专利名称：预防动物口蹄疫病毒的感染的重组蛋白疫苗及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程领域，具体地涉及基因工程重组蛋白疫苗(下文有时也称为“基因工程重组蛋白”)，特别是涉及一种预防动物口蹄疫病毒感染的由卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的重组蛋白疫苗；编码这种重组蛋白疫苗的核苷酸序列(下文有时也称为“基因”)；“O”型口蹄疫病毒VP1蛋白及其全编码区的核苷酸序列；卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1蛋白的融合方式；含有编码由卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的重组蛋白疫苗的核苷酸的表达载体；含有该表达载体的宿主细胞，以及该重组蛋白疫苗的制备方法；本发明还涉及该基因工程重组蛋白在制备用于预防动物口蹄疫病毒感染的疫苗制品中的用途以及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品。
口蹄疫的病原体是口蹄疫病毒，它是一种滤性小核糖核酸(ssRNA)病毒。口蹄疫病毒一般可分7种类型A、C、O、亚洲一型和南非一至三型。每一型之中又分出很多亚型。一般认为，各型口蹄疫病毒之间不能诱生交互免疫。
FMD病毒的基因组约有7500-8000个碱基，病毒的核衣壳蛋白(亦称壳蛋白，viral capsid protein VP)分四部分，依次为VP4、VP2、VP3、VP1。其中，VP1蛋白可诱导保护性的体液免疫应答，其中的由第135-158位氨基酸构成的肽段具有较强的免疫原性，可以诱发出高水平的蛋白抗体和病毒中和抗体；第141-159之间的肽段被认为是B细胞和T细胞识别的强抗原决定簇。在1982年，Pfaff E，Mussgay M，Bohm HO等第一次证明，根据FMDV的VP1壳蛋白上的一段序列人工合成的小肽能够产生具有保护作用的抗口蹄疫病毒的中和性抗体(Pfaff E，Mussgay M，BohmHO，Antibodies against a preselected peptide recognize andneutralize foot and mouth disease virus，EMBO J 1982；1(7)869-74)。其后，在豚鼠、猪、羊的实验中还发现，仅在FMDV的VP1蛋白的141-160位氨基酸N末端融合了β-半乳糖甘酶的肽段并不能产生持久的免疫原性，然而，通过将VP1蛋白的141-160位氨基酸以某种融合蛋白(例如与乙型肝炎核心抗体)的方式表达于一些载体上(如KLH)，可以明显提高这段小肽的免疫原性。VP1基因编码的重组蛋白在动物体内诱导机体产生全方位的免疫应答(表现为产生特异性的中和抗体、细胞毒T淋巴细胞(CTL)和辅助T细胞(Th)，对口蹄疫病毒具有预防作用。
伴侣蛋白10(Chaperonin 10)是分子伴侣大家族的一个成员。人、牛、鼠的伴侣蛋白10氨基酸序列具有近100％的同源性。实验发现卡介苗伴侣蛋白10在豚鼠体内可以诱导出针对“O1Lausanne”型口蹄疫病毒的抗体。这种伴侣蛋白10肽段的C-末端的组蛋白结构与“O”性口蹄疫病毒的表位相似，这可能是伴侣蛋白10诱发机体对口蹄疫病毒保护性免疫反应的一种机理(Amadori M，Archetti IL，Scaccaglia P，Chaperonin 10 ofmycobacterium tuberculosis induces a protective immune response tofoot-and-mouth disease virus).Arch Virol 1999；144(5)905-19)。
本发明的另一方面是提供一种编码“O”型口蹄疫病毒VP1抗原的全结构基因序列和由其编码的蛋白质的氨基酸的序列。
本发明的另一方面是提供一种编码这种重组蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列。
本发明的另一方面是提供一种含有该核苷酸序列的表达载体。
本发明的另一方面是提供一种含有该表达载体的宿主细胞。
本发明的另一方面是提供一种用卡介苗伴侣蛋白10基因融合口蹄疫病毒VP1基因生产预防口蹄疫病毒感染的基因工程疫苗的方法。
本发明的另一方面涉及该基因工程重组蛋白在制备用于预防动物的口蹄疫病毒感染的疫苗制品中的用途。
本发明的又一方面涉及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品。
因此，正是本发明人经过长期的大量的研究，解决了现有技术中的技术难题，首次开拓性地将卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原相连形成了全新的基因工程重组蛋白，从而提供了全新的用于预防动物的口蹄疫病毒感染的疫苗。
