专利名称：添加剂预混料样品中酿酒酵母的快速定性、定量测定方法
技术领域：
本发明属于饲料科学与饲料添加剂检测技术领域，具体涉及一种添加剂预混料样品中酿酒酵母的快速定性、定量测定方法。
背景技术：
微生态饲料添加剂因其丰富的营养价值和特殊的益生功效以及绿色环保特性而成为预混料领域人们关注的热点。目前市场上的微生态饲料添加剂种类繁多，并且每年以高速度增长。尽管微生态饲料添加剂在畜牧养殖业上的应用日益广泛，但尚未形成统一的质量标准和完善的管理机制，对其质量的监管和认证，尤其在定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法，究其原因是基础研究薄弱，现有检测技术或检测周期长、或不能区分死菌活菌、或成本高，难以建立标准化检测技术。传统方法中对酿酒酵母菌的定性、定量检测，仍采用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离技术的方法。传统方法易受外界环境因素和培养性能的影响，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时耗力。现阶段急需从生产实际出发，逐步建立起科学有效的、易于推广的饲用菌种快速高效标准化检测技术，促进微生态饲料添加剂行业的可持续发展。PCR技术一经出现就被广泛应用于分子生物学和微生物学等领域。实时荧光定量 PCR(Real-time PCR)的出现更是实现了 PCR技术从定性到定量的飞跃，避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题。具有特异性强、重复性好、准确、快速等优点，成为了分子生物学和微生物领域定量检测的重要方法。
发明内容
要解决的技术问题本发明的目的在于提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性测定方法。本发明的另一个目的是提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定量测定方法。本发明采用酿酒种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立简便、快速、准确的添加剂预混料中酿酒酵母快速分子检测方法，可简化酿酒酵母的检测程序、提高检测效率。技术方案本发明是通过下述技术方案实现的本发明提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性测定方法，该方法使用酿酒酵母的DNA为模板，以酿酒酵母的^s rDNA基因序列的种属特异性引物进行种属特异性PCR反应，扩增片度长度为134bp，进而快速定性酿酒酵母；所述的种属特异性引物如下上游引物DZf 5 ’ -CGAGAGACCGATAGCGAACA-3 ’，下游引物 OZr5' -AAGGAGCAGAGGGCACAAA-3，。
进一步，该方法的步骤如下A.模板DNA的制备采用玻璃珠法制备饲料样品模板DNA (1)取Ig含有酿酒酵母菌的预混料样品于1. 5mL离心管中，加入500 μ LPBS悬浮样品，2500 Xg离心3min ；(2)弃上清，加入适量酸洗过的玻璃珠，剧烈震荡aiiin ；(3)加入400 μ L TE及等体积的Tris饱和酚，翻转混勻，15000 Xg离心5min ；(4)转移水相至一新离心管，加入等体积酚氯仿异戊醇=25 24 1的混合物，颠倒混勻，15000 Xg离心5min ；(5)吸上清至一新离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc及2. 5倍体积95%冰乙醇，-20°C过夜；(6) 4"C 15000 Xg 离心 lOmin，弃上清；(7)加入 lmL70% 乙醇，15000Xg 离心 5min，弃上清；(8)37°C放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60 μ L TE中，_20°C保存备用；B. PCR 扩增反应体系25. Ομ L :12. 5μ L 2XPCR_mix、各 1 μ L 10mmol/L 上、下游引物、1 μ L 50ng/ μ L DNA模板、二次蒸馏水补足至25. 0 μ L ；PCR 反应条件94°C预变性 5min，94°C 30s,60°C 45s，72°C 40s，进行；35 个循环， 72°C最终延伸7min，得到的PCR产物，在温度4°C下保存；取5 μ LPCR产物，1 %琼脂糖凝胶电泳进行检测；C.结果及判断检测时设以目的扩增片度的胶回收产物作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模板为阴性对照；根据在134bp处出现预期特征条带，确定该预混料样品中含有酿酒酵母，相反地则不合有酿酒酵母。本发明还提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的快速定量测定方法，该方法以待测样品cDNA和标准品的cDNA为模板，使用定性测定方法中所述的上游引物和下游引物，以相同的体系同时进行酿酒酵母26s rDNA D1/D2的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值进行预混料样品中酿酒酵母的快速定量检测。进一步，该方法的步骤如下A.样品总RNA的制备采用酶法破除酿酒酵母细胞壁，高纯总RNA，快速提取试剂盒提取样品总RNA 样品0. 5-1. Og加入到1. 