专利名称：Dna水平稻米可口性评价方法，和通过对半粒未去壳/未精碾稻米的分析来选择可口稻米 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA水平的评价稻米可口性和选择可口稻米的方法。确切的说，本发明涉及一种用于筛选可口稻米的，DNA水平的评价稻米可口性的方法。它包括用适合的引物(STS引物)通过PCR扩增提取自稻植株，未去壳稻粒、未精碾稻米、精白米、米饭、米制糕点或者其研碎粉末地DNA，然后在扩增的DNA条带中选择与可口性评价密切相关的DNA条带，将它用作可口性评价的DNA标记来筛选可口的稻米。这里所指的“可口的稻米”意思为口感好、品质高的稻米。
背景技术：
在包括日本的许多国家，稻、小麦和玉米被称作是最重要的3大谷类，是世界上一半以上人口主要粮食的非常重要的组成部分。近来，对于作为粮食的稻米，不仅提高产量很重要，其质量，即米饭的可口性的提高也很重要。就稻米的全球状况来看，软质和芳香稻米，如印度和巴基斯坦的“Basmati370”、泰国的“Jasmine稻米”和日本的“Koshihikari”很受欢迎并且售价很高。
有两种主要的方法可以评价稻米的可口性。其一是通过品尝米饭来评价其食用品质的感官测试(感官测试)；另一是物理化学测试，通过分析稻米或米饭的化学成分并测量其物理性质，根据数据来估计稻米的可口性。这两种方法各有优缺点。因此，目前评价稻米的可口性，使用两种方法之一或两者。
然而，这里感官测试和物理化学测试都需要至少测试50-500g稻米。因此，根据测试方法，不可能从小量，尤其是仅仅一粒稻米来估计某批或某个品种或品系稻米的可口性。
我们，即本发明的发明人迄今为止从事过多种关于稻米可口性评价的研究，并且将其结果公布于出版物，例如《Food Industry》第42卷，第17期，第55-61页。可是，我们的现有各种技术也都是针对感官测试或物理化学测试，而这两种测试都需要有测试一定数量的稻米，因而仍不能通过非破坏地测试很少量尤其是仅仅一个稻米粒来估计稻米的可口性。
到目前为止，我们研究过多种DNA水平的，通过RAPD方法或者使用STS引物的方法来区别稻米品种的技术。我们的研究发表于刊物如《the Journal of the Food Science and Technology in Japan》第46卷，第3期，第117-122页，而且已经对此提交了专利申请(例如，日本专利公开文本第2001-95589号)。然而，我们的这些现有技术都是针对已注册的稻米品种，使用区别品种的，而与可口性无关的DNA标记，用于区别稻米品种。总之，这些技术不属于针对更广范围的稻米，包括世界上多个地区产出的未鉴定品种的稻米、正在培育的新品种稻米和其它市售的却未经可口性评价的稻米的DNA水平可口性评价。
用稻苗和较大量的稻米作样品，以RFLP(限制性片段长度多态性)为基础的遗传标记的研究已经用于寻找稻中抗植物病原菌和害虫的基因。在以RFLP为基础的方法中，用多种限制性内切酶处理样品DNA，得到的DNA片段用于DNA多态性分析。然而这种操作不适用于本发明中使用很少量尤其是一粒稻米作样品的非破坏性稻米可口性评价和可口稻米筛选。
因此，本领域相关技术迄今为止还不能以很少量尤其是一粒稻米作样品并且通过使用DNA标记分析来评价稻米可口性。发明概述
本发明提供一种DNA水平的，以很少量尤其是半粒或一粒稻米作样品的稻米可口性评价方法。这种方法可以在不破坏作为下一代稻植株发育起点的稻粒胚胎的前提下评价稻米可口性，并且筛选可口稻米。
我们，本发明的发明人为实现上述目的进行了刻苦的研究，并且发现，通过从各种稻米样品中分别提取DNA，以适合的引物经PCR扩增这些DNA，然后在所得扩增的DNA条带中选择与可口性评价密切相关的DNA条带，将其作为选择可口稻米的可口性评价的DNA标记，可以从多种稻米样品中筛选出可口稻米。在此发现的基础上我们完成了本发明。
具体来说，该项发明为筛选可口稻米提供一种DNA水平的稻米可口性评价的方法。它包括在STS引物或随机引物存在下通过PCR扩增从稻植物、未去壳稻粒、未精碾稻米、精白米、米饭、米制糕点或者其研碎粉末中提取的DNA，然后在所得扩增的DNA条带中选择与可口性评价密切相关的DNA条带，并且将其用作可口性评价的DNA标记来筛选可口稻米。
在本发明DNA水平稻米可口性评价方法的一个实施方案中， 用于提取DNA的稻米样品是半个不含胚胎的未去壳或未精碾稻米，用由PCR得到的DNA标记筛选出可口稻米之后，带有胚胎的另一半可以萌发并且长成稻植株，因此可以选择性培育这样选出的可口稻米品种。
在本发明DNA水平稻米可口性评价方法的另一个实施方案中，PCR以RAPD或STS引物来实现，并且用与感官测试和/或物理化学测试的可口性评价密切正和/或负相关的DNA条带作为选择可口稻米的可口性评价DNA标记。
在本发明DNA水平稻米可口性评价方法的另外一个实施方案中，选择性使用与感官测试和/或物理化学测试的可口性评价密切正和/或负相关的DNA标记，以样品是否出现该条带为基础筛选可口稻米。
在本发明DNA水平稻米可口性评价方法的另外一个实施方案中，物理化学测试的稻米可口性评价通过测量己熟稻米的性质来实现。
在本发明DNA水平稻米可口性评价方法的另外一个实施方案中，PCR由10到30mer的制备自DNA序列SEQ ID Nos.1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、和86的STS引物来实现。
在本发明DNA水平稻米可口性评价方法的另外一个实施方案中，在PCR中使用选自引物组A6，A7，B1，B7，B18，B43，E22，E30，F6，G4，G22，G28，J6，M2CG，M11，P3，P5，Q16，S13，T8，T16和WK9的一个或多个STS引物。
在本发明DNA水平稻米可口性评价方法的另外一个实施方案中，在PCR中使用选自引物组OPA6，OPB1，OPB18，OPE22，OPF6，OPG4，OPG28，OPM11，OPP3，OPP5，OPQ16和OPT16的一个或多个随机引物。附图简述
图1显示电泳中观察到的DNA条带模式。其中，M表示标记；泳道1是“Koshihikari”；泳道2是“Hitomebore”；泳道3是“Hinohikari”；泳道4是“Akitakomachi”；泳道5是“Kirara 397”；泳道6是“Kinuhikari”；泳道7是“Hoshinoyume”；泳道8是“Haenuki”；泳道9是“Mutsuhomare”；泳道10是“Nipponbare”；泳道11是“Sasanishiki”；泳道12是“Tsugaruroman”；泳道13是“Hanaechizen”；泳道14是“Yumetsukushi”；泳道15是“Hatsushimo”；泳道16是“Asanohikaori”；泳道17是“Tsukinohikari”；泳道18是“Aichinokaori”；泳道19是“Matsuribare”；泳道20是“Akiho”。
图2是展示1997年收获的稻米的可口性实得值与预期值之间相关性的图。
图3是展示1998年收获的稻米的可口性实得值与预期值之间相关性的图。
图4是展示1999年收获的稻米的可口性实得值与预期值之间相关性的图。
图5是展示实施例2中稻米的可口性实得值与预期值之间相关性图。
图6是展示实施例2中分析的稻米的主要组成成分数据的图。
图7是展示实施例3中稻米的可口性实得值与预期值之间相关性的图。
图8是展示实施例4中稻米物理性质的实得值与预期值之间的相关性的图。
图9是展示实施例5中稻米物理性质的实得值与预期值之间的相关性的图。
图10是展示实施例6中稻米物理性质的实得值与预期值之间的相关性的图。发明详述
下文将详细描述本发明。
在本发明中，稻米的可口性用于指示通过煮熟食用精白稻米做成的米饭的可口性。众所周知，米饭的可口性在不同国家和不同地区差异很大，而且随时间变化而变化，取决于用餐时的环境以及评味员是否饥饿等状态。
然而，当许多评味员品尝在同一先定条件下制得的米饭时，他们根据自己的喜好来评价。例如，大多数日本人喜好“软质，粘性并且明亮的米饭”；相反，大多数印度人喜好“难以咀嚼的相对较硬且不粘的米饭”。
这里所指的稻米可口性包含了个人对米饭喜好的不同。因此，例如，可以指由日本谷类调查协会(the Japan Association of GrainInspection)每年在由前农林渔业部国家粮食研究所制定的感官测试方法基础上进行并公布其结果的稻米可口性分级；由各个不同地区的农业试验站的稻育种实验室进行的可口性测试的结果；和下文所述的稻米可口性的物理化学检查的结果。
本发明的稻米可口性的感官检查如下4到50个(通常24个)评味没品尝米饭。这些评味没将被测样品与标准米饭的参考样品作对比，在以下指标“整体评价”、“硬度”“、粘度”、“外观”、“可口性”和“芳香”分别对被测样品给出“不好”、“中等”或者“好”的评价。所有评味没的数据都经过统计处理，通过与平均数据的显著性水平差异或者通过二元配置和离散分析(two-way layout and dispersionanalysis)来评价被测试稻米的可口性。例如，上文所提到的日本谷类检查协会的方法，和由全日本的国家和公共稻育种实验室进行的可口性检查方法都对应于感官检查。
本发明的稻米的物理化学检查用于从其数据估计稻米的可口性，具体如下分析稻米的化学成分，例如，测量它的蛋白含量或者淀粉含量。将稻米粒或米粉暴露于可见光来获得它的近红外光谱。检测米粉的糊化性能。检测米饭的性能。测量米饭的性质。通过多元变量分析如多重回归分析或者神经网络分析(neural entwork analysis)处理各测试结果和数据的解释性变量，得出被测稻米的可口性的估计值。而这就是本发明根据其数据估计稻米可口性的稻米的物理化学检查。
在本发明中，米饭的物理性质的测量如下据认为米饭的硬度和粘度同它的可口性有密切的关系。通过拉伸压缩测量器如稠度测试仪、流变仪、流变记录器(Rheolograph)或者Tensipresser，或者通过粘弹性测量仪，如Rheolographmicro来测量米饭的硬度和粘度。多种米饭样品，例如，大约1-3粒或者更多而且甚至是米团可以用来测试它们的物理性质。
在本发明中，可以使用任何常规方法从稻植株、未去壳稻粒、未精碾稻米、精白米、米饭、米制糕点或者其研碎粉末中提取DNA，例如，使用十六烷基三甲基溴化铵(以下用CTAB方法指代)的方法，碱性SDS法，苯酚法，酶法或者苯甲基氯法。也可以用商业化的DNA提取试剂盒提取DNA。本发明优选使用下文实施例中所说的CTAB法或酶法。
具体例如，将一种CTAB溶液(0.1M Tris-盐酸，2mM乙二铵四乙酸二钠(EDTA)，1.4M NaCl(pH8.0))加入到样品中并搅拌。将样品放进温育箱，并再次加入CTAB溶液，然后保温一定时间来从样品中抽取基因组DNA。
如果样品来自米饭或者米制糕点，它的基因组DNA可以依据日本专利第3048149号中介绍的一种使用酶的方法来提取。具体地，如果样品为粉末，将粉末溶解于缓冲溶液并且用抗热淀粉酶处理，然后从中提取基因组基因。
如果样品来自未去壳稻米或者未精碾稻米，其基因组DNA依照下述方法提取用刀将每一个要测试的未去壳或者未精碾稻米粒切成两半，从不含胚(胚芽)的一半提取基因组DNA并且进行可口性评价。如下文所述，含有胚(胚芽)的另一半稻粒可以萌发并长成稻植株。就这样，可以选择性地培育可口稻米的植株。
