糖核苷酸类及复合糖类的制备方法

专利名称：糖核苷酸类及复合糖类的制备方法
技术领域：
本发明涉及在细菌和病毒等的感染防御，心血管疾病和免疫治疗等中有用的复合糖类的制备方法以及作为该复合糖类重要的合成底物的糖核苷酸的制备方法。
背景技术：
已知的糖核苷酸的制备方法有1)化学合成法[糖的化学和生物化学进展.，28，307(1973)，日本化学联合会通报，46，3275(1973)，有机化学杂志.，57，146(1992)，糖类研究.，242，69(1993)；2)利用酶的制备方法[组织化学杂志.，55，1834(1990)，有机化学杂志.，57，152(1992)，美国化学联合会杂志.，110，7159(1988)，特表平7-508413，特表平7-500248，WO96/27670]；3)利用酵母等微生物菌体的方法(特公昭45-2073，特公昭46-40756，特公昭47-1837，特公昭47-26703，特公昭49-8278，特开平2-268692)；4)从耐盐性酵母等微生物回收的方法(特开平)。
对1)的方法来说，需要昂贵的核苷-5’-一磷酸(下文简称为NMP)的吗啉酸(morpholidate)衍生物，糖磷酸等；对2)的方法来说需要昂贵的核苷-5’-二磷酸(下文简称为NDP)，核苷-5’-三磷酸(下文简称为NTP)，磷酸烯醇式丙酮酸，糖磷酸，丙酮酸激酶等原料；对3)的方法来说，需要对菌体的干燥处理。在4)的方法中有上述任一项方法中的核苷酸，糖磷酸原料昂贵，大规模生产困难等问题，因此，至今尚未建立糖核苷酸的大规模工业制备方法。
复合糖类的制备方法已知有1)化学合成法[酶学方法.，247，193(1994)；Ang.Chem.Int.Ed.Engl.，21，155(1982)；糖类研究.，211，cl(1991)]；2)使用水解酶的方法[分析生物化学.，202，215(1992)；生物技术动态.，6，256(1988)]；3)使用糖基转移酶的方法(特开平7-79792，特表平7-500248，特公平5-82200，WO94/25614，特表平9-503905，美国专利5,583,042)。
在1)的方法中为了进行立体选择的合成，必须导入保护基；2)的方法中收率和选择性都不足够；3)的方法需要NDP，NTP，磷酸烯醇式丙酮酸，糖磷酸或糖核苷酸等高价原料，还需要丙酮酸激酶等多种酶，使用上述的任一个方法都不能建立复合糖类的廉价的工业制备方法。而且，尚未知到利用廉价的核苷酸前体物质，糖，复合糖类前体物质直接进行复合糖类工业生产的方法。
据报道，可以通过添加乳清酸在棒杆菌属的微生物中生产UMP[氨基酸，核酸，23，107(1991)]。另外，还知到用乳清酸作为原料生成胞苷二磷酸胆碱的方法(特开平5-276974)。
发明公开本发明的目的在于提供在细菌和病毒等的感染防御，心血管疾病和免疫治疗等中有用的复合糖类的廉价且高效的制备方法以及作为该复合糖类重要的合成底物的糖核苷酸的廉价且高效的制备方法。
本发明人对利用微生物，以核苷酸作为前体物质生产复合糖类和糖核苷酸进行了广泛研究，结果是可以高效地以核苷酸的前体物质和糖类作为原料的糖核苷酸的生产效率得到提高；与糖核苷酸相关的基因的表达得到增强，其生产性得以提高；而且发现可以利用能产生该糖核苷酸的微生物和能从糖核苷酸以及复合糖类前体物质产生复合糖类的微生物或动物细胞或昆虫细胞，以核苷酸的前体物质和复合糖类的前体物质作为原料，从而高效的生产复合糖类；从而完成了本发明。
本发明提供了复合糖类的制备方法，其特征在于以下述物质作为酶源a)能从核苷酸前体物质产生NTP的微生物的培养液或该培养液的处理物，b)能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物的培养液或该培养液的处理物，以及c)能从糖核苷酸和复合糖类的前体物质产生复合糖类的微生物，动物细胞或昆虫细胞的培养液或该培养液的处理物，使这些酶源，核苷酸前体物质，糖和复合糖类前体物质存在于水溶性介质中，使复合糖类在水溶性介质中生成和积累并从该水溶性介质中回收复合糖类；本发明提供了糖核苷酸的制备方法，其特征在于以下述物质作为酶源a)能从核苷酸前体物质产生NTP的微生物的培养液或该培养液的处理物，b)能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物的培养液或该培养液的处理物，使这些酶源，核苷酸前体物质，糖存在于水溶性介质中，使糖核苷醇在水溶性介质中生成和积累并从该水溶性介质中回收糖核苷酸；以及复合糖类的制备方法，其特征在于以能从糖核苷酸和复合糖类前体产生复合糖类的微生物、动物细胞和昆虫细胞的培养液或该培养液的处理物作为酶源，使该酶源、复合糖类前体物质以及在上述的糖核苷酸的制备方法中得到的糖核苷酸存在于水溶性介质中，使复合糖类在水溶性介质中生成并积累；并从该水溶性介质中回收回收糖类。另外还提供了N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸的制备方法，其特征在于以有强的半乳糖激酶的微生物的培养液或该培养液的处理物作为酶源；使该酶源和N-乙酰基葡糖胺存在于水溶性介质中，使N-乙酰基葡糖胺-1磷酸在水溶性中产生和积累，并从该水溶性介质中回收该N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸。
附图简述