5mL离心管中，加入600 μ L山梨醇Buffer,加入50U Lyticase,充分混勻30°C处理30min，1500Xg离心IOmin后，弃上清，收集沉淀，提取样品RNA，然后用 DNase I处理两次，得到纯化的RNA样品，使用紫外分光光度仪测定浓度，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后将样本保存于-80°C ；B.反转录扩增(1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物1-5μ g 总 RNA、2y L Oligo (dT) 15,2 μ LdNTP (2. 5mM each)、补 RNase_freeddH20定容至14. 5μ L ；(2)70°C加热5min后迅速在冰上冷却2min，快速离心反应液后加入以下组分 4μ L 5XFirst-Strand Buffer(含有 DTT) ；0. 5μ L RNasin ；(3)加入 1 μ L (200U) TIANScript M-MLV,轻轻用移液器混勻；(4)42°〇温浴50111士11;(5) 95°C加热5min，终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存；(6)用RNase-free ddH20将反应体系稀释到50 μ L。_20°C保存备用；C.荧光定量PCR反应体系25. 0μ L :12· 5μ L 2XSuperReal PreMix(含 STOR Green I)、各 0.75 μ L ΙΟμ θΙ/L 上下游引物 DZf和 DZr，2.0yL cDNA模板、0.5yL 50 X ROXReference Dye、补 RNase—free ddH20 M 25 μ L 体系；荧光定量PCR反应参数95°C预变性15min ；95°C变性10s，60°C退火32s，40个循环；4°C保存；每个样品重复3次；D.外标准品的制备和标准曲线的绘制外标准品的制备利用分光光度计将过夜培养的酿酒酵母菌发酵液稀释至10D， 按照上述提取总RNA步骤并通过反转录扩增获得cDNA，进行10倍系列稀释，梯度稀释至 107-1个酵母cDNA/ μ L的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应；标准曲线的绘制以不同浓度的模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到的酿酒酵母菌的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准；Ε.结果及判断以待测样品cDNA和标准品的cDNA为模板，用酿酒酵母菌的种特异性引物，以相同的体系同时进行酿酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值进行饲料样品中酿酒酵母菌的快速定量检测。有益效果本发明的有益效果是本发明所提供的引物具有特异性强，扩增效率高的特点，可用于快速定性鉴定酿酒酵母菌。本发明利用cDNA的梯度稀释物作为外标准品可以用于区别死活菌，更准确的检测待测样品中的活菌数。本发明可以在不进行酿酒酵母菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测预混料样品中的酿酒酵母菌，整个过程对预混料样品中酿酒酵母的检测程序简单、检测效率高、准确性好，检测周期短的优点；从而为微生态制剂产业的长远发展提供技术保障。
图1 经酿酒酵母菌的种属特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。图2 以DNA为模板的实时荧光定量检测酿酒酵母的标准曲线。图3 以cDNA为模板的实时荧光定量检测酿酒酵母菌的标准曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1 预混料样品中酿酒酵母的快速定性检测该实施例使用目的扩增片段的胶回收产物作为阳性对照；无菌水作阴性对照 ’另外使用从市场收集的两份饲料样品1#和姊、粪肠球菌、毕赤酵母菌作为样品进行。A.模板DNA的制备采用玻璃珠法制备饲料样品模板DNA，具体步骤如下(1)取Ig含有酿酒酵母菌的饲料样品于1. 5mL离心管中，加入500 μ LPBS悬浮样品，2500 Xg 离心 3min ；(2)弃上清，加入适量酸洗过的玻璃珠，剧烈震荡aiiin ；(3)加入400 μ L TE及等体积的Tris饱和酚，翻转混勻，15000 Xg离心5min ；(4)转移水相至一新离心管，加入等体积酚氯仿异戊醇05 24 1)，颠倒混勻，15000 Xg 离心 5min ；(5)吸上清至一新离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc及2. 5倍体积95%冰乙醇，-20°C过夜；(6) 4"C 15000 X g 离心 IOmin,弃上清；(7)加入 1!1^70%乙醇，15000\8离心51^11，弃上清；(8)37°C放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60 μ L TE中，_20°C保存备用。B. PCR 扩增反应体系25. 0μ L :12. 5μ L 2XPCR_mix、各 1 μ L 10mmol/L 上下游弓| 物、 1 μ L50ng/ μ L DNA模板、二次蒸馏水补足至25. 