如果愿意，还可以通过，例如氯仿/异戊醇处理、或异丙醇沉淀，或者苯酚/氯仿去蛋白法，或乙醇沉淀法等将这样提取的DNA纯化。纯化操作优选使用氯仿/异戊醇处理。具体地，将氯仿/异戊醇(24/1)加入到DNA提取物中，混匀并离心；在其上清液中加入DNA沉淀剂(1％CTAB溶液，20mM Tris-盐酸，10mM EDTA，pH8.0)来沉淀DNA；再次离心并将得到的DNA沉淀用1M的NaCl提取；并且用异丙醇和乙醇漂洗DNA提取物，然后离心收集后溶解在TE缓冲液中。如此操作可以得到纯化的样品DNA溶液。
接下来，将上述方法得到的基因组DNA作为模板，在随机引物存在下进行PCR。这样扩增得到基因组DNA中的碱基序列，用于区分品种并为下一步PCR所需的STS引物的设计提供依据。
本发明中的PCR是指用DNA聚合酶复制DNA的链式反应。PCR的一个循环包括3个步骤变性、退火和链延伸。变性步骤包括存在有多种基因片段(引物)时，以90到96℃之间的较高温度，加热模板DNA使双链模板DNA分离成单个的单链；退火步骤是指在30到75℃使引物结合到DNA上；延伸步骤是指在70到75℃，有耐热DNA聚合酶时，从结合引物的部分起延长DNA分子。本发明以重复20到50个这样的PCR循环来扩增模板DNA大约1,000,000到10,000,000,000倍。
本发明的RAPD方法是检测以随机合成的8到50mer的随机引物PCR扩增的DNA的多态性(形态的多样变化)。
下面介绍本发明使用的随机引物。在以稻米样品提取的基因组DNA为模板DNA的PCR反应中，所用的随机引物与已经变性的单链基因组DNA互补地结合构成一个双链结构，然后这个双链结构就作为模板DNA复制的起点。一般而言，这种随机引物是一种8到50mer的核苷酸，并且是由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)随机键合构成的合成引物。例如，它包括市售的10-mer的随机引物(由Operon生产)和DNA低聚物组(12-mer)(由Wako PureChemical Industries生产)。具体而言，本发明使用一个或多个选自OPA6，OPB1，OPB18，OPE22，OPF6，OPG4，OPG28，OPM11，OPP3，OPP5，OPQ16和OPT16引物组的随机引物，并检查是否存在区别条带。用“1”代表出现区别条带，“0”代表不出现区别条带，将PCR的数据数字化，并且这将是评估被测试稻米样品可口性的解释性变量。
以下介绍本发明所用的STS(序列标记位点)引物。它是一对用以扩增DNA中区别品种的碱基序列的引物。如上文所提，该STS引物是依据能够产生品种区别条带的碱基序列来设计的。而这种碱基序列是以RAPD方法PCR扩增基因组DNA来得到的。具体而言，将被测稻米样品的基因组DNA作模板，用随机引物做PCR，然后将DNA中产生品种区别条带的部分测序。在这个碱基序列中，从该随机引物的正反向端各选8到50个碱基残基来构成一对引物。用这对引物对被测稻粒的模板DNA做PCR来区别品种。
这样，STS引物特异性地选自有多个位点可以结合模板DNA的随机引物。因此，在对模板DNA进行评价可口性的PCR中，这样选出的STS引物选择性地只与模板DNA上能够产生品种区别条带的碱基序列结合。
将由PCR扩增的DNA进行电泳。这是为了从扩增产物中检测有关可口性评价的碱基序列的条带。找到的碱基序列将作为设计所需STS引物的依据。
依据检测到的有关可口性评价的碱基序列的条带，按如下方法构成一对引物
从电泳胶上切下给出可口性评价DNA片段的条带，提取并收集该DNA，并将其转化到大肠杆菌(E.coli)，培养带有该DNA片段的已转化细胞。然后，通过小量制备的碱法从细胞中提取该质粒DNA。再以质粒DNA为模板，经PCR将其扩增，然后使用自动DNA测序仪对其进行测序。
在这些已测序DNA的基础上，设计STS引物。在前面用随机引物做的PCR反应中，稻米样本DNA或模板DNA中包含与随机引物结合的位点的序列应与该随机引物的序列相同或互补(同源)。也即，被切出并提取自模板DNA的，用于高可口性评价的DNA碱基序列(这将作为设计STS引物的依据)，在其两端应分别包含一个与随机引物碱基序列相同或同源的序列部分。
相应地，从高可口性评价DNA碱基序列的正向和反向端，可以设计具有可用于确定可口性稻米的合适序列及合适长度的STS引物。
如上所述，本发明所用的STS引物是一对正反引物(引物对)，并且是先测序根据PCR所得区别条带提取的DNA片段，然后构建其碱基序列，使之5’和3’端之间包含给出区别条带的DNA序列。因此在PCR中，它只能扩增自己中间所包含的给出区分条带的DNA序列。本发明所用的STS引物对优选具有相同或同源序列。
关于STS引物的大小(组成碱基的数量)，希望的是本发明所用为8到50个碱基，更优选15到30个碱基。如果其大小超过该范围，就会因为引物不能很好地与模板DNA结合，并且结合后不能很好地解脱而对反应有所不利，而且DNA在PCR中不能产生区别条带，所以对可口性评价无效。另一方面，如果其大小小于该范围，也会因为引物可能非特异地与其他非所需DNA结合并且发生错配而有所不利，结果不指示目的区别条带的非所需条带的表达频率将增加，对可口性评价无效。毕竟，这些太小的引物对使用多种引物通过PCR方法快速简单地进行可口性评价是无效的。
通过以上述方法实现的PCR实验，我们，该项发明的发明人获得了多种能够有效区别稻品种的可口性评价条带。下面的表1显示一些稻米可口性评价条带与可以依据这些条带彼此区别的稻品种之间的相关性。
在本发明中，可口性评价的DNA条带是指通过PCR扩增，在电泳中能够产生足以从其他不同品种中区别出该稻米样品可口性的模式的DNA条带。
表1-1+PCR后电泳出现区别条带-PCR后电泳不出现区别条带
表1-2+PCR后电泳出现区别条带-PCR后电泳不出现区别条带
表1-3+PCR后电泳出现区别条带-PCR后电泳不出现区别条带
表1-4+PCR后电泳出现区别条带-PCR后电泳不出现区别条带
从这些条带，可以得到多种STS引物。
(1)区别条带A7(0.7kbp)
这个条带由稻品种“Koshihikari”和“Akitakomachi”的扩增DNA获得，但是却特异性地不能从“Nipponbare”和“Asanohikari”中扩增而得。从这个条带A7，设计了一对引物A7F30(SEQ ID No.5)和A7R30(SEQ ID No.6)
然后，从引物的3’端删掉一定数量的碱基来得到本发明所用的STS引物A7F19(SEQ ID No.7)和A7R16(SEQ ID No.8)
(2)区别条带B43(0.9kbp)
这个条带由稻品种“Koshihikari”，“Hitomebore”和“Sananishiki”的扩增DNA获得，但是却不能从“Kirara397”和“Asanohikari”中扩增而得。从这个条带B43，设计了一对引物B43F30(SEQ ID No.21)和B43R30(SEQ ID No.22)。
然后，从引物的3’端删掉一定数量的碱基来得到本发明所用的STS引物B43F17(SEQ ID No.23)和B43R18(SEQ ID No.24)
(3)区别条带E30(0.85kbp)
这个条带由稻品种“Hitomebore”和“Mutsuhomare”的扩增DNA获得，但是却不能从“Koshihikari”和“Akitakomachi”中扩增而得。从这个条带E30，设计了一对引物E30F30(SEQ ID No.29)和E30R30(SEQ ID No.30)。
然后，从引物中删掉一定数量的碱基来得到本发明所用的STS引物E30F28(SEQ ID No.31)和E30R24(SEQ ID No.32)
(4)区别条带J6(0.9kbp)
这个条带由稻品种“Koshihikari”和“Kirara397”的扩增DNA获得，但是却不能从“Sananishiki”中扩增而得。从这个条带J6，设计了一对引物J6F30(SEQ ID No.49)和J6R30(SEQ ID No.50)。
然后，从引物中删掉一些碱基来得到本发明所用的STS引物J6F18(SEQ ID No.51)和J6R20(SEQ ID No.52)
(5)区别条带M2CG(1.2kbp)
这个条带表示在10mer随机引物上增加了2个碱基，由稻品种“Hitomebore”和“Nipponbare”的扩增DNA获得，但是却不能从“Koshihikari”和“Kinuhikari”中扩增而得。从这个条带M2CG，设计了一对引物M2CGF30(SEQ ID No.53)和M2CGR30(SEQ IDNo.54)。
然后，从引物中删掉一些碱基来得到本发明所用的STS引物M2CGF16(SEQ ID No.55)和M2CGR15(SEQ ID No.56)
(6)区别条带S13(1.8kbp)
这个条带由稻品种“Kirara397”和“Hoshinoyume”的扩增DNA获得，但是却不能从“Nipponbare”和“Asanohikari”中扩增而得。从这个条带S13，设计了一对引物S13F30(SEQ ID No.73)和S13R30(SEQ ID No.74)。
然后，从引物中删掉一些碱基来得到本发明所用的STS引物S13F25(SEQ ID No.75)和S13R24(SEQ ID No.76)
从S13，可以设计出S13F40(SEQ ID No.89)和S13R40(SEQ IDNo.90)。然而，由这些引物去掉一些碱基所构成的S13F12(SEQ ID No.91)和S13R12(SEQ ID No.92)会非特异地与其他非所需DNA结合并且发生错配，结果使不指示目的区别条带的条带表达频率增加。总之，这些引物对用PCR进行稻米可口性评价无效。
(7)区别条带WK9(1.6kbp)
这个条带由稻品种“Hitomebore”和“Akitakomachi”的扩增DNA获得，但是却不能从“Koshihikari”和“Sasanishiki”中扩增而得。从这个条带WK9，设计了一对引物WK9F30(SEQ ID No.85)和WK9R30(SEQ ID No.86)。
然后，从引物中删掉一些碱基来得到本发明所用的STS引物WK9F20(SEQ ID No.87)和WK9R20(SEQ ID No.88)
为了得到本发明所用的STS引物，从上述特异设计的引物中删掉一些碱基。简而言之，扩增提取自某稻米样品的DNA模板，并且依据扩增的DNA来设计一对引物。从这样设计的引物对中删掉不必要的碱基来得到每个长15到30碱基的所需STS引物。
可以以任何常规方式，用适合的限制性内切酶来实现碱基删除。