另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和其它具有创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
Code NoA1022，DL 2000；泳道2是caperonin(303bp)。附图
5融合蛋白基因核苷酸酶切琼脂糖电泳图，其中泳道1是PET28+VP1酶切片段(片段大小约650 bp)，泳道2是Mark，TaKaRa Code NoA1033，DL 1500。附图6融合基因表达载体的构建图，其中图6(1)为表达载体上目的基因插入片段的部位及酶切位点，图6(2)为表达载体构建成功后的质粒图谱。
伴侣蛋白10(Chaperonin10)是一种从卡介苗中分离出来的分子量为10kDa的热激蛋白，它具有如SEQ ID NO 14所示的核苷酸序列，SEQ IDNO 15所示的氨基酸序列。
口蹄疫病毒VP1抗原是FMD病毒壳蛋白的一部分，它可诱导机体产生具有保护作用的口蹄疫病毒中和抗体。在本发明中，它具有SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
动物的口蹄疫病毒(FMDV)感染是由FMDV引起的偶蹄类动物共患的接触性传染病，最易感染的动物是牛、猪、羊、鹿等。FMDV是一种滤性小核糖核酸(ssRNA)病毒，病毒颗粒基因组约包含7500-8000个碱基。FMDV主要以唾液的方式传播，传播的速度很快、易形成大面积的流行。
本发明提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白，其中卡介苗伴侣蛋白10可以位于该融合蛋白的氨基端，“O”型口蹄疫病毒VP1抗原位于该融合蛋白的羧基端。本发明的重组蛋白疫苗中，所述的“O”型口蹄疫病毒VP1抗原的编码基因优选地具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，该“O”型口蹄疫病毒VP1抗原优选地具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而卡介苗伴侣蛋白10优选地具有SEQ ID NO15所示的氨基酸序列。本发明的重组蛋白疫苗优选地具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，而其编码基因优选地具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
本发明的重组蛋白疫苗具有选自如下的任一氨基酸序列1)SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；和2)由在严紧的杂交条件下与编码1)的氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
本发明还提供了编码本发明的重组蛋白疫苗的核苷酸序列，该核苷酸序列可以具有选自如下的任一序列1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；和2)由在严紧的杂交条件下与1)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
“O”型口蹄疫病毒来自中国内蒙古金宇集团生物制药厂，其VP1抗原的核苷酸序列由我们自行设计的引物通过逆转录反应及DNA聚合酶链式反应获得(序列如SEQ ID NO5-11所示)。卡介苗伴侣蛋白10是一种来源于卡介苗的基因片段，它在和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原形成融合蛋白后(其基因编码序列和氨基酸序列可以分别如SEQ ID NO3，4所示)，可以诱发机体产生针对FMDV的中和性抗体。
本发明的重组蛋白疫苗可通过本领域已知的方法，例如参考文献Nilsson C，Sutter G，Walther-Jallow L，et al.Immunization with recombinantmodified vaccinia virus Ankara can modify mucosal simian immunodeficiencyvirus infection and delay disease progression in macaques(重组修饰的安卡拉病毒疫苗可以控制恒和猴黏膜免疫缺陷性病毒的感染及延迟疾病的进展)。J Gen Virol 2002 Apr；83(Pt 4)807-18.所述进行生产，以下的实施例详细地例举了一种生产本发明的重组蛋白疫苗的方法。
因此，本发明还提供了含有上述编码本发明的重组蛋白疫苗的核苷酸序列的表达载体；含有该表达载体的宿主细胞，其可以为本领域常规的各种原核细胞，真核细胞或哺乳动物细胞；以及该重组蛋白疫苗的基因工程制备方法。
另外，本发明还涉及该基因工程重组蛋白在制备用于预防动物口蹄疫病毒的感染的疫苗制品中的用途以及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品。本领域技术人员可以理解的是，这些疫苗制品可用本领域周知的各种常规方法制备。
