专利名称：突变的青霉素扩环酶及用其制备7－氨基去乙酰氧基头胞菌素酸的方法
技术领域：
本发明系关于对青霉素G具有高底物特异性的突变青霉素扩环酶(expandase)，表达该突变扩环酶之重组细胞，以及用该突变扩环酶制备7-氨基去乙酰氧基头胞菌素酸(7-aminodeacetoxycephalosporanicacid，7-ACDA)之方法。
已报导一种天然酶，去乙酰氧基头孢菌素C合酶(deacetoxycephalosporain C synthase，DAOCS，或扩环酶)可负责扩环反应的催化。链霉菌属(Streptomyces sp.)，例如，带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)、生二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)、教酒链霉菌(Streptomyces chartreusis)，可产生扩环酶。如EP-A-0341892所述，扩环酶可从带小棒链霉菌获得，而且已经被克隆。对扩环酶之化学及功能性质已进行完善研究，参见EP-A-0366354。然而，天然的扩环酶对青霉素G的底物特异性低于对正常底物青霉素N的特异性(Rollins，M.J.等，Can.J.Microbiol.341196-1202(1988)和Maeda，K.等人，Enzyme & MicrobialTechnology，17231-234(1995))。青霉素G可以从商业途径便宜地获得。相反地，青霉素N较贵，而且不易获得。另外，即使将青霉素N扩环，其侧链也无法被容易地除去。因此，工业制备中仍使用7-ADCA的化学合成，而非酶化合成。
有许多关于经由扩环酶产生7-ADCA之申请。USP 5,731,165描述经由针对青霉素G之酶化扩环活性，以及使用表达扩环酶之产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)转化体菌株，而制备和回收7-ADCA之方法。USP 5,559,005揭露制备7-氨基-头孢菌素酸(7-ACA)或7-ADCA之生物方法，其系使用具有扩环酶活性而能接受己二酰-6-氨基-青霉烷酸(己二酰-6-APA)作为底物之转化产黄青霉菌菌株。然而，因为己二酰-6-APA及青霉素G都是天然扩环酶在体外的不佳底物，因此当在活体内应用时，天然扩环酶不太可能具有高扩环效率。
最近，Chin H.S.等人(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，287507-513(2001))揭露一种突变的DAOCS，其包括N304L的氨基酸置换。USP 5,919,680描述一种突变扩环酶，其具有来自天然扩环酶之经改变的氨基酸序列，导致改变的底物特异性。在该专利中，提到几个氨基酸位置，而该藉由改变一或多个所提氨基酸而产生之突变扩环酶在青霉素G和青霉素N的混合物中显示更高的青霉素G对于青霉素N之活性比例，但是对于青霉素G和青霉素N的单独活性则较野生型扩环酶为低。因此，仍需要开发对青霉素G具有更高底物特异性及酶化活性之突变青霉素扩环酶。
本发明之目的为提供突变的青霉素扩环酶，其包括一或多个对应于野生型扩环酶之残基位置的氨基酸置换，其系选自甲硫氨酸73、甘氨酸79、缬氨酸275、亮氨酸277、半胱氨酸281、甘氨酸300、天冬酰胺304、异亮氨酸305、苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188及组氨酸244所组成之群，但在天冬酰胺304的残基位置之氨基酸置换不是N304L以及在半胱氨酸155之残基位置为C155Y，且该氨基酸置换至少含有一或多个选自苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188、组氨酸244及L277Q所组成之群。具体地说，本发明提供突变的青霉素扩环酶，其包括一或多个选自M73T、G79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L、I305M、T91A、A106T、C155Y、Y184H、M188V、M188I、H244Q、H244R及L277Q所组成之群之特定氨基酸置换，其中氨基酸置换的残基位置系对应于野生型的残基位置，但该氨基酸置换至少含有一或多个选自T91A、A106T、C155Y、Y184H、M188V、M188I、H244Q、H244R及L277Q所组成之群。更具体而言，本发明提供突变的青霉素扩环酶，其包括C155Y、Y184H、V275I及C281Y之氨基酸置换。