具体来说，从引物对A6F30(SEQ ID No.1)和A6R30(SEQ ID No.2)；A7F30(SEQ ID No.5)和A7R30(SEQ ID No.6)；B1F30(SEQ ID No.9)和B1R30(SEQ ID No.10)；B7F30(SEQ ID No.13)和B7R30(SEQ ID No.14)；B18F30(SEQ ID No.17)和B18R30(SEQ ID No.18)；B43F30(SEQ IDNo.21)和F43R30(SEQ ID No.22)；E22F30(SEQ ID No.25)和E22R30(SEQ ID No.26)；E30F30(SEQ ID No.29)和E30R30(SEQ IDNo.30)；F6F30(SEQ ID No.33)和F6R30(SEQ ID No.34)；G4F30(SEQ IDNo.37)和G4R30(SEQ ID No.38)；G22F30(SEQ ID No.41)和G22R30(SEQ ID No.42)；G28F30(SEQ ID No.45)和G28R30(SEQ IDNo.46)；J6F30(SEQ ID No.49)和J6R30(SEQ ID No.50)；M2CGF30(SEQID No.53)和M2CGR30(SEQ ID No.54)；M11F30(SEQ ID No.57)和M11R30(SEQ ID No.58)；P3F30(SEQ ID No.61)和P3R30(SEQ IDNo.62)；P5F30(SEQ ID No.65)和P5R30(SEQ ID No.66)；Q16F30(SEQID No.69)和Q16R30(SEQ ID No.70)；S13F30(SEQ ID No.73)和S13R30(SEQ ID No.74)；T8F30(SEQ ID No.77)和T8R30(SEQ IDNo.78)；T16F30(SEQ ID No.81)和T16R30(SEQ ID No.82)；WK9F30(SEQ ID No.85)和WK9R30(SEQ ID No.86)，依照上述方法去掉不必要的碱基来获得每个由15到30个碱基构成的STS引物。本发明从这组STS引物中选用了至少2对引物。
相应地，本发明所用的STS引物是至少2个或多个选自下述组中的寡核苷酸A6F21(SEQ ID No.3)和A6R22(SEQ ID No.4)；A7F19(SEQID No.7)和A7R16(SEQ ID No.8)；B1F25(SEQ ID No.11)和B1R20(SEQID No.12)；B7F22(SEQ ID No.15)和B7R17(SEQ ID No.16)；B18F15(SEQ ID N0.19)和B18R21(SEQ ID No.20)；B43F17(SEQ ID No.23)和B43R18(SEQ ID No.24)；E22F20(SEQ ID No.27)和E22R21(SEQ IDNo.28)；E30F28(SEQ ID No.31)和E30R24(SEQ ID No.32)；F6F25(SEQID No.35)和F6R22(SEQ ID No.36)；G4F18(SEQ ID N0.39)和G4R24(SEQ ID No.40)；G22F27(SEQ ID No.43)和G22R23(SEQ IDNo.44)；G28F17(SEQ ID No.47)和G28R28(SEQ ID No.48)；J6F18(SEQID No.51)和J6R20(SEQ ID No.52)；M2CGF16(SEQ ID No.55)和M2CGR15(SEQ ID No.56)；M11F20(SEQ ID No.59)和M11R20(SEQID No.60)；P3F20(SEQ ID No.63)和P3R15(SEQ ID No.64)；P5F20(SEQID No.67)和P5R25(SEQ ID No.68)；Q16F25(SEQ ID No.71)和Q16R20(SEQ ID No.72)；S13F25(SEQ ID No.75)和S13R24(SEQ ID No.76)；T8F22(SEQ ID No.79)和T8R25(SEQ ID No.80)；T16F24(SEQ ID No.83)和T16R26(SEQ ID No.84)；WK9F20(SEQ ID No.87)和WK9R20(SEQID No.88)
本发明所用STS引物不限于以上所述的那些。考虑其用于稻米可口性评价的能力和解链温度(Tm)，可以设计任何其他额外的适合于本发明的STS引物，并可以用于本发明。
Tm对应于DNA的双链彼此分开时的温度。一般来说，所用引物的Tm或者其左右的温度适合作为PCR反应的退火温度。在本发明的方法中，对于联合使用的STS引物，专门选用有相近Tm的STS引物，适当地确定方法中对DNA做PCR的退火温度，使其在所用STS引物的Tm附近。因此，本发明的方法能够以分开使用STS引物的操作，在一个或较少的PCR循环中得到所需要的区别条带。
具体来说，期望本发明所用每个STS引物的Tm值与STS引物Tm的平均值的差不大于15℃(±15℃)，并且PCR反应的退火温度也在这个范围内。
PCR的退火温度比所用STS引物的平均Tm值低15℃或更多将对反应有所不利，因为不应产生出区别条带的品种在PCR中可能也会产生出这些带来。另一方面，PCR的退火温度比所用STS引物的平均Tm值高15℃或更多也将对反应有所不利，因为一些在PCR中应该出现的区分条带可能不见了。
如果选择合适，STS引物就能在PCR中选择性地只与DNA中能够产生可口性评价条带的碱基序列位点结合。
本发明可以使用这样的一种或多种不同类型的STS引物。
本发明中使用不同类型的STS引物是指在一个相同的区别品种的PCR反应中使用选择的不同STS引物。本发明可以使用适当选择的引物的组合(一套引物)并且在电泳结果中出现对应每个引物的区别条带。本发明可以联合使用一套不同的STS引物来区别稻品种。
所制备的所有STS引物不能够无条件联合使用。联合使用STS引物，必须选择合适的引物，而且以合适的比例来混合，要考虑到所要联合使用的引物不会形成引物二聚体，而且出现的区别条带相互不重叠。适当地组合多种STS引物，并使用这样组合的STS引物可以不必对每一个引物都做PCR，而且可以在一个PCR反应中简单准确地对多个稻品种进行一一区分。由此，本发明很大程度地节约了稻米品种鉴定劳力，时间和成本。
下面介绍本发明用于筛选可口稻米的DNA水平的稻米可口性评价方法。该方法包括，在STS引物存在下经PCR扩增提取自稻植物、未去壳稻粒、未精碾稻米、精白米、米饭、米制糕点或者其研碎粉末的DNA，从所得扩增的DNA条带中选择与可口性评价密切相关的DNA条带，然后将其用作可口性评价的DNA标记来筛选可口稻米。
对依据这种方法进行的稻米可口性评价，如表1中通过PCR指示区别条带存在与否的数据被数字化。具体地将其二进制化，“1”代表PCR后电泳中出现区别条带；“0”代表条带不出现。对于稻米可口性数字化，可以使用直接将稻米样品的感官可口性检查结果和物理化学检查数据进行数字化的方法。另外的方法还有例如根据《稻米可口性分级》(Rice Palatability Ranking)(2001，由日本谷类调查协会发表)数字化所尝稻米样品可口性，特别A级是5分，A级为4分，A’级为3分，B级为2分，B’为1分。可以使用的方法还有根据《稻米品种百科全书2》(Encyclopedia of Rice Varieties 2)(1999，稻米数据库发表)来数字化所尝稻米样品的可口性的方法，其中五星级为5分，四星级为4分，三星级3分，两星级2分，一星级1分，这样数字化后，这种方法得到的数据可以与上文稻米可口性分级的数据结合，然后每个被测试稻米品种的数据总和指示其可口性评价。
稻米样品用STS引物或随机引物做PCR后是否出现区别条带的数据经过这样数字化得到的分值成为解释性变量(explanatory variables)；由任何可口性检查，感官检查或物理化学检查所得的数据作为反应性变量(response variables)。这些变量通过多变量分析，如多重回归分析等得出可口性评估等式。从这个可口性评估等式计算出每种被测稻米样品的多重相关函数(multiple correlation function)。以此为基础，被测稻米被判定为是否可口稻米。
可口性估算等式一般由多重回归分析得到。此外，还可以通过任何其他多变量分析得到，例如，主成分分析，聚类分析，PLS分析或神经网络分析(neural network analysis)。
例如，本发明对稻米可口性的多重回归分析可以按如下进行构成下述等式的一个线性多重回归模型。在此，y表示可口性评价的反应性变量；x1，x2，x3，....xp表示对应从1到数量p的引物是否出现区分条带的解释性变量；而x11，x21，x31，....xp1表示从1到数量p的个体对应反应变量y1，y2，y3，....yp的解释性变量。
yi＝k+a1x1i+a2x2i+a3x3i+....+apxpi
当未知常数k和回归系数a1，a2，a3，...ap被确定后，就可以求出对应于任何所得解释性变量x1，x2，x3，....xp的反应性变量的估计值。
应该以最小化预测误差(即预测值与实得值的差值)的平方和的方式来确定回归系数a1，a2，a3，...ap。具体是，以最小化下列式子来写出(p+1)维的联立方程，就得到它们关于回归系数a1，a2，a3，...ap的解。在回归方程中代入回归系数就得到常数k。
预测误差
＝∑[yi-(k+a1x1i+a2x2i+a3x3i+....+apxpi)]2，其中i值在1到p之间。
接下来介绍本发明选择可口稻米的方法。在选择可口稻米的方法中，用不含胚(胚芽)的半粒未去壳或未精碾稻米样品提取DNA。具体来说，将要测试的一粒未去壳或未精碾稻米用刀片切成两半，从不含胚(胚芽)的一半提取基因组DNA。将这样提取的DNA作为模板，用STS引物等多种引物进行PCR。
然后，通过电泳分析由PCR扩增得到的DNA的模式。通过这些操作，在被测试的未去壳或未精碾稻米样品中筛选出那些含有较多可口稻米特异的区别DNA标记而含有较少非可口稻米特异的区别DNA标记的稻米样品。
对于用于可口性评价的DNA标记，一般使用可口稻米品种特异的DNA条带，或非可口稻米特异的DNA条带，不过，也可以使用除此以外的其他任何条带。
依上述方法用可口性评价DNA标记筛选出可口稻米之后，将剩下的含有胚(胚芽)的半粒未去壳或未精碾稻米萌发，使其长成稻植株，这样选择性地培育已选出的可口稻品种。
萌发含有胚(胚芽)的半粒未去壳或未精碾稻米，使之长成稻植株，并收获下一代稻的种子。例如，这以下文所述方法实现用1％的次氯酸钠溶液将含有胚(胚芽)的半粒稻米的表面消毒，然后将其放入具有例如如下组成的培养基中在30℃萌发。这些是萌发的半粒已选出的可口稻米。
培养基成分(1升，pH5.8)
琼脂糖 8.000g
硫酸铵 0.463g
硝酸钾 2.830g
氯化钙 0.166g
硫酸镁 0.185g
磷酸二氢钾 0.400g
硫酸铁 0.278g
EDTA二钠0.373g
烟酸0.250mg
维生素B60.250mg
维生素B10.500mg
氨基乙酸 1.000mg
将发芽的半粒稻米转移到人工气候室，在那里于28℃以光照10小时，暗14小时的循环培养，使其长成绿色小苗。接着，将小苗移种到含有相同培养基的农用小盆中生长，然后移植到育苗混合肥料中，继续在人工气候室生长约2周。长好后，将苗转移到填有盆栽混合肥料的瓦格纳盆中，在人工气候室培养约4个月，那时这些苗就开始抽穗了。继续培养约40天直到稻穗成熟。然后，收割成熟的稻穗，打谷，去壳。