本发明的重组蛋白疫苗可通过皮下注射的方式给动物接种，接种的剂量为100-500μg。为了加强效果，可在第一次免疫后14或21天进行1次加强免疫。
下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
提取卡介苗基因组DNA的方法参照Molecular Cloning一书(J.Sambrook，从哺乳动物分离高分子量DNA(Isolat ion of high-molecular-weight DNA from mammalian cells)，9.16-9.22，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
采用PCR方法自卡介苗分离伴侣蛋白10结构基因。采用的5’端引物序列为5’CCATGGCGAAGGTGAACATCAA 3’(SEQ ID NO12)，3’端引物序列为5’CTAGAATTCCTTGGAAACGACGGCCAGC 3’(SEQ ID NO13)。
所述PCR操作程序是在一500μl微量离心管中加入下列试剂模板cDNA5μl(mmol/L)10×PCR缓冲液 5μl(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl，15mmol/L MgCl2)dNTPs(10mmol/L) 1μl5’端和3’端引物(0.01mmol/L)各 0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl) 0.25μl加去离子水至终体积 50μl混合后加入矿物油3滴反应条件94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。序列如SEQ ID No14所示。实例2采用TA克隆方法克隆PCR产物TA克隆的载体为PMD18-TVector(pMD 18-TVector Code NoD504A，TaKaRa)。方法如下一DNA的回收(下列回收试剂均来自中国大连宝生物工程有限公司，TaKaRa-DNA回收试剂盒Code NoD301)1将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳(1xTAE，150-200mA，20分钟)；2从琼脂糖凝胶上切下含DNA片段的凝胶，放入一离心管中；3加入3倍体积的溶胶液B，45-55°水浴10min使胶完全融化；4将含有DNA凝胶的溶液B移入过滤柱中，室温静止2分钟；5加入500毫升溶液C于过滤柱中，洗脱一次5000g离心60秒，弃滤液；6再次加入500毫升溶液C于过滤柱中，洗脱后同上离心，弃滤液；7将过滤柱至于室温下干燥30-60分钟，加入溶液D30-50毫升，室温静止2分钟；812000g离心1分钟，收集的滤液为含有DNA片段的溶液D；9-20℃保存收集液，备用。二连接反应1取3-5ul上清液电泳，并在紫外灯下观察电泳带，与marker(10ng/ul)相比较，估计回收DNA浓度；2连接反应体系Insert DNA(SEQ ID NO 14) 0.05-0.3pmolpMD18-TVector 0.5-1ulSolution I5ul(Ligation Solutionl Code NoD504A，TaKaRa)DH2O加至 10ul16℃反应1小时三转化转化的方法是将100ul感受态细胞置冰上融化，然后加入3ul DMSO，混合后，加入10μl连接反应液(含重组质粒)，温和混匀，置冰上30分钟；42℃45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟；加入1ml LB培养液，37℃以225rpm的速度摇荡培养1小时；4,000Xg离心10秒钟，弃上清，用200ul LB培养液重悬菌体；将菌液铺于含有适当抗生素的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置10分钟，倒置于37℃孵箱中培养12-16小时。
感受态细胞的制备方法是将大肠杆菌GM109(JM109 Code NoY001，北京鼎国生物)在LB琼脂培养基上划线，37℃培养12-16小时；次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37℃以225rpm速度震荡培养12-16小时；取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃以225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(约3小时)；将菌液冰浴2小时，然后2,500Xg，4℃离心20分钟收集菌体；加入100ml冰冷的Trituration缓冲液(100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸钠，pH5.5)，混匀，置冰上45分钟；1800Xg，4℃离心10分钟，弃上清，加入10ml冰冷的Trituration缓冲液悬浮细胞；按每份200ul分装，4℃可保存1-2周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为15％，置-70℃备用。