本发明之另一目的为提供编码突变青霉素扩环酶之分离的核酸分子。
本发明之另一目的为提供包含本发明之核酸分子及经操作而连接于其上的调节序列之重组载体。
本发明之再一目的为提供包含本发明的核酸分子之重组细胞。
另一方面，本发明系提供产生突变青霉素扩环酶之方法。在本发明的一个具体实施例中，该方法包括表达本发明之核酸分子，并回收突变的青霉素扩环酶。在本发明之另一具体实施例中，该方法包括培养本发明之重组细胞以表达突变的青霉素扩环酶，并从细胞培养物中回收突变的青霉素扩环酶。
在另一方面，本发明系提供制备7-ADCA的方法，所述方法包括用突变的青霉素扩环酶处理青霉素G以制备苯乙酰-7-ADCA，接着将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。
在再一方面，本发明系提供制备7-ADCA的方法，所述方法包括以下步骤(a)在适于产生青霉素G和表达突变青霉素扩环酶之条件下，培养经本发明之核酸分子转化的产青霉素G细胞，以使青霉素G被突变的扩环酶扩环，并制备苯乙酰-7-ADCA；(b)将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。
从以下的具体实施方式
和
将完全理解本发明。
图2是本发明的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1和2分别代表分子量标准参照物和YS67突变型之纯化DAOCS。DAOCS加样量是5μg。
图3是本发明的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1是分子量标准参照物。泳道2至5代表与本发明无关的样品。泳道6和7分别代表SC29和SC39突变型之纯化DAOCS。各DAOCS加样量是5μg。
图4是本发明的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1代表分子量标准参照物。泳道2至5代表与本发明无关的样品。泳道6至9分别代表YS98、YS108、YS115和YS125的纯化的DAOCS。各DAOCS的加样量是5μg。
本发明之主要方面为提供突变的青霉素扩环酶，其对青霉素G具有更好的底物特异性，其中该突变青霉素扩环酶包括一或多个对应于野生型扩环酶之残基位置的氨基酸置换，其系选自甲硫氨酸73、甘氨酸79、缬氨酸275、亮氨酸277、半胱氨酸281、甘氨酸300、天冬酰胺304、异亮氨酸305、苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188及组氨酸244所组成之群，但在天冬酰胺304的残基位置的氨基酸置换不是N304L以及在半胱氨酸155之残基位置为C155Y，且该氨基酸置换含有一或多个选自苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188、组氨酸244及L277Q所组成之群。具体而言，本发明提供突变的青霉素扩环酶，其包括一或多个选自M73T、G79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L、I305M、T91A、A106T、C155Y、Y184H、M188V、M188I、H244Q、H244R及L277Q所组成之群的氨基酸置换，但该氨基酸置换含有一或多个选自T91A、A106T、C155Y、Y184H、M188V、M188I、H244Q、H244R及L277Q所组成之群。更具体而言，本发明提供突变的青霉素扩环酶，其包括C155Y、Y184H、V275I及C281Y之氨基酸置换。
本文中所使用的术语「野生型青霉素扩环酶」指从链霉菌属获得的天然青霉素扩环酶。较佳地，该野生型扩环酶从带小棒链霉菌获得。天然青霉素扩环酶及其相对应的基因(cefE基因)已在现有技术(例如EP-A-0366354和EP-A-0341892)中有很好的表征及描述。本领域技术人员可以从现有技术容易地获得野生型青霉素扩环酶之核酸序列及相对应的氨基酸序列。