0 μ L ；PCR 反应条件94°C预变性 5min，94°C 30s,60°C 45s，72°C 40s，进行；35 个循环， 72°C最终延伸7min，得到的PCR产物，在温度4°C下保存；取5 μ LPCR产物使用1 %琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压电泳20-30min，EB染色， 紫外拍照。C.目的片段的胶回收纯化采用胶回收试剂盒对目的片段进行切胶、回收、纯化，获得纯化的目的片段。D.结果及判断经酿酒酵母菌的种属特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。泳道 1以目的片段的纯化PCR产物作为阳性对照，泳道2以灭菌水作为阴性对照。一般认为阳性特征在134bp处出现预期扩增条带，说明此样本中含有酿酒酵母菌；阴性对照无特征条带。 泳道3-4为从市场中收集到的饲料样品，结果为阳性性说明这2份饲料样品中含有活的酿酒酵母菌。泳道5-6为酿酒酵母菌外的毕赤酵母和粪肠球菌，结果为阴性，说明引物特异性好，与预期结果一致。实施例2 预混料样品中酿酒酵母的定量测定对实施例1中提到的不同样品进行酿酒酵母菌的定量测定。其测定步骤如下A.样品总DNA的制备采用酶法破除酵母细胞壁高纯总DNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取样品总DNA 样品0. 5-1. Og加Λ到1. 5mL离心管中，加入600 μ L山梨醇Buffer,加入50U Lyticase,充分混勻30°C处理30min，1500Xg离心IOmin后，弃上清，收集沉淀，按高纯总DNA快速提取试剂盒说明书提取样品DNA，使用紫外分光光度仪测定浓度，采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，然后将样本保存于-20°C。B.荧光定量PCR反应体系25. 0μ L :12· 5μ L 2XSuperReal PreMix(含 STOR Green I)、各 0.75 μ L ΙΟμ θΙ/L 上下游引物 DZf 和 DZr，2.0yL DNA 模板、0.5yL 50 X ROXReference Dye、补 RNase—free ddH20 M 25 μ L 体系。荧光定量PCR反应参数95°C预变性15min ；95°C变性10s，60°C退火32s，40个循环；在温度4°C保存；每个样品重复3次。D.外标准品的制备和标准曲线的绘制外标准品的制备利用分光光度计将过夜培养的酿酒酵母菌发酵液稀释至 IOD (约IO7ceIls)，按照上述步骤提取总DNA，进行10倍系列稀释，梯度稀释至IO7-I个酵母DNA/ μ L的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应。以不同浓度的模板为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到的酿酒酵母菌的标准曲线，见附图2。Ε.结果及判断由图2可见，Ct值和不同梯度稀释的模板浓度呈较好的线性关系，以不同浓度的模板为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制出的荧光定量PCR标准曲线方程Υ =-1. 802Χ+26. 115 (Y代表Ct值，X代表模板初始DNA浓度)，模板初始DNA的浓度与Ct值之间线性相关系数为0. 994，斜率为-1. 802，所建立的标准曲线符合Real-Time PCR定量的要求。以待测样品的DNA和标准品DNA为模板，用实施例1描述的酿酒酵母菌的种特异性引物，以相同的体系同时进行酿酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段荧光定量PCR扩增。通过标准曲线和采用ABI公司的7500实时荧光定量PCR仪的计算机软件software v2. 0. 1进行饲料样品中酿酒酵母菌的快速定量检测。这些样品的测定结果与分析误差结果一并列于下表1中。表1样品的Real-time测定结果
权利要求
1.一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性测定方法，其特征在于使用酿酒酵母的DNA为模板，以酿酒酵母的^s rDNA基因序列的种属特异性引物进行种属特异性PCR反应，扩增片度长度为134bp，进而快速定性酿酒酵母； 所述的种属特异性引物如下上游引物DZf5’ -CGAGAGACCGATAGCGAACA-3’，下游引物DZ r 5， -AAGGAGCAGAGGGCACAAA-3，。
2.如权1所述的快速定性测定方法，其特征在于该方法的步骤如下A.模板DNA的制备采用玻璃珠法制备饲料样品模板DNA (1)取Ig含有酿酒酵母菌的预混料样品于1.5mL离心管中，加入500 μ L磷酸盐缓冲液悬浮样品，2500 Xg离心3min ；(2)弃上清，加入适量酸洗过的玻璃珠，剧烈震荡aiiin；(3)加入400μ L TE缓冲液及等体积的Tris饱和酚，翻转混勻，15000 Xg离心5min ；(4)转移水相至一新离心管，加入等体积酚氯仿异戊醇=25 24 1的混合物， 颠倒混勻，15000 Xg离心5min ；(5)吸上清至一新离心管，加入1/10体积3mol/L醋酸钠及2.5倍体积95 %冰乙醇，_20°C过夜；(6)40C 15000 Xg 离心 lOmin，弃上清；(7)加入lmL70%乙醇，15000Xg离心5min，弃上清；(8)37°C放置15!1^11干燥沉淀，沉淀溶于6(^1^TE缓冲液中，_20°C保存备用；B.PCR扩增反应体系 25. 