耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白FnbA1及制备方法和应用的制作方法

专利名称：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白FnbA1及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药领域，涉及一种耐·甲氧西林金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A活性片段FnBAl重组蛋白，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其在制备疫苗和检测试剂盒中的应用。
背景技术：
抗药性金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus 或Multiple-resistant Staphylococcus aureus,简称 MRSA)是金黄色葡萄球菌的一个独特菌株，能抵抗所有青霉素，包括甲氧西林及其他抗β内醯胺酶的青霉素。MRSA首次发现于1961年的英国，现时已广泛散播，在医院中它更被称为“超级细菌”。目前MRSA已成为全球I⑶病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。2005年美国的MRSA感染监控資料显示，美国全年的严重感染人数为9. 4万多人，致死病例约为1.9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。2010年CHINET耐药监测结果显示MRSA检出率较高，在金黄色葡萄球菌中，其平均检出率为51. 7%。因其传播途径广泛，易暴发流行；又由于其致病性强，呈多重耐药而成为临床上治疗的难点。当前，MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。目前，万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最后一道防线，但1997年以来耐万古霉素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相继被分离出来，可见抗生素的发展远远跟不上细菌耐药性的发展，使得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。美国研发的MRSA疫苗已进入III期临床试验阶段，因此，研发具有自主知识产权的、高效、安全、经济的MRSA疫苗对控制MRSA感染、耐药性发展、生物恐怖防御和提高国际竞争力具有重要意义。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。金黄色葡萄球菌表面的粘附素是一类能够介导细菌粘附与寄主细胞表面进而引发疾病的膜蛋白，其中纤连蛋白结合蛋白A是重要的粘附素之一，能够介导金黄色葡萄球菌结合与细胞表面的纤连蛋白，使细菌黏附于寄主细胞表面，促进细菌对寄主组织的入侵，目前分离到的大多数金黄色葡萄球菌都能够与细胞外基质上的纤连蛋白特异性的结合。

发明内容
针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性，本发明提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A活性片段FnBAl重组蛋白，其可应用于制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。鉴于FnBA蛋白为两次跨膜蛋白，其胞外区对应28-943的氨基酸序列，并且其粘附主要由胞外区的蛋白质发挥作用，为了在最大限度上保持FnBA的结构和功能不发生较大的变化，本发明为将FnBA (其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述，其氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示)截短后进行克隆、表达和保护性免疫的评价，将FnBA截短后的片段命名为FnBAl(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示)。本发明还提供一种用于表达FnBAl重组蛋白的重组表达载体，其包含编码所述FnBAl重组蛋白的核苷酸序列以及载体序列。本发明优选采用PGEX-6P-2载体来构建重组表达载体，表达FnBAl重组蛋白，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体,其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，PGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原 性。因此，本发明还提供一种宿主菌，其导入有上述构建的重组表达载体。本发明还提供一种表达FnBAl重组蛋白的方法，其包含以下步骤I)设计下身弓丨物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码FnBA蛋白活性片段的核酸序列；2)使用步骤I)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白；以及4)纯化重组蛋白。本发明设计的正向引物和反向引物的优选核苷酸序列分别如SEQ ID NO :5和SEQID NO 6 所示。所使用的宿主菌优选大肠杆菌XLl bule。本发明还提供一种FnBAl重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。本发明还提供一种FnBAl重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。本发明采用基因工程技术克隆表达此截短的保护性抗原成分FnBAl蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。FnBAl重组蛋白可以直接与佐剂(如Al (OH)3佐剂、MF59、A1S03、A1S04、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种。本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点1) FnBAl重组蛋白表达质粒在原核表达系统一大肠杆菌中诱导表达；2)选择pGEX载体系列时，FnBAl重组蛋白以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；纯化出来的FnBAl重组蛋白纯度大于95% ；3)FnBAl重组蛋白均能够诱导动物产生特异性的抗体。利用本发明FnBAl重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。


