结果。与标准化的银杏叶提取物(GBE)相比，YY-1224和YY-1824被确定在更低的浓度抑制iNOS蛋白的产生。图3显示了通过RT-PCR方法观察到的iNOSmRNA结果。与标准化的银杏叶提取物(GBE)相比，YY-1224和YY-1824被确定在更低的浓度抑制iNOSmRNA的产生。通过上述結果，YY-1224和YY-1824对一氧化氮产生的抑制活性可能被推测是由于减少iNOS蛋白和iNOSmRNA的产生。<实验实施例3>YY-1224改善p-淀粉样蛋白诱导的ICR小鼠记忆和认知损伤的活性以50mg/kg的剂量，口服给予测试物至ICR小鼠7天，随后脑室内(i.c.v.)给予400pmolp-淀粉样蛋白。在工作记忆试-睑进行前，对照组给予不容易引起阿尔茨海默斑的40-氨基酸肽(A(31-40)。试验组被给予容易引起阿尔茨海默斑的42-氨基酸肽(Api-42)。为了进行工作记忆试验，将一个圓形浴盆(直径90cm，高60cm)装满水，并在浴盆中间(表面1cm以下)安装一个透明的平台。将小鼠随机置于距离浴盆外壁2cm远的5个固定点之外的某一位置。该工作记忆试验通过测定小鼠到达平台所需的时间来进行。图4显示了对照组和试验组在工作记忆试验期间的平均逃离潜伏期。尽管给予A卩l-42，-淀粉样蛋白延长了平均逃离期(絲)，GBE、YY-0924、YY-1224和YY-1824的预治疗缩短了平均逃离期，因此显示出记忆和认知的改善(**)。特別地，YY-1224在改善由(3-淀粉样蛋白诱导的记忆和认知损伤中被确定显著优于任何对照实施例。<实验实施例4>YY-1224在改善由(3-淀粉样蛋白诱导的COX-2(+/+)小鼠记忆和认知损伤的活性。以50mg/kg的剂量，口服给予测试物至COX-2(+/+)小鼠7天，所述小鼠为具有COX-2基因的野生型小鼠，随后脑室内(i.c.v.)给予400pmol(3-淀粉样蛋白。进行探针试验前，对照组给予不容易引起阿尔茨海默斑的40-氨基酸肽(A(31-40)。试验组被给予容易引起阿尔茨海默斑的42-氨基酸肽(AP1-42)。为了进行^探针试验，将一个圆形浴盆(直径90cm，高60cm)装满水，并在浴盆中间(表面lcm以下)安装一个透明的平台。将小鼠随机置于距离浴盆外壁2cm远的5个固定点之外的某一位置，并被允许记住该平台的位置。该探针试^r通过测量小鼠穿过平台的次数来进行。图5比较了环形穿越(annuluscrossing)数，作为给COX-2(+/+)小鼠按50mg/kg剂量给予测试物7天和400pmo1的(3-淀粉样蛋白(i.c.v.)之后的探针试验结果。所述A(31-42p-淀粉样蛋白的给药有意义地减少了环形穿越次数(##),这通过GBE、YY-0924、YY-1224和YY-1824的预治疗而得到了改善(**)。特别地，YY-1224可在改善(3-淀粉样蛋白引起的记忆和认知损害中被确定是显著优于任何对照实施例。<实验实施例5>改善MPTP诱导的运动能力的降低以50mg/kg的剂量，将测试物口服(p.o.)给予COX-2(+/+)小鼠8天。在该药物治疗期间，还以1天的间隔给予可降低运动能力并引起神经毒性的MPTP(25mg/kg,Lp.)6次。根据BurnsR.S.等(国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)80，4546-4550，1983)测定自发活动。对照组^皮乡合予生理盐水溶液。图6显示了银杏叶提取物在改善MPTP诱导的运动能力降低的效果。特别地，图6显示了小鼠的自发活动，所述小鼠是被给予测试物(50mg/kg，p.o.)8天，并且被以1天的间隔给予MPTP(25mg/kg，i.p.)6次，所述MPTP能降低运动能力并引起神经毒性。仅给予MPTP的组(絲)显示了运动能力的显著降低，而给予GBE、YY-0924、YY-1224和YY-1824的组(*)显示了运动能力的提高。特别地，给予YY-1224的组(**)在提高运动能力中具有显著优势。<实验实施例6>抗MPTP诱导的多巴胺合酶表达损伤和脑炎症细胞(小胶质细胞)表达的抑制活性多巴胺为重要的信号传递物质，帕金森氏病被报道是由黑质中的多巴胺总量减少引起的。MPTP减少了酪氨酸羟化酶的表达，并在动物试验中广泛用于制造帕金森氏病的模型。通过给予MPTP(F4/80蛋白质的表达的增加)引起小神经胶质细胞的增殖被用于脑部炎症模型。