将去壳的稻粒精碾并磨成粉，然后以上面介绍的方式用CTAB法从中提取DNA。由这些DNA做模板，用STS引物等多种引物做PCR，然后电泳。以扩增的DNA在电泳中是否出现可口性评价的DNA条带为基础，写出该样品的可口性估算等式。根据该等式，判定该样品是否为可口稻米。
未精碾稻米样品可以在实验室的稻米磨上精碾，并通过感官检查或物理化学检查来测试它的可口性。
除上述方法以外，用半粒未去壳或未精碾稻米培育并筛选可口稻米还可以依据下述方法进行。根据传统方法，将被测稻米粒浸泡于40℃温水，去雄，并用父系花粉授粉。栽培在花盆，授粉的稻粒产生F1种子，取一些作样品。每个样品稻粒，未经去壳或抛光的，切成一半含有胚(胚芽)，另一半不含胚。在研钵中研碎不含胚(胚芽)的半个稻粒，并用CTAB法提取DNA，作为PCR的模板。
使用多种引物如STS引物等对模板DNA做PCR，然后电泳分析扩增的DNA。将电泳中是否出现可口性评价DNA条带数字化为“1”或“0”。简单的说，就是将电泳数据二进制化为1表示PCR后电泳中出现区别条带(+)；和0表示PCR后电泳中未出现区别条带(-)。
根据上述《稻米可口性分级》(2001，由日本谷类调查协会发表)和《稻米品种百科全书2》(1999，稻米数据库发表)的方法，以及由物理化学检查或对上文所提稻米物理性质的测量的数字化数据，进行的可口性的数字化方法也应用于对稻米可口性评价。
这样根据PCR中是否出现区分条带来数字化的稻米样品的数据是解释性变量；由可口性检查或物理化学检查得到的数据是反应性变量。这些变量通过多变量分析如多重回归分析来得出可口性评估等式。根据可口性评估等式，计算出每种被测稻米样品的多重相关函数。以此来判定被测稻米是否为可口稻米。简单来说，将PCR后电泳是否出现区分条带的结果二进制化，然后代入可口性估算等式来算出估计的可口性数据。选择可口性数据估计值较高的种子或者根据模板DNA判断其米饭将具有适合的物理数据的种子为可口稻米。选择根据模板DNA判断其米饭将具有适合的物理数据的种子，例如，将粘度/硬度值较高的那些选给日本人，而硬度值较高的选给印度人。
根据上文所述方式，将如此选出的种子的含有胚(胚芽)的一半播种，发芽，移植并栽培，然后从栽培的植株上收获成熟的种子。将这样获得的可口稻米的F2代以普通方式自花授粉建立品种，这样就从半粒未去壳或未精碾稻米选择并栽培出可口性稻。
根据本发明的方法，可以推测与稻米可口性密切相关的稻米植株，稻米种子，稻米和稻米加工产品的物理化学数据及米饭物理数据。这个可口性评价方法使用较少量的稻米，例如，仅一粒或半粒稻米就已足够。因此，本发明能够通过测试半个未去壳或未精碾稻米来推测稻米可口性，由此来筛选可口稻米，并且剩下的半粒仍可以发芽并长成稻植株。这样长成的稻植株的种子仍可以经过本发明的处理方法筛选可口稻米。
而且，本发明的方法适用于世界上不同国家产出的多种稻米品种。实施例
参考下述实施例，进一步详细介绍本发明。不过，这些实施例并不限制本发明的范围。
实施例1(以感官检查所得数据为反应性变量，对未知样品应用PRC法米饭可口性估算等式)
1999年日本收获的前20种最好品种的大米，“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Hinohikari”，“Akitakomachi”，“Kirara 397”，“Kinuhikari”，“Hoshinoyume”，“Haenuki”，“Mutsuhomare”，“Nipponbare”，“Sasanishiki”，“Tsugaruroman”，“Hanaechizen”，“Yumetsukushi”，“Hatsushimo”，“Asanohikari”，“Tsukinohikari”，“Aichinokaori”，“Matsuribare”和“Akiho”全部未精碾，进行了测试。使用一个实验室大米磨，(Yamamato Seisakusho’s RicepalVP31T)，这些大米磨成精白米产率为90％。
将每种精白米样品的一个稻粒放到一个1.5ml的塑料管(Assist生产)，然后加入35μl去离子水。将管子在一个台子上放置1小时，稻粒吸收里面的水。打开管子，将样品稻米放入一个做米饭的电饭煲(东芝RC-183，外夹层加入75ml去离子水)，煮15分钟，再焖15分钟，来制得米饭样品。
依下述方法提取每种样品的DNA将每个米饭粒放在一个微型试管，加入300μl，100mM的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0，含100mM的NaCl)，并在沉淀混合器(Contes)中捣碎。然后，加入5μl耐热淀粉酶，α-淀粉酶(Sigma生产，790单位/mg固体，1mg/ml)，60℃反应1小时。接着，向其中加入5μl，Tritirachium album的蛋白酶K(Onko生产，20mg/ml)，于37℃反应2小时。
酶反应之后，向每个样品中加入1ml冷却至-20℃的乙醇，并于-20℃放置15分钟。用微型离心机离心(15000 G，4℃，15分钟，下述离心条件皆同此例)来分离出沉淀残余物。用300μl TE(10mM Tris-盐酸，pH8.0，1mM EDTA)溶解沉淀，再加入400μl苯酚。为抽提DNA，将其在旋转搅拌器上搅拌30分钟。
然后，离心(15000G，4℃，15分钟)收集上清，并向上清液加入等体积PCI(苯酚/氯仿/异戊醇，25/24/1)。同抽提DNA一样(将其在旋转搅拌器上搅拌)处理30分钟，之后离心(15000G，4℃，15分钟)收集上清。向其中加入6ml，5M的NaCl和400μl冷却的乙醇。然后离心，并用70％的乙醇清洗所得沉淀。将最后的沉淀溶解在40μl，10倍稀释的TE中，制得DNA样品溶液。
它的PCR反应按下述方法进行
依上述方法，从每种米饭样品中提取的DNA模板经PCR反应扩增。PCR反应物组成混合0.2μl Taq多聚酶(Takara Bio Inc.生产，5u/μl)，2.5μl PCR缓冲液(12mM Tris-盐酸，60mM KCl，pH8.3)，2.0μl MgCl2，1μl模板DNA(200ng/μl)和1μl dNTPs(100μM)。PCR所用STS引物为每种0.4μl的A6F21和A6R22(SEQ ID No.3和4)；每种0.5μl的A7F22和A7R17(SEQ ID No.15和16)，每种0.6μl的M11F20和M11R20(SEQ ID No.59和60)；每种0.5μl的S13F25和S13R24(SEQ ID No.75和76)；每种0.4μl的T16F24和T16R26(SEQ IDNo.83和84)；每种0.4μl的J6F18和J6R20(SEQ ID No.51和52)；每种0.4μl的WK9R20和WK9R20(SEQ ID No.87和88)，将这些引物同PCR反应物混合，并用无菌水补足体积至25μl。
反应器是PCR Thermal Cycler(热循环仪)MP(Takara Bio Inc.生产)。在反应器中，模板DNA经历35个PCR循环。每个PCR循环包括94℃变性1分钟，62℃退火1分钟和72℃链延伸2分钟。
用Mupid II(Cosmobio生产)电泳扩增的DNA。DNA在2％的琼脂糖凝胶中电泳40分钟，溴化乙锭染色并由紫外光照射来显出条带模式。
根据《稻米可口性分级》(2001，由日本谷类调查协会发表)的方法将每种样品的可口性数字化。具体而言，特别A级是5分，A级为4分，A’级为3分，B级为2分，B’为1分。将这样数字化数据同根据《稻米品种百科全书2》(1999，稻米数据库发表)，五星级为5分，四星级为4分，三星级3分，两星级2分，一星级1分的方法得到的数字化数据结合。结合后，每种被测样品的数据总和就指示它的可口性。表2和图1展示每种样品电泳的条带模式和它的可口性评价数据。
而且，表2中每种样品PCR扩增的DNA条带模式中是否出现区别条带的情况被二进制化。具体而言，出现DNA区别条带(+)为“1”，而不出现的(-)为“0”。
进一步通过多重回归分析处理所得数据。指示7组引物是否出现区别条带的二进制化数据为解释性变量，而可口性评价数据为反应性变量。由此得出下述可口性估算等式
可口性估计值
＝4.185+0.653×A6+1.068×A7+1.746×M11+1.42×S13-1.27×T16-0.355×WK9+1.81×J6 (1)
下述调查了可口性估算等式(1)对未鉴定样品的适用性以上述相同的方法检验并测试1997年日本收获的11个品种，1998年的11个品种和1999年的10个品种，并在它们之间分别比较对由感官检查得到的可口性数值和由可口性估算等式(1)预言的可口性数值。图2到图4的图示展示实得可口性数值和预言可口性数值的相关性。
如图所示，由可口性估算等式(1)得到的多重相关函数，1997年的稻米样品为0.85，1998年的为0.91，而1999年的为0.93，都很高。由此证实，可口性估算等式(1)适用于任何未曾用于完成该等式的未知样品，而且与收获时间的日期无关。表2-常见的稻米品种，其经感官检验评价的可口性数据，和由引物得到的区分条带。+PCR后电泳中出现区别条带-PCR后电泳中不出现区别条带*未经感官测试
实施例2(以感官检查所得数据作反应性变量，精白米基于PCR方法的可口性估算等式的实用性)
除以精白米粉为样品做PCR以外，本实施例与实施例1相同。具体而言，将与实施例1中同样的前20种最好品种的未精碾稻米样品精碾并磨成稻米面粉样品。用CTAB处理从每种6g米面粉样品中提取基因组DNA。具体的，将6ml，70℃的2％的CTAB溶液(0.1M Tris-盐酸，2mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0)加入样品并搅拌，放入55℃培养箱，并再加入6ml相同的CTAB溶液(1％)。以此条件，抽提基因组DNA 30分钟。
然后，向DNA抽提物中加入氯仿/异戊醇(24/1)，搅拌并离心。向离心所得上清加入DNA沉淀剂(1％CTAB溶液，20mMTris-盐酸，10mM EDTA，pH8.0)，放置于4℃过夜以沉淀DNA。之后离心，得到DNA沉淀，再用1M的NaCl抽提。用异丙醇或乙醇清洗DNA提取物，再沉淀收集，然后溶解于200μl的TE缓冲液(10mM Tris-盐酸，1mMEDTA，pH8.0)制得DNA样品溶液。
用5种不同类型的STS引物B1，F6，G28，P5和T16，对提取自每种精白米样品的模板DNA进行PCR反应。PCR反应物的制备混合0.2μl Taq多聚酶(Takara Bio Inc.生产，5u/μl)，2.5μl PCR缓冲液(12mM Tris-盐酸，60mM KCl，pH8.3)，2.0μl MgCl2，1μl模板DNA(200ng/μl)和1μl dNTPs(100μM)。PCR的STS引物为每种0.2μl的B1F25(SEQ ID No.15)和B1R20和(SEQ ID No.16)，每种0.4μl的F6F25(SEQ ID No.35)和F6R22(SEQ ID No.36)；每种0.2μl的G28F17(SEQ ID No.47)和G28R28(SEQ ID No.48)；每种0.3μl的P5F20(SEQ ID No.67)和P5R25(SEQ ID No.68)；每种0.3μl的T16F24(SEQ ID No.83)和T16R26(SEQ ID No.84)。将这些引物同PCR反应物混合，并用无菌水补足体积至25μl。PCR条件同实施例1。