图1示表达质粒pPA31和pPAC31的构建工序。
图2示galU，ppa基因表达质粒pNT12和pNT32的构建工序。
图3示galT，galK基因的表达质粒pNT25的构建工序。
图4示在产氨棒杆菌中表达galT和galK基因的质粒pTK7的构建工序。
图5示glmU，ppa基因的表达质粒pNT14的构建工序。
图6示pgm基因的表达质粒pNT24的构建工序。
图7示glmM基因的表达质粒pNT44的构建工序。
图8示glk基因的表达质粒pNT46的构建工序。
图9示pfkB基因的表达质粒pNT47的构建工序。
图10示galK基因的表达质粒pNT54的构建工序。
图11示manB、manC基因的表达质粒pNK7的构建工序。
图12示pgm、pfkB基因的表达质粒pNT55的构建工序。
图13示gmd，wcaG基因的表达质粒pNK8的构建工序。
图14示neuA基因的表达质粒pTA14的构建工序。
图15示lgtC基因的表达质粒pGT3的构建工序。
图16示lgtB基因的表达质粒pNT60的构建工序。
表1-(1)和表1-(2)示在本发明中所用的缩写及其说明。
表1-(1)

表1-(2)

根据本发明提供了新的糖核苷酸的制备方法和利用该糖核苷酸的制备方法的新的复合糖类的制备方法，其特征在于1)不需要NTP和糖磷酸等昂贵的原料，只需要乳清酸等廉价的核苷酸前体物质和糖类作为原料，2)在将NMP或NDP转化为NTP时，不再需要添加磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸激酶等昂贵的物质，而且3)不需要酶的分离步骤。
对在本发明的方法中制备的糖核苷酸，可以例举出，有在核苷-5’-二磷酸残基的末端磷酸基团和糖残基的还原基团之间以酯键结合的通式的化合物，还有核苷酸残基是胞苷-5’-一磷酸类，糖残基是多元醇的情况也包含在本发明的糖核苷酸中。
对在本发明的方法中所制备的复合糖类来说，可以例举出与糖类结合的单糖，寡糖，与载体连接的单糖和寡糖，蛋白质，肽，脂类，糖蛋白质，糖脂类，糖肽或甾类化合物的化合物。
下面将详细地描述本发明。
1)对于在本发明中所用的能从核苷酸前体物质产生NTP的微生物来说，可以使用任一种能从核苷酸前体物质产生NTP的微生物，例如，埃希氏菌属或棒杆菌属的微生物。
埃希氏菌属的微生物可以例举出大肠埃希氏菌等。
棒杆菌属的微生物可以例举出产氨棒杆菌等。
2)对在本发明中所用的能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物来说，可以使用任一种有产生目的糖核苷酸活性的生物，例如，优选使用涉及2)-①UDP-Glc的生产的以下述式1所示的其中(1)到(4)的酶活性强的微生物。
具体地说，可以例举出埃希氏菌属的微生物或棒杆菌属的微生物，优选的具体的例子有大肠埃希氏菌或产氨棒杆菌。