以50mg/kg的剂量，将测试物口服(p.o.)给予C0X-2(+/+)小鼠8天。在所述药物治疗期间，还以1天的间隔给予可降低运动能力并引起神经毒性的MPTP(25mg/kg，Lp.)6次。酪氨酸羟化酶在黑质中的表达以及黑质和紋状体中小胶质细胞的增殖通过Liu,X.H.等.的(脑研究(BrainResearch)，625，29-37，1993)进行评价。对照组被给予生理盐7jc溶液。图7为显微照片，其显示MPTP减少了黑质中酪氨酸羟化酶的表达，而测试物增加了酪氨酸羟化酶的表达。图8是显示了与酪氨酸轻化酶相关的免疫反应的图(Y轴表达酪氨酸羟化酶的细胞数)。MPTP减少了黑质中酪氨酸幾化酶的表达(辦)，而GBE、YY-1224和YY-1824增加了酪氨酸鞋化酶的表&(*，承承,承)图9为显孩i照片，其显示了MPTP增强炎症应答，即增加小胶质细胞在黑质中的增殖，而测试物减少了小胶质细胞的增殖。图10是显示了与小胶质细胞增殖相关的免疫应答的图(Y轴小胶质细胞中特异蛋白质的表达程度，即F4/80，用染色区(coloredarea)和暗区(darkness)作为相对于生理盐水溶液给药组的比率来表示)。MPTP增强炎症应答，即增加黑质中小胶质细胞的增殖(絲)，而GBE、—YY-1224和YY-1824减少了小胶质细胞的增殖(**)。图ll为显微照片，显示MPTP增强炎症应答，即增加小胶质细胞在紋状体中的增殖，而测试物减少了小胶质细胞的增殖。图12为显示了关于小胶质细胞增殖的免疫应答的图(Y轴小胶质细胞的特异蛋白质的表达程度，即F4/80,用染色区和暗区作为相对于生理盐水溶液给药组的比率来表示)。MPTP增强炎症应答，即增加紋状体中小胶质细胞的增殖(##),而GBE、YY-1224和YY-1824减少了小胶质细胞的增殖(**)。通过上述结果，可确定YY-1224和YY-1824可有意义地减少黑质中多巴胺合酶的表达并减少黑质和紋状体中炎症应答。进一步，值得注意的是YY-1224具有显著优良的活性。<实验实施例7>抗曱基苯异丙胺(MA)诱导的多巴胺合酶损伤和小胶质细胞表达的抑制活性。以50mg/kg的剂量，将测试物例如GBE、YY-1224和YY-1824口服(p.o.)给予C0X-2(+/+)小鼠7天。在药物治疗期间，曱基苯异丙胺(MA)也以2小时的间隔(7.5mg/kg，i.p.)被给予4次。评价酪氨酸羟化酶在黑质中的表达和小胶质细胞在黑质和紋状体中的增殖。对照组被给予生理盐水溶液。图13为显微照片，其显示了甲基苯异丙胺减少了在黑质中酪氨酸羟化酶的表达，而测试物增加了酪氨酸轻化酶的表达。图14是显示了关于酪氨酸羟化酶的免疫应答的图(Y轴表达酪氨酸羟化酶的细胞数量)。甲基苯异丙胺减少了黑质中酪氨酸羟化酶的表达(##)，而GBE、YY-1224和YY-1824增加了酪氨酸羟化酶的表达(*，**，*)。图15为显微照片，其显示了曱基苯异丙胺增强的炎症应答，即增加小胶质细胞在黑质中增殖，而测试物减少了小胶质细胞的增殖。图16为显示了关于小胶质细胞增殖的免疫应答的图(Y轴小胶质细胞中特异蛋白质的表达程度，即F4/80,用染色区(coloredarea)和暗区(darkness)作为相对于生理盐水溶液给药组的比率来表示)。甲基苯异丙胺增强了免疫应答，例如黑质中小胶质细胞的增殖(絲)，而GBE、YY-1224和YY-1824减少了小胶质细胞增殖(承承)图17为显微照片，显示了甲基苯异丙胺增强的炎症应答，即增加小胶质细胞在紋状体中增殖，而测试物减少了小胶质细胞的增殖。图18为显示了关于小胶质细胞增殖的免疫应答的图(Y轴小胶质细胞中特异蛋白质的表达程度，即F4/80，用染色区(coloredarea)和暗区(darkness)作为相对于生理盐水溶液给药组的比率来表示)。MPTP增强了炎症应答，即增加紋状体中小胶质细胞的增殖(##),而GBE、YY-1224和YY-1824减少了小胶质细胞增殖(**)。通过上述结果，可确定YY-1224和YY-1824可有意义地减少黑质中多巴胺合酶的表达并减少黑质和紋状体中炎症应答。进一步的，值得注意的是YY-1224具有显著优良的活性。通过使用本发明的银杏叶提取物进行了多种试验，测定其抑制一氧化氮的产生、改善(3-淀粉样蛋白诱导的阿耳茨海默病和MPTP诱导的帕金森病，以及改善曱基苯异丙胺诱导的神经元损伤的活性。