四鉴定由北京鼎国生物技术发展中心进行DNA的测序。测序结果无误(具体序列参见SEQ ID No14，其琼脂糖电泳图见附图4)。
五菌种及保存重组质粒冰冻保存于-20℃。含重组质粒的菌株在含20％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。
按常规方法(J.Sambrook，聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamidegel electrophoresis)1.21-1.32，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Molecular cloning，1989)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。实施例3.“O”型口蹄疫病毒RNA的获得利用Trizol试剂(美国Gibco公司产品)提取细胞培养液中的口蹄疫病毒(中国内蒙古金宇集团生物制药厂)的RNA；具体的步骤如下1.将300ul含口蹄疫病毒的细胞培养液与600ul无水乙醇混合后室温静止10分钟，10000Xg离心10分钟。
2.弃上清，用1ml Trizol试剂裂解细胞沉淀，摇动混合后，室温孵育10分钟。
3.加入200ul氯仿震荡混匀15秒，室温3分钟。
4.10000Xg，4℃离心15分钟，将水相转移至另一离心管中，加入500ul异丙醇，混合后室温下沉淀10分钟，10000Xg，离心10分钟。
5.弃上清，加入1ml 75％乙醇，8000Xg，离心10分钟。
6.弃上清，室温下空气蒸发残余乙醇，无色、透明的FMD病毒RNA附着于试管底部。实施例4.采用逆转录反应及两轮PCR获得“O”型口蹄疫病毒的VP1抗原核苷酸序列。一.采用逆转录反应获得“O”型口蹄疫病毒的cDNA逆转录反应的特异性引物由我们自行设计，序列为5’AAAGGCCCAGGGTTGGACTC 3’(SEQ ID NO5)逆转录方法1.在提取的病毒RNA沉淀中加入特异性引物(10uM)1ulDEPC-水 9ul混合后置65℃水浴10分钟，然后冰浴2分钟。2.向上述溶液中加入下列试剂5×逆转录酶缓冲液 4ul(AMV RT 5×Reaction Buffer and Solutions Code NoM5 101，Promegacorporation USA)Rnasin 0.25ul(Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega corporation USA)dNTPs(10mmol/L)4.0ul逆转录酶 0.5ul(AMV-RT Code NoM5101，Promega corporation USA)DEPC-水至终体积为 20ul混合后37℃水浴1小时。3.将上述反应液移入68℃水浴10分钟(灭活逆转录酶)，-20℃保存。二.PCR反应1.第一轮PCR(模板为为“反应一”中获得的口蹄疫病毒的cDNA)引物1的序列为5’GGCTGATTACGCGTACAC 3′(SEQ ID NO6)引物1’的序列为5’AAAGGCCCAGGGTTGGACTC 3’(SEQ ID NO7)第一轮PCR合成的产物的序列是5’ CGCGTCCGACGTCGCCGAAACCACAAACGTGCAGGGATGGGTCTGCTTGTTCCAGATAACACACGGGAAAGCCGACGGCGATGCTCTGGTTGTGCTAGCTAGTGCTGGCAAAGACTTTGACCTACGCCTACCGGTTGACGCCCGCACGCAGACCACCTCTGCGGGCGAGTCCGCGGACCCCGTTACCGCCACCGTTGAGAATTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAGCACACGGATATCTCGTTTATACTAGACAGATTTGTGAAAGTCACACCAAAAGACCAAATCAATGTGCTGGACCTGATGCAGATCCCTGCCCACACTTTAGTAGGGGCCCTCCTGCGGACGGCCACCTACTACTTCTCCGACTTGGAGTTGGCTGTCAAACACGAGGGTGATCTCACCTGGGTTCCGAACGGGGCCCCTGAGACAGCTTTGGACAACACCACCAACCCAACAGCTTACCACAAAGCACCACTCACGCGACTGGCCTTGCCTTACACGGCCCCACACCGCGTCTTAGCGACCGTCTACAACGGAGGTTGTAAGTACAGTGACGCCCGCGTGAGCAACGTGAGGGGTGACCTTCAAGTGTTGGCTCAGAAGGCAAAAAGAGCTCTGCCCACCTCCTTTAACTATGGTGCCATTAAGGCAACCCGGGTGACTGAGTTACTCTACCGAATGAAGAGAGCCGAGACATACTGCCCCAGGCCCCTTCTTGCCATTCAACCGAGTGACGCTAGACACAAGCAGAAGATCGTGGCACCCGCAAAACAGCTTCTGAACTTCGACCTCCTCAAGCTGGCGGGAGACGTC 