本发明之突变青霉素扩环酶包括其功能等价物。如本文中所用，突变的青霉素扩环酶的「功能等价物」可包含位于除上述位置之外的位置之其它氨基酸突变(例如缺失、添加或置换)，其中所述之其它氨基酸突变系导致沉默改变，因此基本上不影响突变青霉素扩环酶之功能(例如酶活性)。另外，在突变的青霉素扩环酶「功能等价物」中，特定的氨基酸置换(即选自M73T、G79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L、I305M、T91A、A106T、C155Y、Y184H、M188V、M188I、H244Q、H244R、L277Q)可以与类似特征的导致沉默改变之其它氨基酸置换交换。例如，具有「G79D」氨基酸置换的突变青霉素扩环酶是具有「G79E」氨基酸置换的突变的青霉素扩环酶的功能等价物，因为氨基酸D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)都被归类为酸性氨基酸且性质相似。
在另一方面，本发明系提供编码本发明的突变青霉素扩环酶之分离的核酸分子。本发明之分离的核酸分子系使编码野生型青霉素扩环酶之核酸发生突变而获得。常规的突变诱发技术在本领域是公知的，如用伽玛射线或紫外线照射，或用诱变剂处理，如羟胺(hydroxylamine)和乙基甲烷(ethylmethane)，或定点诱变(site-directed mutagenesis)。本领域技术人员能够选择适宜的突变技术而获得突变的核酸分子。突变的核酸分子可以被进一步克隆并根据它们的生物活性被选择。用来获得本发明之分离的核酸分子的更详细的技术，包括诱变、克隆和生物活性筛选，将在以下实施例中描述。
根据本发明，可以将分离的核酸分子插入载体以形成重组载体。本文所用的术语「载体」指核酸分子，其能够以表达或复制所感兴趣的核酸片段为目的而携带并转移该核酸片段进入宿主细胞。具体而言，载体系指质粒、粘粒、噬菌体或病毒。通常，所感兴趣的核酸片段经操作而被连接至调节序列上，以使例如当引入宿主细胞时，该核酸片段可在调节序列之控制下被表达。调节序列可包括，例如激活子序列(例如巨细胞病毒(CMV)激活子、猿猴病毒40(SV40)早期激活子和T7激活子)、复制起始点及其它调节序列(例如SD序列和终止序列)。较佳地，所感兴趣的核酸片段可以连接于另一核酸片段，以产生融合多肽(例如组氨酸标记的融合多肽)，以利于随后的纯化过程。鉴定和选择调节序列之方法是本领域技术人员所熟知的，并且在文献中有广泛描述。本领域技术人员根据本说明书及现有技术，可容易地构建该重组载体。
本发明之重组载体可并入宿主细胞中，以产生突变的青霉素扩环酶。因此，以重组载体转化之重组细胞系在本发明之范围内。这种重组细胞可以是原核细胞(例如细菌)或真核细胞(例如真菌、动物和植物细胞)。特别地，本发明之重组细胞是产青霉素G细胞，较佳是产黄青霉菌细胞，如下文所述，该细胞可以用于在活体内产生7-ADCA。许多转化技术，如氯化钙处理、钙-PEG过程、电穿孔、DEAE-糊精介导的转染、脂转染和微注射在很多文献中有详述。本领域技术人员可根据宿主细胞及要引入宿主细胞之载体性质选择合适的技术。
本发明还提供产生突变青霉素扩环酶之方法。可在适于表达突变青霉素扩环酶之条件下培养上述重组细胞，然后回收并纯化所表达的扩环酶。本领域技术人员将会理解，回收和纯化方法在很多参考文献中有广泛描述，并且不限于，例如，各种色谱技术(例如HPLC或亲和柱)。
上面所提到的基因工程方法如DNA诱变、克隆、载体构建、转化、蛋白质表达，以及纯化可以由本领域技术人员完成，其可参见，例如，Molecular CloingA Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Frisch和T.Maniatis编着，(1989)。
本发明还涉及制备7-ADCA之方法，所述方法包括用本发明之突变青霉素扩环酶处理青霉素G以制备苯乙酰-7-ADCA，以及将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。特别地，如上所述表达并回收突变扩环酶，然后加入底物青霉素G。将混合物在适于该突变扩环酶之酶活性的条件下进行反应(例如在30℃的温度下)，以便藉由该突变扩环酶进行扩环反应，使底物青霉素G转变为苯乙酰-7-ADCA。较佳地，例如，可通过简单溶剂萃取而纯化苯乙酰-7-ADCA，然后用适宜的酶(例如青霉素酰胺酶，如EP-A-0453047所述)处理，以除去苯乙酰侧链，并获得期望的7-ADCA。另一方面，可以将底物青霉素G直接加入表达本发明之突变扩环酶的重组细胞之细胞培养物中。然后，将所表达的扩环酶和青霉素G反应，并将其转变为苯乙酰-7-ADCA，接着将苯乙酰-7-ADCA去酰化以产生期望的7-ADCA。