用Mupid II(Cosmobio生产)电泳扩增的DNA。DNA在2％的琼脂糖凝胶中电泳40分钟，溴化乙锭染色并由紫外光照射来显出条带模式。
另一方面，对稻米样品进行感官检查，数字化其可口性。感官检查如下用水洗净600g每种样品的稻米。加入1.3倍重量的纯水，浸泡1小时令其吸水。用电饭煲(东芝RC-183)煮熟。电饭煲自动断电后，继续放置，在里面焖15分钟。盖着盖子，再放置1小时。然后打开，轻轻用米饭勺盛出到小杯中，让评味员品尝。
评味员有24人。稻米的感官测试详细如下品种“Nipponbare”作为样品可口性评价的参考，分值为0，其他样品与参考样品比较得到自己的综合可口性评价。第一口的味道的确非常好的样品给+3；第一口味道较好的，尽管不够明确的给+2；第一口不明确，但是第二口感觉有点好的给+1；第一口味道的确不好的给-3；第一口有点不好，虽然不很明确，给-2；第一口不明确，但是第二口感觉有点不好的给-1。对于每种样品，所有评味员所给分值的平均值为各样品的可口性评价值。表3给出样品在电泳中条带模式的结果和感官可口性评价的结果。
另外，表3的每种样品PCR扩增所得DNA条带模式中是否出现区别条带的情况被二进制化。具体的，出现区别条带的(+)为“1”，不出现的为“0”。
进一步用多重回归分析所得数据，指示5组引物是否出现区别条带的二进制化数据为解释性变量，而1998年收获并在此测试的11个稻品种的可口性评价数据为反应性变量。这样得到下面的可口性估算等式(2)。由可口性估算等式推出的被测样品的多重相关函数为0.87。
可口性估计值
＝0.777-0.359×B1-0.288×F6+0.135×G28+0.519×P5-0.215×T16 (2)
对1999年收获的12个稻米品种“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Hinohikari”，“Sasanishiki”，“Hoshinoyume”，“Kirara 397”，“Mutsuhomare”，“Asanohikari”，“Hatsushimo”，“Kinuhikari”，“Nipponbare”和“Tsukinohikari”调查可口性估算等式对感官检查数据的兼容性如下通过上述感官检查方法得到这12个1999年的稻米品种的可口性数值，然后与由可口性估算等式(2)预测的数值相比较。图5是显示实得的可口性数值和预测的可口性数值的相关性。
由上述显而易见，这12个1999年的稻米品种的多重相关函数为0.85。这证实了本发明基于PCR的可口性估算等式适用于下一年收获的未知稻米品种。
另外，以数字化的PCR数据为变量，这些稻米样品也做了主成分分析。图6展示对应于日本1999年收获的前20个最好的稻米品种的数值图，分别由1指示“Koshihikari”，2指示“Hitomebore”，3为“Hinohikari”，4为“Akitakomachi”，5为“Kirara397”，6为“Kinuhikari”，7为“Hoshinoyume”，8为“Haenuki”，9为“Mutsuhomare”，10为“Nipponbare”，11为“Sasanishiki”，12为“Tsugaruroman”，13为“Hanaechizen”，14为“Yumetsukushi”，15为“Hatsushimo”，16为“Aichinokaori”，17为“Tsukinohikari”，18为“Aichinokaori”，19为“Matsuribare”和20为“Akiho”。
图6指示被分析的单个稻米样品。这说明本发明基于PCR的多变量分析适用于以感官检查为基础的稻米品种分类。
表3-感官检验数据和PCR数据+PCR电泳中出现区别条带-PCR后电泳中不出现区别条带*未经感官测试
实施例3(以感官检查所得数据作反应性变量，米饭基于PCR方法的可口性估算等式的实用性)
按照实施例1中的方法，测试11个收获于1997年和1998年的稻米品种，“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Hinohikari”，“Sasannishiki”，“Hoshinoyume”，“Kirara 397”，“Mutsuhomare”，“Asanohikari”，“Hatsushimo”，“Kinuhikari”和“Nipponbare”的一共22个样品。简而言之，感官测试米饭，并从每种米饭样品中提取DNA，作模板进行PCR。
PCR反应使用5种不同类型的STS引物，B1，F6，G28，M11，和P5。PCR反应物成分混合混合0.2μl Taq多聚酶(Takara Bio Inc.生产，5u/μl)，2.5μl PCR缓冲液(12mM Tris-盐酸，60mM KCl，pH8.3)，2.0μl MgCl2，1μl模板DNA(200ng/μl)和1μl dNTPs(100μM)。PCR的STS引物为每种0.2μl的B1F25(SEQ ID No.15)和B1R20(SEQID No.16)，每种0.4μl的F6F25(SEQ ID No.35)和F6R22(SEQ IDNo.36)；每种0.2μl的G28F17(SEQ ID No.47)和G28R28(SEQ IDNo.48)；每种0.2μl的M11F20(SEQ ID No.59和M11R20(SEQ IDNo.60)；每种0.2μl的P5F20(SEQ ID No.67)和P5R25(SEQ ID No.68)，将这些同PCR反应物混合，并用无菌水补足体积至25μl。PCR条件同实施例1。
用Mupid II(Cosmobio生产)电泳扩增的DNA。DNA在2％的琼脂糖凝胶中电泳40分钟，溴化乙锭染色并由紫外光照射来显出条带模式。
另一方面，按照实施例2的方式，对稻米样品进行感官检查，并数字化其可口性。表4给出电泳得到的样品条带模式的结果和感官评价数据的结果。
另外，每种样品PCR扩增所得DNA条带模式中是否出现区别条带的情况被二进制化。具体的，出现区别条带的(+)为“1”，不出现的(-)为“0”。
进一步用多重回归分析加工所得数据，指示5组引物是否出现区别条带(1或0)的二元数据为解释性变量，而1998年收获的11个被测稻米品种的可口性评价数据为反应性变量。由此得到下面的可口性估算等式(3)。由可口性估算等式(3)推算出的被测样品的多重相关函数为0.80。
可口性估算
＝0.745-0.501×B1-0.2181×F6+0.1273×G28-0.1454×M11+0.6×P5 (3)
对1997年收获的未知稻米样品应用可口性估算等式(3)，得到其相关性函数0.80(图7)。这可以证实本发明的可口性估算等式可适用于不同年份产出的稻米样品。
表4-感官检验数据和PCR数据
+PCR电泳中出现区别条带
-PCR后电泳中不出现区别条带
*未经感官测试
实施例4(以米饭的物理数据作反应性变量，米饭基于PCR方法的可口性估算等式的实用性)
根据作为稻米可口性基础的米饭物理数据，来调查本发明稻米可口性评价和估计的实用性。
按照实施例2的方式测试1998年收获的12个品种，“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Hinohikari”，“Sasanishiki”，“Hoshinoyume”，“Kirara 397”，“Mutsuhomare”，“Asanohikari”，“Hatsushimo”，“Kinuhikari”，“Nipponbare”和“Tsukinohikari”和1999年收获的10个品种，“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Sasanishiki”，“Hoshinoyume”，“Mutsuhomare”，“Asanohikari”，“Hatsushimo”，“Kinuhikari”，“Nipponbare”和“Tsukinohikari”的稻米。简而言之，从每种精白米面粉样品中提取DNA，然后用多种STS引物做PCR并电泳，来看扩增DNA中是否出现区别条带。
除以下所用5种不同类型的STS引物以外，PCR方法同实施例2。本例中所用引物为每种0.1μl的B43F17(SEQ ID No.23)和B43R18(SEQID No.24)，每种0.3μl的G22F27(SEQ ID No.43)和G22R23(SEQ IDNo.44)；每种0.3μl的P5F20(SEQ ID No.67)和P5R25(SEQ ID No.68)；每种0.2μl的G4F18(SEQ ID No.39)和G4R24(SEQ ID No.40)；每种0.2μl的M2CGF16(SEQ ID No.55)和M2CGR15(SEQ ID No.56)。
用Mupid II(Cosmobio生产)电泳扩增的DNA。DNA在2％的琼脂糖凝胶中电泳40分钟，溴化乙锭染色并由紫外光照射来显出条带模式。
按如下方法测量米饭的物理性质将1og每种米饭样品放在一个小杯中，加入16ml纯水，令其吸水1小时。将5个盛米的小杯放入一个电饭煲(东芝RC-183)，杯外加75ml纯水来煮米。电饭煲自动断电以后，继续焖15分钟。然后，在25℃放置2小时。
使用拉伸压缩检测器，Tensipresser，Myboy(Takemoto Electric生产)，对每种的20粒米饭做低压缩测试，压缩其厚度的25％来测量粘在测试器表面的米饭粒的量(L3)。结果在表5中给出。
另外，每种样品PCR扩增所得DNA条带模式中是否出现区别条带的情况被二进制化。具体地，出现区别条带的(+)为“1”，不出现的(-)为“0”。
进一步用多重回归分析加工所得数据，以指示5组引物是否出现区别条带(1或0)的二进制化数据为解释性变量，而以测得的1998年的稻米样品的物理数据为反应性变量。由此得到下面的物理数据估算等式(可口性估算等式)(4)。由此物理数据估算等式得出的稻米样品的多重相关性函数为0.99。
可口性估计值
＝1.093-0.0858×B43-0.197×G4+0.253×G22+0.0391×M2CG+0.100×P5 (4)
表5-米饭的物理数据和PCR数据
+PCR电泳中出现区别条带
-PCR后电泳中不出现区别条带
物理数据在低压缩测试中，粘于检测器Tensipresser表面的米饭粒数量L3
(mm)
-未测
对1999年中的次农事年稻米样品应用由多重回归分析得到的等式4，得出未知样品的多重相关性函数为0.88。这就证实了基于DNA分析的物理数据估算等式可实用于稻米可口性评价。
实施例5(以不同国家的米饭物理数据作反应性变量，构建米饭基于PCR方法的可口性估算等式)
根据不同国家的米饭物理数据，来调查本发明稻米可口性评价和估计的应用性。米饭物理数据是稻米可口性的基础。
以实施例2的方法测试收获于不同国家的15个稻米品种日本的“Koshihikari”，韩国的“Ilpum”，中国的“Fujihikari”，意大利的“Erio”，印度的“Basmati”和“Bangana”，越南的“Tamsoan”和“C70”，尼日利亚的“Oryza glaberrima(CG-14)”和“WAB 450106”，澳大利亚的“Amaroo”和“Pelde”，泰国的“Khao Dawk Mali”和美国的“Nishiki”和“Bengal”。简而言之，从每种精白米面粉样品中提取DNA，然后用多种STS引物做PCR并电泳，来看扩增DNA中是否出现区别条带。