3’(SEQ ID NO8)2第二轮PCR(模板为第一轮PCR合成的产物)引物2的序列是5’GAATTCACCACCTCTGCGGG 3’(SEQ ID NO9)引物2’的序列是5’AAGCTTCAGAAGCTGTTTTGC 3’(SEQ ID NO10)产物的序列是5’GAATTCACCACCTCTGCGGGCGAGTCCGCGGACCCCGTTACCGCCACCGTTGAGAATTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAGCACACGGATATCTCGTTTATACTAGACAGATTTGTGAAAGTCACACCAAAAGACCAAATCAATGTGCTGGACCTGATGCAGATCCCTGCCCACACTTTAGTAGGGGCCCTCCTGCGGACGGCCACCTACTACTTCTCCGACTTGGAGTTGGCTGTCAAACACGAGGGTGATCTCACCTGGGTTCCGAACGGGGCCCCTGAGACAGCTTTGGACAACACCACCAACCCAACAGCTTACCACAAAGCACCACTCACGCGACTGGCCTTGCCTTACACGGCCCCACACCGCGTCTTAGCGACCGTCTACAACGGAGGTTGTAAGTACAGTGACGCCCGCGTGAGCAACGTGAGGGGTGACCTTCAAGTGTTGGCTCAGAAGGCAAAAAGAGCTCTGCCCACCTCCTTTAACTATGGTGCCATTAAGGCAACCCGGGTGACTGAGTTACTCTACCGAATGAAGAGAGCCGAGACATACTGCCCCAGGCCCCTTCTTGCCATTCAACCGAGTGACGCTAGACACAAGCAGAAGATCGTGGCACCCGCAAAACAGCTTCTGAAGCTT3′(SEQ ID NO11)此序列代表的是两端加入酶切位点的“O”型口蹄疫病毒VP1基因序列。
PCR的反应条件为94℃，30″；55℃，1’；72℃，2’，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。
卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1基因的测序结果表明，所得到的卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1基因和设计的完全一致，具体序列参见SEQ ID NO14和SEQ ID NO16。
用NcoI(Nco I Code NoD1160A，TaKaRa，下同)和EcoRI(EcoRICode NoD1040A，TaKaRa，下同)在37℃消化得自实施例5的伴侣蛋白10连接物，用EcoRI和HindIII(HindIII Code NoD1060A，TaKaRa，下同)在37℃消化得自实施例5的“O”型口蹄疫病毒VP1连接物，时间为2小时。消化产物经琼脂糖凝胶电泳分离。电泳的条件是1％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1小时。20×TAE缓冲液0.8mol/L Tris base，0.4mol/L NaOAc，0.04mol/LNa2EDTA，用冰醋酸调pH 8.3。
在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的DNA电泳带(分别含Chaperonin10和口蹄疫病毒VP1基因)。纯化回收DNA片段(方法同实施例2，电泳图见附图2；附图4)
含卡介苗伴侣蛋白10质粒DNA的消化反应质粒DNA1μg10×缓冲液(10×K buffer LotA1018，TaKaRa)1μl限制性内切酶NcoI(10单位/μl) 1μl限制性内切酶EcoRI(10单位/μl) 1μl用双蒸水补齐至 10μl混合后37℃温育30-120分钟。
含“O”型口蹄疫病毒VP1质粒DNA的消化反应
质粒DNA 1μg10×缓冲液(10×M buffer LotA1032，TaKaRa) 1μl限制性内切酶HindIII(10单位/μl) 1μl限制性内切酶EcoRI(10单位/μl) 1μl用双蒸水补齐至10μl混合后37℃温育30-120分钟。
连接反应质粒DNA(0.5μg/μl) 2μlDNA插入片段(300ng/μl)5μl10×连接缓冲液(T4Ligation Solution LotCA2901，TaKaRa) 1μlT4 DNA连接酶(T4 Ligation Code NoD2011A，TaKaRa)1μl用双蒸水补齐至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小时。