已经发现用扩环酶编码基因转化之产青霉素G细胞(例如产黄青霉菌)能够在活体内产生苯乙酰-7-ADCA。因此，本发明之另一方面系提供以产青霉素G细胞制备7-ADCA之方法，所述方法包括以下步骤(a)在适于产生青霉素G及表达本发明之突变扩环酶的条件下培养以本发明之重组载体转化之产青霉素G细胞，以使青霉素G被突变扩环酶扩环，并产生苯乙酰-7-ADCA；(b)将苯乙酰-7-ADCA去酰化以产生7-ADCA。本文所用的术语「产青霉素G细胞」指能够在一般条件下自然地产生青霉素G的细胞，而不用任何基因工程技术(例如转化)。较佳地，产青霉素G细胞是产黄青霉菌细胞。可视需要以过滤及萃取步骤纯化来自步骤(a)之苯乙酰-7-ADCA。详细的过程，如这些细胞之转化和发酵，以及所产生的苯乙酰-7-ADCA之纯化已在前案中描述，如US 5,919,680和EP 5,731,165，这两篇文献引入本文作参考。
用于分离青霉素G和头孢菌素G之TLC方法亦开发用于生物测试筛选分析。以硅胶板60 F254作为固相，而液相是氯仿∶丙酮∶醋酸＝6∶5∶0.5(体积比)的混合物。将C14标记的青霉素G用于以20μg细胞萃取物(用Bio-Rad Bradford试剂盒，以BSA为标准定量)进行的标准分析中，加入乙醇后，混合物不经离心而直接施加于TLC板上。实施例3定点突变从带小棒链霉菌以PCR克隆野生型扩环酶基因(即cefE)，并将其插入pET30a NdeI-Hind III位置，所得到的质粒命名为pYS16。以Quick Change Mutagenesis Kit对pYS16进行定点突变。使用Swiss-PdbViewer(V3.7b2)程序，藉由选择活性中心周围10内的残基及基于DAOCS的晶体结构(Valegard K.等，Nature，394805-809(1998))而选择突变位置。将各位置先转变为Ala残基，然后转变为带正电残基，疏水残基及含硫残基。所用引物乃根据制造商的说明书而设计。所得的突变型均藉由对含有基因的质粒进行DNA定序而确认，并制备其细胞粗萃取物，以进行DAOCS活性分析。实施例4 DAOCS活性分析BL21(DE3)转化体于30℃下，在5ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中生长过夜。将该培养物接种于100ml的相同培养基，并在30℃生长1小时。然后加入0.1mM IPTG，以在30℃间接诱导DAOCS 4小时。收集细胞，用缓冲液A(50mM Mops/pH7.5，1mM PMSF，1mM DTT和0.5μg/ml亮抑酶肽)洗涤，以超声波(VCX750；Sonics & Materials，美国)破菌，在15000xg离心15分钟。将该上清液用作细胞萃取物。
对青霉素G，将20μl细胞萃取物加入到标准200μl测试反应液中，该溶液含有50mM Mops/pH 7.5，4mM抗坏血酸、1mMFeSO4、4mMα-酮戊二酸和7mM青霉素G，并在30℃保温20分钟。接着加入200μl乙醇以终止反应，然后在15000xg离心5分钟。藉由HPLC进样40μl而分析上清液中头孢菌素G的浓度。流动相为含有19％乙腈的25mM磷酸钾/pH 6.5，流速为1ml/min。以215nm波长检测，头孢菌素G的滞留时间是8.5分钟，青霉素G的滞留时间是12.5分钟，藉由LC-MS而确认DAOCS反应中滞留时间为8.5分钟的产物之分子量为332。如此而得到突变型如YS49(L277K)、YS8(I305L)、YS11(I305M)和Y12(N304K)，它们对青霉素G比母菌株YS16具有更高的扩环活性。上述突变的氨基酸之不同组合也是藉由定点突变而构建的。实施例5 DAOCS纯化将待测突变型之细胞萃取物(2ml)加入用缓冲液B(50mMMops/pH7.5，1mM DTT，0.4mM pefabloc SC，0.5μg/ml亮抑酶肽)平衡的HiTrap Q柱(5ml)上。然后用20ml缓冲液B清洗柱，接着用25ml含120mM NaCl的缓冲液B进一步冲洗，然后用20ml含150mM NaCl的缓冲液B将DAOCS冲提下来。合并含DAOCS的部分(10ml)，用UF15装置(NMWL 5K；Millipore)浓缩，并加入于Hiload Superdex 75(16/60)柱上，该柱系经缓冲液B以1ml/min的流速预平衡。经由SDS-PAGE检测，这样纯化出的DAOCS之纯度高于90％，参见图1及图2，立即将其置于1mMDTT和2mg/ml BSA中，于-80℃保存。实施例6纯化的DAOCS之动力学分析按照动力学分析(Kinetic assay)进行标准青霉素G测试，但使用20μg纯化的DAOCS，并将α-酮戊二酸的浓度降低为1mM。