0μ L :12. 5μ L 2XPCR-mix,# 1 μ L 10mmol/L 上、下游引物、1 μ L 50ng/ μ L DNA模板、二次蒸馏水补足至25. 0 μ L ；PCR 反应条件941预变性51^11，941 30s, 60°C 45s, 72°C 40s，进行 35 个循环，72°C最终延伸7min，得到的PCR产物，在温度4°C下保存；取5 μ LPCR产物，1 %琼脂糖凝胶电泳进行检测；C.结果及判断检测时设以目的扩增片度的胶回收产物作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模板为阴性对照；根据在134bp处出现预期特征条带，确定该预混料样品中含有酿酒酵母，相反地则不含有酿酒酵母。
3.一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定量测定方法，其特征在于以待测样品cDNA和标准品的cDNA为模板，使用权利要求1中所述的上游引物和下游引物，以相同的体系同时进行酿酒酵母26s rDNADl/D2的基因片段的荧光定量 PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值进行预混料样品中酿酒酵母的快速定量检测。
4.如权3所述的快速定量测定方法，其特征在于该方法的步骤如下A.样品总RNA的制备采用酶法破除酿酒酵母细胞壁，高纯总RNA，快速提取试剂盒提取样品总RNA 样品 0. 5-1. Og加入到1. 5mL离心管中，加入600 μ L山梨醇Buffer,加入50U溶壁酶，充分混勻 30°C处理30min，1500Xg离心IOmin后，弃上清，收集沉淀，提取样品RNA，然后用DNase I 处理两次，得到纯化的RNA样品，使用紫外分光光度仪测定浓度，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后将样本保存于-80°C ；B.反转录扩增(1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物1-5 μ g 总 RNA、2 μ L Oligo (dT) 15、2 μ LdNTP、补 RNase-free ddH20 定容至 14. 5 μ L ；(2)70°C加热5min后迅速在冰上冷却2min，快速离心反应液后加入以下组分4yL 5 X First-Strand Buffer (含有 DTT) ；0. 5 μ L RNasin ；(3)加入1μ LTIANScript M-MLV，轻轻用移液器混勻；(4)42°〇温浴50111士11；(5)95°C加热5min，终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存；(6)用RNase-freeddH20将反应体系稀释到50 μ L。_20°C保存备用；C.荧光定量PCR反应体系 25. Ομ L :12. 5μ L 2 X SuperReal PreMix、各 0. 75 μ L lOymol/L 上下游引物 DZf 和 DZr，2.0yL cDNA 模板、0.5yL 50XROX Reference Dye、补 RNase-free ddH20 至25 μ L体系；荧光定量PCR反应参数95°C预变性15min ；95°C变性10s，60°C退火32s，40个循环； 4°C保存；每个样品重复3次；D.外标准品的制备和标准曲线的绘制外标准品的制备利用分光光度计将过夜培养的酿酒酵母菌发酵液稀释至10D，按照上述提取总RNA步骤并通过反转录扩增获得cDNA，进行10倍系列稀释，梯度稀释至IO7-I 个酵母cDNA/ μ L的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应；标准曲线的绘制以不同浓度的模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数为纵坐标得到的酿酒酵母菌的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准；Ε.结果及判断以待测样品cDNA和标准品的cDNA为模板，用酿酒酵母菌的种特异性引物，以相同的体系同时进行酿酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值进行饲料样品中酿酒酵母菌的快速定量检测。
全文摘要
本发明属于饲料科学与饲料添加剂检测技术领域，具体涉及一种添加剂预混料样品中酿酒酵母的快速定性、定量测定方法。本发明利用cDNA的梯度稀释物作为外标准品可以用于区别死活菌，更准确的检测待测样品中的活菌数。本发明可以在不进行酿酒酵母菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测预混料样品中的酿酒酵母，整个过程对预混料样品中酿酒酵母的检测程序简单、检测效率高、准确性好，检测周期短；从而为微生态制剂产业的长远发展提供技术保障。
文档编号C12Q1/04GK102296117SQ20111026198
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者刘滢, 刘鹏, 周娜, 彭子欣, 王安如 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 哈尔滨大北农牧业科技有限公司, 漳州大北农农牧科技有限公司