图1是FnBAl基因片段的PCR扩增结果，其中泳道1:核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2 目的基因片段FnBAl (1419bp)。
图2为表达载体pGEX-6p-2-FnBAl (1419bp)的酶切鉴定结果泳道1:核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2 :重组表达质粒pGEX-6p-2_FnBAl经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段4800bp 和 1419bp ；图3表示不同温度下诱导蛋白表达结果泳道10 :蛋白分子量标准(Marker)；泳道1、3、5 :表达载体分别在16°C、25°C、30°C下诱导表达后，在上清中获得的蛋白；泳道2、4、6 :表达载体分别在16°C、25°C、30°C下诱导表达后，在沉淀中获得的蛋白。图4表示含GST标签的融合蛋白酶切结果泳道1:蛋白分子量标准(Marker)；泳道2 :酶切前，含有GST标签的融合蛋白；泳道3 :酶切后，在上清获取的目的蛋白；泳道4 :酶切后，洗漆用于结合表达蛋白的Glutathione Sepharose 4B凝胶柱(beads)获取的目的蛋白；泳道5 :酶切后，非特异性结合在beads的目的蛋白和特异性结合在beads上的酶和GST标签。图5是利用在线生物信息软件对FnBA蛋白跨膜区预测结果图。图6重组表达载体测序后与FnBAl的核酸序列对比结果。
具体实施例方式本发明所使用的菌株与各种试剂如下1.菌株金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；2.试剂质粒pGEX-6p_2、大肠杆菌菌株XL-lblue为申请人教研室保存，prime STAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶 BamH I 和 Not1、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；
质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；T4 DNA Ligase 为 Fermentas 公司产品；谷胱甘妝-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司
女口
广叩O实施例1 :耐甲氧西林金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A活性片段FnBAl活性片段的克隆
1.首先根据MRSA-252 FnBA蛋白全长基因序列，应用生物信息软件进行结构分析，确定需要扩增的FnBAl目的基因片段。2.根据分析结果，采用PCR方法自MRSA-252基因组扩增FnBAl目的基因片段，扩增步骤如下I)设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO :5_6 (下划线示酶切位点碱基序列)FnBAl-F SEQ ID NO 55' -CGCGGATCCATG GGACAAGATAAAGAAGCTGCA-3,BamH IFnBAl-R SEQ ID NO 65' -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTAT CCATTATCCCATGTTAATGTAT-3'Not I2) _80°C冷冻库中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252专用固体培养基上，于37 °C培养过夜，再挑取单菌落接种于MRSA-252专液体体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。3)以MRSA-252全基因组DNA为模板PCR扩增FnBAl基因片段PCR 体系
模板(239.2 ng/μ ) 2.5μ1FnBAl-F (50μΜ) Ιμ FnBA1-R (50μΜ) Ιμ Taq 酶 2·5μ1dNTP 2μ1Buffer 15μ1灭菌双蒸水_26μ1
总体积50μ1PCR扩增反应条件98°C预变性5min，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin30s, 30个循环，72°C完全延伸6min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。
4)使用凝胶回收试剂盒回收FnBAl PCR产物。3. PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下I) BamH I和Not I酶切pGEX_6P_2质粒和FnBAl PCR产物酶切反应体系
权利要求
1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌FnBA蛋白活性片段的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，编码该重组蛋白的核酸序列如SEQID NO:1所示。
3.—种如权利要求1或2所述重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码FnBA蛋白活性片段的核酸序列；2)将步骤I)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白；4)纯化重组蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤I)所述正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 所示。
5.一种表达载体，其特征在于，包含编码权利要求1所述重组蛋白的核酸序列。
6.如权利要求5所述的表达载体,其特征在于，所述表达载体为pGex系列载体、pET系列载体或PQE系列载体，优选为pGeX-6P-2。
7.—种表达如权利要求5或6所述表达载体的宿主菌。
8.如权利要求7所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XLl-blue、BL21系列或HMS174系列，优选为大肠杆菌XLl-blue。
9.权利要求1所述的重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。
10.权利要求1所述的重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1及制备方法和应用。本发明还公开了构建所述重组蛋白的表达载体、转化宿主菌而制备该重组蛋白的方法以及所述重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗以及相关检测试剂盒中的用途。本发明采用上述方法制备的重组蛋白，便于分离纯化而且高效安全，表达量高。动物试验证明制备的重组蛋白可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。
文档编号C12N1/21GK103012568SQ20121037884
公开日2013年4月3日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者邹全明, 樊绍文, 卢陆, 曾浩, 冯强, 吴翼, 蔡昌芝, 董衍东, 鲁东水 申请人:重庆原伦生物科技有限公司, 中国人民解放军第三军医大学