使用8种不同类型的STS引物每种0.4μl的A6F21和A6R22(SEQID No.3和4)；每种0.6μl的E30F28和E30R24(SEQ ID No.31和32)，每种0.4μl的F6F25和F6R22(SEQ ID No.35和36)，每种0.5μl的G4F18和G4R24(SEQ ID No.39和40)，每种0.5μl的J6F18和J6R20(SEQ ID N0.51和52)，每种0.5μl的M2CGF16和M2CGR15(SEQ ID No.55和56)，每种0.5μl的S13F25和S13R24(SEQID No.75和76)，每种0.4μl的WK9F20和WK9R20(SEQ ID No.87和88)。PCR条件同实施例2。
用Mupid II(Cosmobio生产)电泳扩增的DNA。DNA在2％的琼脂糖凝胶中电泳40分钟，溴化乙锭染色并由紫外光照射来显出条带模式。
按如下方法测量米饭的物理性质将10g每种米饭样品放在一个小杯中，加入16ml纯水，令其吸水1小时。将5个盛米的小杯放入一个电饭煲(东芝RC-183)，杯外加75ml纯水来煮米。电饭煲自动断电以后，继续焖15分钟。然后，在25℃放置2小时。
用拉伸压缩检查器，Texturometer(Zenkensha生产)，检测每种稻米样品的3粒米饭，测量其硬度(H1)。一次测试中，一共检测一种稻米样品的5个3粒一组的样品。
另外，每种样品PCR扩增所得DNA条带模式中是否出现区别条带的情况被二进制化。具体的，出现区别条带的(+)为“1”，不出现的(-)为“0”。
进一步用多重回归分析加工所得数据，以指示8组引物是否出现区别条带(1或0)的二进制化数据为解释性变量，而以测得的稻米样品的物理数据(H1)为反应性变量。由此得到下面的物理数据估算等式(可口性估算等式)(5)。图9中，将由物理检查实际得到的物理数据，也即被测稻米样品的实得物理数据同由物理数据估算等式(5)得出的该样品的预测物理数据进行了比较。图9显示了被测稻米样品物理数据实得值与其预测值之间的相关性。由该物理数据估算等式得出的被测稻米样品的多重相关性函数为0.93。
Y＝2.246+0.632×WK9+0.514×E30-0.703×A6+1.011×M2CG-0.578×S13+0.386×J6-0.044×G4+0.38×F6(5)
表6-米饭的物理数据和PCR数据
+PCR电泳中出现区别条带
-PCR后电泳中不出现区别条带
物理数据由Texturometer测得的米饭硬度(H1，kgf)
这些结果证实本发明用以STS引物做PCR时是否出现区别条带的数字化数据为解释性变量的多变量分析，预测不同类型米饭的物理性质的方法适用于世界上多个国家产出的不同品种的稻米。
实施例6(以不同国家的米饭物理数据作反应性变量，构建基于PCR方法的可口性估算等式)
根据不同国家的米饭物理数据，来调查本发明稻米可口性评价和估计的应用性。米饭物理数据是稻米可口性的基础。
以实施例2的方法测试收获于不同国家的11个稻米品种日本的“Koshihikari”，中国的“Fujihikari”，意大利的“Erio”，“Ceremio”，“Thaibonnet”和“Alborio”，尼日利亚的“Oryza glaberrima(CG-14)”，“WAB961”，“WITA7”，“Cisdane”和“WAB450106”。简而言之，从每种精白米粉样品中提取并纯化DNA，然后用多种STS引物做PCR并电泳，来看扩增DNA中是否出现区别条带。
使用7种不同类型的STS引物每种0.4μl的A6F21和A6R22(SEQID No.3和4)；每种0.4μl的B1F25和B1R20(SEQ ID No.11和12)；每种0.6μl的E30F28和E30R24(SEQ ID No.31和32)，每种0.4μl的F6F25和F6R22(SEQ ID No.35和36)，每种0.5μl的J6F18和J6R20(SEQ ID No.51和52)，每种0.5μl的S13F25和S13R24(SEQ IDNo.75和76)，每种0.4μl的WK9F20和WK9R20(SEQ ID No.87和88)。
用Mupid II(Cosmobio生产)电泳扩增的DNA。DNA在2％的琼脂糖凝胶中电泳40分钟，溴化乙锭染色并由紫外光照射来显出条带模式。
将10g每种米饭样品放在一个小杯中，加入16ml纯水，令其吸水1小时。将5个盛米的小杯放入一个电饭煲(东芝RC-183)，杯外加75ml纯水来煮米。电饭煲自动断电以后，继续焖15分钟。然后，在25℃放置2小时。
使用拉伸压缩检测器，Tensipresser，Myboy(Takemoto Electric生产)，对每种的20粒米饭样品做低压缩测试，压缩其厚度的25％来测量粘在测试器表面的米饭粒的量(L3)。结果在表5中给出。
另外，每种样品PCR扩增所得DNA条带模式中是否出现区别条带的情况被二进制化。具体的，出现区别条带的(+)为“1”，不出现的(-)为“0”。
进一步用多重回归分析处理所得数据，以指示7组引物是否出现区别条带(1或0)的二进制化数据为解释性变量，而以测得的稻米样品的物理数据(L3)为反应性变量。由此得到下面的物理数据估算等式(可口性估算等式)(6)。图10中，将由物理检查实际得到的物理数据，也即被测稻米样品的实得物理数据同由物理数据估算等式(5)得出的该样品的预测物理数据进行了比较。图10显示稻米样品的实得物理数据与预测值的相关性。由此物理数据估算等式得出的稻米样品的多重相关性函数为0.98。
y＝2.294-0.789×WK9-0.73×E30-0.82×A6-1.84×B1+1.66×S13-0.845×J6+2.68×F6 (6)
表7-米饭的物理数据和PCR数据
+PCR电泳中出现区别条带
-PCR后电泳中不出现区别条带
物理数据粘于Tensipresser的米量(L3，mm)
这些结果证实本发明用以STS引物做PCR时是否出现区别条带的数字化数据为解释性变量的多变量分析，预测不同类型米饭的物理性质的方法适用于世界上多个国家产出的不同品种的稻米。
实施例7(以RAPD方法评价精白米可口性)
取稻米样品“Koshihikari”，“Hitomebore”，“Akitakomachi”，“Sasanishiki”，“Nipponbare”“Hinohikari”，“Kirara 397”，“Mutsuhomare”，“Kinuhikari”，“Asanohikari”，和“Haenuki”，以实施例1的方法，分别磨成精白米面粉。按照与实施例1相同的方式用CTAB法从6g每个稻米粉样品中提取基因组DNA。
具体地，将6ml，70℃的2％的CTAB溶液(0.1M Tris-盐酸，2mM EDTA，1.4M NaCl，pH8.0)加入样品并搅拌，放入55℃培养箱，并再加入6ml相同的CTAB溶液(1％)。以此条件，抽提基因组DNA30分钟。
然后，向DNA抽提物中加入氯仿/异戊醇(24/1)，搅拌并离心。向离心所得上清加入DNA沉淀剂(1％CTAB溶液，20mMTris-盐酸，10mM EDTA，pH8.0)，放置于4℃过夜以沉淀DNA。之后，离心，得到DNA沉淀，再用1M的NaCl抽提。用异丙醇或乙醇清洗DNA提取物，再以普通方式收集沉淀。
然后溶解于200μl TE缓冲液(10mM Tris-盐酸，1mM EDTA，pH8.0)制得DNA样品溶液。
用这样提取的DNA模板做以4种随机引物OPB1，OPB18，OPM11和OPT16(都由Operon生产)做PCR。PCR反应物的配制混合0.2μlTaq多聚酶(Takara Bio Inc.生产，5u/μl)，2.5μl PCR缓冲液(12mMTris-盐酸，60mM KCl，pH8.3)，2.0μl MgCl2，1μl模板DNA(200ng/μl)和1μl dNTPs(100μM)。再加每种0.2μl的随机引物，混匀，并以无菌水补足体积至25.0μl。
反应器是PCR Thermal Cycler(热循环仪)MP(Takara Bio Inc.生产)。在反应器中，模板DNA经历35个PCR循环。每个PCR循环包括94℃变性1分钟，36℃退火1分钟和72℃链延伸2分钟。
每种样品PCR扩增所得DNA条带模式中是否出现区别条带的情况被二进制化。具体的，出现区别条带的(+)为“1”，不出现的(-)为“0”。
进一步用多重回归分析处理所得数据，以指示4种引物是否出现区别条带(1或0)的二进制化数据为解释性变量，而以感官检查评价的可口性数据(表2)为反应性变量。由此得到下面的物理数据估算等式(可口性估算等式)(7)。由此物理数据估算等式得出的稻米样品的多重相关性函数为0.89。
y＝5.71+1.04×OPB18-1.17×OPB1+2.29×OPM11+1.17×OPT16 (7)
实施例8(从半粒未精碾稻米中选择可口稻米)
混合5粒可口稻米“Koshihikari”和5粒抗病非可口稻米“Tsukinohikari”，一共10粒。用刀将每粒米切成两半，一半含有胚，另一半不含。
在研钵中将不含胚的一半米粒磨碎，并以与实施例2相同的方式，用CTAB法处理来提取DNA。不过在此，实验的规模是实施例2中的1/500。将这样得到的DNA作模板进行PCR反应。
PCR反应物的制备混合0.2μl Taq多聚酶(Takara Bio Inc.生产，5u/μl)，2.5μl PCR缓冲液(12mM Tris-盐酸，60mM KCl，pH8.3)，2.0μl MgCl2，1μl模板DNA(200ng/μl)和1μl dNTPs(100Mm)。PCR所用STS引物为每种0.4μl的A6R21和A6R22(SEQ ID No.3和4)，每种0.5μl的A7F22和A7R17(SEQ ID No.15和16)，每种0.6μl的M11F20和M11R20(SEQ ID No.59和60)，每种0.5μl的S13F25和S13F24(SEQ ID No.75和76)，每种0.4μl的T16F24和T16R26(SEQ IDNo.83和84)，每种0.4μl的J6F18和J6R20(SEQ ID No.51和52)，每种0.4μl的WK9F20和WK9R20(SEQ ID No.87和88)。这些引物同PCR反应物混合，并用无菌水补足总体积至25.0μl。
反应器是PCR Thermal Cycler(热循环仪)MP(Takara Bio Inc.生产)。在反应器中，模板DNA经历35个PCR循环。每个PCR循环包括94℃变性1分钟，62℃退火1分钟和72℃链延伸2分钟。
用Mupid II(Cosmobio生产)电泳扩增的DNA。DNA在2％的琼脂糖凝胶中电泳40分钟，溴化乙锭染色并由紫外光照射来显出条带模式。表8给出所得结果。
以同实施例1相同的方式，根据《稻米可口性分级》(2001，由日本谷类调查协会发表)的方法和《稻米品种百科全书2》(1999，稻米数据库发表)的方法将每种样品的可口性数字化。简单的说，将这些方法得到的数字化数据加和，每种被测样品的数据总和就指示它的可口性。而且，表8中每种样品PCR扩增的DNA条带模式中是否出现区别条带的情况被二进制化，同实施例1。