将含卡介苗伴侣蛋白10-“O”型口蹄疫病毒VP1融合基因的重组pET-28a(+)质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(BL21(DE3)Code NoY016，北京鼎国生物，下同)。
鉴定由北京鼎国生物技术发展中心对pET-28a(+)质粒上的含卡介苗伴侣蛋白10-“O”型口蹄疫病毒VP1的融合基因进行DNA的测序。测序结果无误。(具体序列参见SEQ ID No16)。
用酶切的方法(HindIII、EcoRI)对pET-28a(+)质粒上的含卡介苗伴侣蛋白10-“O”型口蹄疫病毒VP1的融合基因进行鉴定，结果切除大小约650bp的片段，证实“O”型口蹄疫病毒VP1连接成功。(附图5)
将单菌落的细菌接种于50ml LB培养基中，于250ml三角烧瓶中，37C水浴震荡培养至OD600为0.6。加入IPT6使其终浓度为1mM，37C水浴震荡培养2-3小时。三角烧瓶于冰上5分钟，4C离心5分钟(5000xg)。吸弃上清，收集细菌，立即使用或冻存。
咪唑洗脱液20mM Tris，pH 7.9，0.5M NaCl1M imidazole，6M urea。实施例8C57小鼠的疫苗免疫一.材料1.C57雌性小鼠(C57小鼠，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供下同)，6-8周龄2.“伴侣蛋白10-VP1”融合蛋白(吉林大学基础医学院分子生物学教研室提供下同)3.PBS二.方法1.将20只小鼠随机分两组，一组为伴侣蛋白10-VP1融合蛋白疫苗免疫组，一组为PBS免疫组，疫苗组于0、14、28天，每只鼠在二下肢股四头肌处共注射“伴侣蛋白10-VP1”融合蛋白疫苗200ug(150ul)，1.3ug/ul；PBS组用同样的方法等量注射PBS。
2.距第三次免疫后6天，小鼠眼球取血约1ml，4000g离心10秒后分离上清。实施例9ELISA检测免疫后的C57小鼠抗体效价一.材料C57小鼠(雄性6-8周龄)、“伴侣蛋白10-VP1”融合蛋白、“HSP-VP1”融合蛋白、PBS、包被缓冲液1％BSA、羊抗鼠IgG-HRP(编号H005北京鼎国生物，下同)、OPD-底物缓冲液(OPD-底物缓冲液CodeNoP002，北京鼎国生物，下同)二.方法1.将纯化后的“HSP-VP1”融合蛋白(6.5ng/ml)。经预实验后，180用包被缓冲液稀释。
2.包被加入96孔板，100ul/孔。4℃，过夜。
3.洗涤洗液洗板3次，5分钟/次。
4.封闭加1％BSA封闭，200ul/孔。37℃，1.5小时。
5.洗涤洗液洗板3次，5分钟/次。
6.加样将PBS免疫及“伴侣蛋白10-VP1”融合蛋白疫苗免疫鼠(免疫方法同前)各10只的血清用样品稀释液做100、200、400、800、1600、3200及6400倍稀释，100ul/孔。设复孔。37℃，60分钟。
7.加酶标抗体将羊抗鼠IgG-HRP(0.1ml，1∶1000)用洗液稀释500倍，100ul/孔。37℃，60分钟。
8.洗涤洗液洗板三次，5分钟/次。
9.显色新鲜配制OPD-底物缓冲液，100ul/孔。室温避光反应10分钟。
10.终止加2mol/L H2SO4，50ul/孔11.测A490。实验结果及结论A490OD值空白对照OD值0.005±0.0005正常对照组稀释度(1∶80)OD值0.213±0.003免疫组稀释度(1∶100)OD值3.564±0.012稀释度(1∶200)OD值2.531±0.023稀释度(1∶400)OD值1.971±0.011稀释度(1∶800)OD值1.003±0.014稀释度(1∶1600)OD值0.899±0.012稀释度(1∶3200)OD值0.719±0.009稀释度(1∶6400)OD值0.621±0.006判断标准用ELISA方法检测免疫血清抗体滴度时，当免疫组不同的稀释度时OD值高于对照组OD值的2倍时，判断为阳性。根据上述标准，当免疫组稀释度为1∶1600时，免疫组OD较对照组OD提高2倍以上，据此判断免疫组的有效抗体效价1∶1600。
实验结果表明疫苗免疫组的抗体效价明显高于PBS免疫组。
序列表<110>北京迪成华宇生物技术有限公司<120>预防动物口蹄疫病毒的感染的重组蛋白疫苗及其用途<130>I020107<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>639<212>DNA<213>Foot-and-mouth disease virus<220><221>CDS<222>(1)..