藉由Hans-Woolf Plot以三重复实验得到动力学参数。对于用青霉素N作为主要底物的测试而言，将总体积为240μl的反应液在30℃保温10分钟，该反应液含有50mM Hepes/pH7.5，0.4mM抗坏血酸，0.1mMFeSO4，0.1mMα-酮戊二酸，0.1mM青霉素N和0.5μg纯化的DAOCS，然后加入等体积的10mM EDTA/pH7.5，该混合物用UF15装置(NMWL 5K；Millipore)超过滤。滤液经由HPLC分析，用25mM磷酸钾/pH 6.5作为流动相。DAOC和青霉素N的滞留时间分别为12分钟和13.5分钟。所得之各动力学参数列于表1，其中参数的定义和计算可参考Lehninger等人所着之Principles of Biochemistry，2.sup.nd Ed.Worth Publishers，纽约(1993)。
表1青霉素N和青霉素G的动力学参数菌株 Km(mM) Kcat(S-1) Kcat/Km(M-1S-1)青霉素NYS16(野生型) 0.014±0.0060.307±0.038 22000YS5(V275I) 0.012±0.0030.252±0.020 20000YS8(I305L) 0.006±0.0020.284±0.030 44000YS11(I305M)0.012±0.0010.310±0.004 26000YS12(N304K)0.004±0.0010.366±0.023 92000YS125(N304L) 0.018±0.0040.415±0.063 23000YS49(L277K)0.011±0.0050.220±0.042 20000YS53(C281Y)0.006±0.0010.273±0.014 47000YS59(G79E) 0.009±0.0030.178±0.019 20000YS115(M73T)0.006±0.0030.239±0.009 40000YS67(V275I&I305M) 0.013±0.0050.316±0.032 24000青霉素GYS16(野生型)2.58±0.220.0453±0.0010 18YS5(V275I) 1.68±0.200.0502±0.0012 30YS8(I305L) 0.66±0.070.0759±0.0015 115YS11(I305M) 0.75±0.040.1 52±0.0020 194YS12(N304K) 0.22±0.030.0564±0.0003 256YS125(N304L)0.55±0.120.0402±0.0006 73YS49(L277K) 0.72±0.020.0514±0.0008 71YS53(C281Y) 0.68±0.340.0744±0.0033 109YS59(G79E) 0.75±0.020.0315±0.0003 42YS115(M73T) 0.74±0.160.0627±0.0021 85YS67(V275I&I305M) 0.25±0.080.1458±0.0038 583如表1所示，如Kcat/Km(M-1S-1)参数所示，所有突变型对青霉素G的扩环活性均比野生型扩环酶高2至32倍。相比而言，除了突变型YS12(其对青霉素N之扩环活性比野生型YS16高4倍)以外，这些突变型并未导致以青霉素N所得之动力学参数的显著变化。比较本发明的YS12(N304K)和Chin H.S.等(同上)的YS125(N304L)，YS125对青霉素G的扩环活性比野生型扩环酶高4倍，而YS12对青霉素G的扩环活性则比野生型高14倍。
各组合突变型的相对活性参见表2，是根据Chin H.S.等(同上)所用之相对比较法，将野生型DAOCS的活性作为100％。用1mM青霉素G进行分析，其它条件与标准分析相同。表2与野生型相比，纯化的组合突变型的相对活性DAOCS菌株突变位置 相对活性(％)YS16---100YS67275I，305M 500YS74275I，304K，305L 300YS81275I，281Y，305M 1290YS8879E，275I，281Y430YS94281Y，304K，305M 650YS9679E，275I，305M1110YS100 79E，275I，305L470YS7679E，275I，281Y，305L 250YS108 300V 410SC29275I，281Y，300V 620SC3973T，281Y 610实施例7使用PCR之随机诱变如实施例1所提之具有cefE基因之质粒pYB4系作为趋误(error-prone)PCR之模板。