结果，YY-1224和YY-1824被证实在抑制一氧化氮增殖中优于标准化的银杏叶提取物。特别地，YY-1224在改善P-淀粉样蛋白诱导的阿耳茨海默病和MPTP诱导的帕金森病中显著优于标准化的银杏叶提取物和对照实施例制备的提取物(YY-0924和YY-1824)。因此，本发明的银杏叶提取物可用于治疗或预防由一氧化氮产生并伴有神经元损伤导致的脑机能障碍而引起的的疾病，例如(3-淀粉样蛋白诱导的阿耳茨海默病和帕金森病。工业实用性如上所述，本发明的银杏叶提取物在抑制一氧化氮产生以及改善阿耳茨海默病和帕金森病中优于常规的银杏叶提取物。进一步地，根据本发明的制备方法，通过简单的步骤一种含有高含量辟内酯的新银杏叶提取物可被直接从银杏叶中提取和纯化，因此显著提高了生产率。本发明公开的该具有新组合的银杏叶提取物能显著良好地改善器质性脑损伤，可被制成粉剂、颗粒剂、片剂、硬胶嚢、软胶嚢或注射剂，可用于治疗或预防阿耳茨海默病和帕金森病或与一氧化氮产生相关的其它多种疾病。权利要求1.一种银杏叶提取物，其用于阿尔茨海默病和帕金森病的预防或治疗，其含有相对于所述提取物总重量的10-14重量％的萜内酯、20-30重量％的银杏黄酮苷和少于5ppm的银杏酸。2.—种从银杏叶中提取和纯化银杏叶提取物的方法，其包括(1)通过将银杏叶浸入选自由丙酮、d-Cs醇及它们的混合物所组成的组中的有机溶剂中，或者浸入20-80体积％所述有机溶剂的含水溶液中，之后在5-140。C下提取并过滤，获得第一提取溶液，(2)通过使用庚烷或己烷对第一提取液进行分级萃取，并弃去溶于庚烷或溶于己烷的部分，获得第二提取液，(3)通过使用体积比为1:2-2:1的丁醇和曱苯混合溶剂对第二提取液进行分级萃取，获得第三提取液，其溶于丁醇-曱苯混合物中，(4)通过将第三提取液置于5-30。C下2-24小时，获得第四提取液，随后过滤，以及(5)将已过滤的第四提取液减压浓缩并干燥所述浓缩物，从而获得用于预防或治疗阿尔茨海默病和帕金森氏病的银杏叶提取物，其含有相对于从银杏叶中得到的提取物总重量10-14重量％的萜内酯、20-30重量％的银杏黄酮香和少于5ppm的银杏酸。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述步骤(3)中丁醇和曱苯混合体积比为1:1。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述银杏叶提取物含有11-13重量％的辟内酯。5.—种银杏叶提取物，其用于阿尔茨海默病和帕金森病的预防或治疗，含有相对于所述提取物总重量10-14重量％的萜内酯10-14重量％、20-30重量％的银杏黄酮苦和少于5ppm的银杏酸，所述提取物按照权利要求2制备。6.根据权利要求1或5所述的银杏叶提取物，其抑制一氧化氮的产生并改善(3-淀粉样蛋白诱导的记忆和认知损害，并改善MPTP诱导的和曱基苯异丙胺诱导的多巴胺合酶减少和神经元中的炎症反应。7.根据权利要求1或5所述的银杏叶提取物，其含有11-13重量％的萜内酯。8.根据权利要求7所述的银杏叶提取物，其含有12重量％的萜内酯。9.一种药物组合物，其每单位剂型含有量为20-240mg的权利要求l或5所述的银杏叶提取物。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其进一步含有至少一种选自由稀释剂、赋形剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂所组成的组中的药学上可接受的载体，并被制成粉剂、颗粒剂、片剂、硬胶嚢、软胶嚢或注射剂。全文摘要本发明涉及一种银杏叶提取物，其包含相对于所述提取物总重量10-14重量％(优选11-13重量％和最优选12重量％)的萜内酯、20-30重量％的银杏黄酮苷和少于5ppm的银杏酸，其在抑制NO(一氧化氮)的产生和治疗阿尔茨海默病和帕金森病中，优于包含标准银杏叶提取物(德国药典2000)的常规银杏叶提取物，并且本发明还涉及其提取和纯化方法以及含有其作为活性组分的药物组合物。文档编号A61K36/16GK101432008SQ200780015327公开日2009年5月13日申请日期2007年4月27日优先权日2006年4月28日发明者李京姬,李龙五,洪准基,金显杓,金暎河,金滢春,金裕鲜申请人:株式会社柳柳制药