(639)<223><400>1acc acc tct gcg ggc gag tcc gcg gac ccc gtt acc gcc acc gtt gag48Thr Thr Ser Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu1 5 10 15aat tac ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc cag cac acg gat atc96Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ile20 25 30tcg ttt ata cta gac aga ttt gtg aaa gtc aca cca aaa gac caa atc144Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile35 40 45aat gtg ctg gac ctg atg cag atc cct gcc cac act tta gta ggg gcc192Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala50 55 60ctc ctg cgg acg gcc acc tac tac ttc tcc gac ttg gag ttg gct gtc240Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Leu Ala Val65 70 75 80aaa cac gag ggt gat ctc acc tgg gtt ccg aac ggg gcc cct gag aca288Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu 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1.一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白。
2.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其具有选自如下的任一氨基酸序列1)SEQ ID No4所示的氨基酸序列；和2)由在严紧的杂交条件下与编码1)的氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
3.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中所述的“O”型口蹄疫病毒VP1抗原具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
4.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中，“O”型口蹄疫病毒VP1抗原的编码序列是具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
5.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中，卡介苗伴侣蛋白10位于该融合蛋白的氨基端，“O”型口蹄疫病毒VP1抗原位于该融合蛋白的羧基端。
6.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，它具有SEQ ID No4所示的氨基酸序列。
7.编码权利要求1至6中任意一项所述的重组蛋白疫苗的核苷酸序列。
8.按照权利要求7所述的核苷酸序列，其具有选自如下的任一序列1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；和2)由在严紧的杂交条件下与1)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
9.按照权利要求7所述的基因，它具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
10.含有权利要求7-9中任一项的核苷酸序列的表达载体。
11.含有权利要求10表达载体的宿主细胞。
12.按照权利要求11所述的宿主细胞，其为原核细胞，真核细胞或哺乳动物细胞。
13.一种制备权利要求1-6中任一项的重组蛋白疫苗的方法，包括培养如权利要求9或10所述的宿主细胞。
14.权利要求1-6中任一项所述的重组蛋白在制备用于预防动物口蹄疫病毒的感染的疫苗制品中的用途。
15.一种用于预防动物口蹄疫病毒的感染的疫苗制品，含有权利要求1-6中任一项所述的重组蛋白和载体或赋形剂。
全文摘要
本发明提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白；这种重组蛋白疫苗的氨基酸序列及其编码核苷酸序列；“O”型口蹄疫病毒VP1蛋白及其全编码区的核苷酸序列；含有卡介苗伴侣蛋白10和“O”型口蹄疫病毒VP1抗原融合而形成的融合蛋白的编码核苷酸的表达载体；含有该表达载体的宿主细胞，以及该重组蛋白疫苗的制备方法。本发明的融合蛋白在应用于动物后可有效地预防口蹄疫病毒的感染。
文档编号C12N15/31GK1465402SQ0214133
公开日2004年1月7日 申请日期2002年7月5日 优先权日2002年7月5日
发明者王丽颖, 马克威, 于永利 申请人:北京迪威华宇生物技术有限公司