Mg2+与Mn2+之比例为12∶1系用于PCR反应中以诱导突变。将突变的cefE基因插入pRT30a之BamHI-HindIII位置，并转化进入BL21(DE3)。使突变的转化体接受实施例2之活性增进分析，而将对于青霉素G具有增进活性之突变型基因转接入pET24a载体之NdeI-HindIII位置或pET24d载体之NcoI-HindIII位置。如此而筛选出下列具有单一氨基酸残基改变之突变型，如YS87(T91A)、YS71(A106T)、YS72(C155Y)、YS110(Y184H)、YS103(M188V)、YS69(M188I)、YS123(H244Q)、YH2(H244R)或EC12(L277Q)。实施例8 DNA改组技术(DNA Shuffling)DNA改组技术系以Stemmer(Stemmer，W.P.C.，1994，Nature(London)370，389-391)所述之方法为基础，但加上一些改变。前述之具有单一残基改变之cefE突变体，连同基于实施例1及3之方法所获得之突变体M73T、G79E、V275I、C281Y、L277K、G300V、N304K、I305L、I305M以及G79E/V275I/C281Y/I305L以PCR获得各基因片段，然后以PCR Clean up-M试剂盒进行清洗，并收集作为DNA改组技术之DNA底物。取大约30μg之DNA底物以1.5单位之DNase I(promega)在总体积为600μl于室温下进行分解。经2％琼脂糖凝胶纯化获得100至300bp之片段，取大约0.5μg之片段进行PCR，在不加入引物之情况下于50μl之总体积进行片段之重组。然后，将此PCR产物取5μl，同时加入适当引物使总体积为100μl，然后进行另一次之PCR反应以获得全长之cefE基因。将重组后之cefE突变体插入pET30a NcoI-HindIII位置并转化进入BL21(DE3)细胞。所产生之转化体接着进行实施例2所述之活性增进筛选分析，再将对于青霉素G具有较高活性之突变体基因转接入pET24d载体之NcoI-HindIII位置。因此而筛选出之突变体为SC59(C155Y、Y184H、V275I及C281Y)。实施例9突变DAOCS之动力学分析实施例7及8之突变型表达出酶DAOCS并经实施例5所述之方法进行纯化。经由SDS-PAGE检测，实施例7及8之突变型DAOCS具有高于90％之纯度(数据未显示)。根据实施例6所述之方法进行纯化的DAOCS之动力学分析。所得之动力学参数之结果显示于表3。相较于野生型YS16，突变型SC59之kcat/Km值具有41倍之增加。表3对于青霉素N及青霉素G之动力学参数菌株 Km(mM)kcat(S-1) kcat/Km(M-1S-1)青霉素NYS69(M188I) 0.011±0.0010.277±0.00425,000YS71(A106T) 0.013±0.0020.277±0.01421,000YS72(C155Y) 0.016±0.0005 0.235±0.00815,000YS87(T91A) 0.009±0.0005 0.247±0.00627,000YS103(M188V)0.047±0.0005 0.084±0.002 2,000YS110(Y184H)0.295±0.0300.048±0.005 163YS123(H244Q)0.009±0.0015 0.260±0.00629,000EC12(L277Q) 0.011±0.0015 0.297±0.02027,000YH2(H244R) 0.008±0.0010.236±0.00530,000SC59(YHIY)*0.092±0.0005 0.048±0.001 521青霉素GYS69(M188I) 1.96±0.090.0507±0.0006 26YS71(A106T) 1.77±0.150.0453±0.0009 26YS72(C155Y) 1.76±0.050.0476±0.0012 27YS87(T91A) 1.36±0.090.0522±0.0004 38YS103(M188V) 0.76±0.170.0456±0.0016 60YS110(Y184H) 0.95±0.050.0798±0.0012 84YS123(H244Q) 1.39±0.090.0698±0.0012 50EC12(L277Q) 1.02±0.020.1036±0.0012 102YH2(H244R) 2.45±0.040.0672±0.0008 27SC59(YHIY) 0.19±0.002 0.1398±0.0015 736数据为三重复实验之平均值±标准误差(SE)*以单字母缩写表示组合突变之氨基酸残基。突变的残基位置如文中所述。