以表8的数据为基础，对被测样品应用可口性估算等式(1)，算出每种样品的可口性估算值。依据这些估算的可口性数值将样品分为两组，A组分值高而B组分值低。
如此分成两组后，每组包含5粒含有胚(生殖细胞)的半粒稻米。用1％的次氯酸钠溶液将样品表面消毒，然后将其放入成分如下的培养基中，在30℃7天发芽。将发芽的半粒稻米转移到人工气候室，BiotronNC350(Nippon Medical Instruments Manufacturing生产)，在那里于28℃以光照10小时，暗14小时的循环培养，使其长成绿色小苗。
接着，将小苗移种到含有相同培养基的农用小盆中生长7天，然后移植到育苗混合肥料中，继续在人工气候室，TGH-6(Tabai Espec生产)生长约2周。这样长好后，将苗转移到填有盆栽混合肥料的瓦格纳盆中，在人工气候室培养约4个月，让苗在那里抽穗。
培养基成分(1升，pH5.8)
琼脂糖 8.000g
硫酸铵 0.463g
硝酸钾 2.830g
氯化钙 0.166g
硫酸镁 0.185g
磷酸二氢钾 0.400g
硫酸铁0.278g
EDTA二钠 0.373g
烟酸 0.250mg
维生素B6 0.250mg
维生素B1 0.500mg
氨基乙酸 1.000mg
这些稻植株在人工气候室继续培养约40天，稻穗成熟。然后，收割成熟的稻穗，打谷，去壳。精碾去壳稻米并将其磨成粉，由此以实施例2的方式用CTAB法提取DNA。以上述相同方式做PCR。
A组扩增的DNA出现和“Koshihikari”相同的区别条带，而B组扩增的DNA出现与“Tsukinohikari”相同的区别条带。煮熟后，被这样鉴定为“Koshihikari”的稻米样品味道好，而那些被鉴定为“Tsukinohikari”的味道不好。
上述方法证实本发明可以通过从未精碾稻米不含胚(胚芽)的半粒提取DNA，以STS引物对模板DNA做PCR来估计稻米的可口性，然后将剩下的半粒含有胚(胚芽)的稻米萌发来选择可口稻米。
表8-以PCR鉴定“Koshihikari”和“Tsukinohikari”
表8-通过PCR鉴定“Kishihikari”和“Tsukinohikari”+PCR电泳中出现区别条带-PCR后电泳中不出现区别条带实施例9(通过半粒未精碾稻米的杂交育种和PCR选择可口稻米)母本，可口稻米品种“Koshihikari”与父本，抗病、非可口稻米品种“Tsukinohikari”杂交。简单来说，以常规方式通过温水浸泡将“Koshihikari”的稻粒去雄，并且用“Tsukinohikari”授粉。这样杂交后，播种稻粒，产出F1种子。不去壳，将F1种子播种在填有育苗肥的瓦格纳盆中，在人工气候室，TGH-6(Tabai Espec生产)中培养，通过自花授粉，产出F2种子。
将F2种子去壳。将得到的每种少量稻粒切成含有胚(胚芽)和不含胚(胚芽)的两半。在研钵中将不含胚的一半米粒磨碎，并以与实施例2相同的方式，用CTAB法处理来提取DNA。不过在此，实验的规模是实施例2中的1/500。将这样得到的DNA用STS引物进行PCR反应来扩增模板DNA。PCR条件同实施例7。
将样品经PCR得到的区别条带模式代入实施例1的可口性估算等式(1)，算出样品的可口性估算值。通过这样分析，将样品分成两组，一组由可口性估算值最大为5的样品构成，另一组由可口性估算值最小为8的样品构成。对应这两个组，将含有胚芽的半粒萌发并栽种，并使其抽穗，待稻穗成熟后收割，打谷，去壳，同实施例7。用实验室稻米磨精碾去壳稻米，并用电饭煲(东芝RT-183)煮熟，之后，对米饭进行感官检查，同实施例2。
感官检查证实可口性估算值最高为5的一组不可口，而可口性估算值最低为8的一种是可口的。
上述方法证实本发明可以通过将每个未去壳或未精碾杂交稻种子颗粒一切两半，从不含胚的半粒提取DNA，以STS引物对模板DNA做PCR来估计稻米的可口性，然后将剩下的半粒含有胚的稻米萌发来选择可口稻米。
序列表<110>National Food Research Institute<120>DNA水平稻米可口性评价方法，和通过对半粒未去壳/未精碾稻米的分析来选择可口稻米的方法<130>P131218K<160>92<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>1ccagctgaac gcctgtacta caagaattaa 30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>2ccagctgtac gtcttcccca gcgccggcgg 30<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3ccagctgtac gcctgtacta c 21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4ccagctgtac gtcttcccca gc 22<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5tgcctcgcac cagaaatagt ataatcccaa 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>6tgcctcgcac catgaggtgt ggccgagtac 30<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>7tgcctcgcac cagaaatag 19<210>8<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>8tgcctcgcac catgag 16<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>9gtttcgctcc tacagtaatt aaggggctat 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>10gtttcgctcc catgcaatct gcaaaagttt 30<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>11gtttcgctcc tacagtaatt aaggg 25<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12gtttcgctcc catgcaatct 20<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>13caggtgtggg ttacaaggat gacccttggg30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>14caggtgtggg ttcacggcct tgattaataa 30<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>15caggtgtggg ttacaaggat ga 22<210>16<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>16caggtgtggg ttcacgg 17<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>17ccacagcagt gcttcatgtc atgtagaata 30<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>18ccacagcagt tcaaatacac caggaatttc 30<210>19<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>19ccacagcagt gcttc 15<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>20ccacagcagt gcttcatgtc a 21<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>21tggccggcat gactcacata cccaacatat 30<210>22<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>22actggccggc atcaagacca accaatttgg 30<210>23<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>23tggccggcat gactcac 17<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>24actggccggc atcaagac 18<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>25ggaatggaac cgaagtggag ctattccctg 30<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>26ggaatggaac cgccgtaaac ttgaatgcta 30<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>27ggaatggaac cgaagtggag20<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>28ggaatggaac cgccgtaaac t 21<210>29<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>29tacctggttg atgtatacag atctggttat 30<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>30atccctcgat ccctctagca ttatatcctc 30<210>31<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>31tacctggttg atgtatacag atctggtt 28<210>32<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>32atccctcgat ccctctagca ttat 24<210>33<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>33accactccat atatatcatc caaagttcta 30<210>34<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>34accactccat