权利要求
1.突变的青霉素扩环酶，其包括在一或多个对应于野生型扩环酶之残基位置的氨基酸置换，其选自甲硫氨酸73、甘氨酸79、缬氨酸275、亮氨酸277、半胱氨酸281、甘氨酸300、天冬酰胺304、异亮氨酸305、苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188和组氨酸244，但在天冬酰胺304之残基位置不是N304L以及在半胱氨酸155之残基位置为C155Y，且该氨基酸置换至少含有一或多个选自苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188、组氨酸244和L277Q。
2.权利要求1的突变的青霉素扩环酶，其中该野生型扩环酶从带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)获得。
3.权利要求1的突变的青霉素扩环酶，其包括在一或多个残基位置之氨基酸置换，其选自M73T、G79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L、I305M、T91A，A106T、C155Y、Y184H、M188V、M188I、H244Q、H244R和L277Q，但该氨基酸置换至少含有一或多个选自T91A，A106T、C155Y、Y184H、M188V、M188I、H244Q、H244R和L277Q。
4.权利要求3的突变的青霉素扩环酶，其包括C155Y、Y184H、V275I及C281Y的氨基酸置换。
5.编码权利要求1的突变的青霉素扩环酶的分离的核酸分子。
6.包含编码权利要求5的分离的核酸分子和调节序列的重组载体。
7.用权利要求5的核酸分子转化的重组细胞。
8.权利要求7的重组细胞，其是产青霉素G细胞。
9.权利要求8的重组细胞，其是产黄青霉菌细胞(Penicilliumchrysogenum)。
10.产生突变的青霉素扩环酶的方法，所述方法包括表达权利要求5的核酸分子，以及回收突变的青霉素扩环酶的步骤。
11.产生突变的青霉素扩环酶的方法，所述方法包括培养权利要求7的重组细胞以表达该突变的青霉素扩环酶，以及从细胞培养物回收突变的青霉素扩环酶的步骤。
12.制备7-氨基去乙酰氧基头胞菌素酸(7-ADCA)的方法，所述方法包括用权利要求1的突变的青霉素扩环酶处理青霉素G以制备苯乙酰-7-ADCA，以及将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA的步骤。
13.产生7-ADCA的方法，所述方法包括以下步骤(a)在适于产生青霉素G和表达突变青霉素扩环酶的条件下，培养用权利要求4的核酸分子转化的产青霉素G细胞，以使青霉素G被突变扩环酶扩环，并制备苯乙酰-7-ADCA；(b)将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。
14.权利要求13的方法，其中产青霉素G细胞是产黄青霉菌细胞。
15.权利要求13的方法，其中通过过滤和萃取步骤回收步骤(a)产生之苯乙酰-7-ADCA。
全文摘要
本发明提供对青霉素G具有更高活性的突变扩环酶(expandase)，以用于制备7－氨基去乙酰氧基头胞菌素酸(7－aminodeacetoxy cephalosporanic acid，7－ADCA)，该突变的扩环酶包括在一或多个对应于野生型扩环酶之残基位置的氨基酸置换，其系选自甲硫氨酸73、甘氨酸79、缬氨酸275、亮氨酸277、半胱氨酸281、甘氨酸300、天冬酰胺304、异亮氨酸305、苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188及组氨酸244所组成之组，但在天冬酰胺304之残基位置不是N304L以及在半胱氨酸155之残基位置为C155Y，且该氨基酸置换至少含有一或多个选自苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188、组氨酸244及L277Q所组成之组。
文档编号C12P35/00GK1446908SQ02141640
公开日2003年10月8日 申请日期2002年9月9日 优先权日2002年3月26日
发明者杨运博, 魏佳俐, 蔡英杰, 许志行 申请人:骏瀚生化股份有限公司