atcaccacaa ggcgtttagg 30<210>35<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>35accactccat atatatcatc caaag25<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>36accactccat atcaccacaa gg 22<210>37<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>37gagaccgata tgcgattcgc ggcattggac30<210>38<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>38gtggtgttta gatccagaga cttaacttta 30<210>39<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>39gagaccgata tgcgattc 18<210>40<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>40gtggtgttta gatccagaga ctta 24<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>41ctcactcaaa tttacagtgc attttcttgt 30<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>42agggccatga tacaagactc tgttctgtag 30<210>43<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>43ctcactcaaa tttacagtgc attttct 27<210>44<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>44agggccatga tacaagactc tgt 23<210>45<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>45ggccgtcgtt ctgcgatggt ctccaagaat 30<210>46<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>46ggagaatccc acagtaagtt tttctttgtt 30<210>47<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>47ggcggtcgtt ctgcgat 17<210>48<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>48ggagaatccc acagtaagtt tttctttg 28<210>49<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>49gtcggagtgg tcagaccggg ctagcttttg 30<210>50<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>50gtcggagtgg atggagtagc ggtgggtgtg 30<210>51<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>51gtcggagtgg tcagaccg18<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>52gtcggagtgg atggagtagc 20<210>53<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>53acaacgcctc cgatgatcga accatatctt 30<210>54<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>54acaacgcctc cgacaacaag attttctcct 30<210>55<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>55acaacgcctc cgatga 16<210>56<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>56acaacgcctc cgaca 15<210>57<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>57gtccactgtg accacaacat ttcttccagc 30<210>58<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>58gtccactgtg gggattgttc cataaaagat 30<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>59gtccactgtg accacaacat 20<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>60gtccactgtg gggattgttt 20<210>61<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>61aacgggccaa aaacggaggt cgtatggagc 30<210>62<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>62aacgggccaa cgcagccatt aaagagaaat 30<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>63aacgggccaa aaacggaggt 20<210>64<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>64aacgggccaa cgcag 15<210>65<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>65acaacggtcc gtccttgctt aggaaaaggc 30<210>66<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>66acaacggtcc aacagatact tttgaaaaac 30<210>67<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>67acaacggtcc gtccttgctt 20<210>68<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>68acaacggtcc aacagatact tttga 25<210>69<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>69agtgcagcca ttatatagga ctaacaagga 30<210>70<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>70agtgcagcca aaccagaaga aagccatgtt 30<210>71<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>71agtgcagcca ttatatagga ctaac 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1.一种DNA水平的选择可口稻米的稻米可口性评价方法，包括在STS引物或随机引物存在下经PCR扩增提取自稻植物、未去壳稻粒、未精碾稻米、精白米、米饭、米制糕点或者其研碎末的DNA，然后从所得扩增的DNA条带中选择与可口性评价密切相关的DNA条带，和将其用作可口性评价的DNA标记来选择可口的稻米。
2.权利要求1的方法，其中从中提取DNA的稻米样品是不含胚的半粒未去壳或未精碾稻米，并且用PCR反应所得DNA标记选出可口稻米之后，使另一半含有胚的稻米粒萌发并长成稻植株，由此选择性的培育所选出的可口稻米品种。
3.权利要求1或2的方法，其中使用STS引物通过RAPD方法实施所述PCR，并使用与感官检验和/或物理化学检验中的可口性评价密切正和/或负相关的DNA条带作为可口性评价的DNA标记来选择可口稻米。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中选择性地使用与感官检验和/或物理化学检验中的可口性评价密切正和/或负相关的DNA标记，以样品中存在该标记与否为基础来选择可口稻米。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中通过测量米饭性质实现物理化学检验中的稻米可口性评价。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中用10到30mer的，制备自DNA序列SEQ ID No.1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、和86的STS引物来实施PCR。
7.权利要求1-4中任一项的方法，其中在PCR中使用一个或多个选自下列引物组的STS引物A6，A7，B1，B7，B18，B43，E22，E30，F6，G4，G22，G28，J6，M2CG，M11，P3，P5，Q16，S13，T8，T16和WK9。
8.权利要求1或2的方法，其中在PCR中使用一个或多个选自下列引物组的随机引物OPA6，OPB1，OPB18，OPE22，OPF6，OPG4，OPG28，OPM11，OPP3，OPP5，OPQ16和OPT16。
全文摘要
提供一种DNA水平的，以很少量，尤其是一粒或半粒稻米做样品的稻米可口性评价方法。不破坏作为下一代稻植株发育起点的稻粒胚来评价稻米可口性并筛选可口稻米。该方法包括用STS引物或随机引物PCR扩增提取自稻植株、未去壳稻米、未精碾稻米、精白米、米饭、米制糕点或者其研碎粉末的DNA，然后在扩增的DNA条带中选择与可口性评价密切相关的DNA条带，将它用作可口性评价的DNA标记来筛选可口的稻米。
文档编号C12N15/09GK1407117SQ0214166
公开日2003年4月2日 申请日期2002年9月10日 优先权日2001年9月10日
发明者大坪研一, 冈留博司, 中村澄子, 原口和朋, 與座宏一, 奥西智哉, 铃木启太郎 申请人:独立行政法人食品综合研究所, 生物系特定产业技术研究推进机构