另外，可以使用其中选自(1)，(2)，(3)和(4)中至少之一的酶已由基因重组技术增强的转化株。该转化株的具体例子有来自大肠埃希氏菌的代有含galU和ppa基因的重组DNA(pNT12)的大肠埃希氏菌KY8415(FERMBP-408)株。

(式1)
(1)己糖激酶(EC 2.7.1.1)或葡糖激酶(EC 2.7.1.2)(2)磷酸葡糖变位酶(EC 2.7.5.1)(3)葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(EC 2.7.7.9)(4)(无机的)焦磷酸酶(EC 3.6.1.1)在2)-②UDP-Gal的生产中，优选使用在下面通式2中所式的(5)和(6)的酶活性强的微生物，或者优选使用通式1中所示(1)到(4)的酶活性强的微生物。
具体地说，可以例举出埃希氏菌属的微生物或棒杆菌属的微生物，优选的具体的例子有大肠埃希氏菌和产氨棒杆菌。
另外，可以使用其中酶活性由基因工程技术增强了的转化株，其中酶有选自(5)和(6)的至少一种酶，或者选自(5)和(6)至少一种酶和选自(1)到(4)的至少一种酶。该转化株的具体实例有来自大肠埃希氏菌的带有含galT和galK基因的重组DNA(pNT25)的大肠埃希氏菌NM522株以及来自大肠埃希氏菌的带有含有galT和galK基因的重组DNA的转化株产氨棒杆菌ATCC21170。

(式2)(5)半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)(6)半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(EC 2.7.7.12)在2)-③UDP-Gal的生产中，优选使用在下面通式3中所式的(7)到(12)和通式1中所示(4)的酶活性强的微生物，或者优选使用通式3中所示(13)和(10)的酶活性强的微生物。
具体地说，可以例举出埃希氏菌属的微生物或棒杆菌属的微生物，优选的具体的例子有大肠埃希氏菌或产氨棒杆菌。
另外，可以使用其中选自(4)，(7)，(8)，(9)，(10)和(13)中至少之一的酶已由基因重组技术增强的转化株。该转化株的具体例子有来自大肠埃希氏菌的代有含glmM基因的重组DNA(pNT44)的大肠埃希氏菌NM522株，有来自大肠埃希氏菌的代有含glmU和ppa基因的重组DNA(pNT14)的大肠埃希氏菌KY8415株，有来自大肠埃希氏菌的代有含glk基因的重组DNA(pNT46)的大肠埃希氏菌NM522株，有来自大肠埃希氏菌的代有含galK基因的重组DNA(pNT54)的大肠埃希氏菌NM522株。
尽管对于(8)的磷酸葡糖胺变位酶活性的表达和增强来说，必须添加Glc-1，6-P2[生物化学杂志.，271，32(1996)]，但可以不添加Glc-1，6-P2而通过使用其中(11)和(12)的酶活性已由基因重组技术增强的转化株而从G-6-P和F-6-P提供Glc-1，6-P2。
该转化株的具体例子有来自大肠埃希氏菌的代有含pgm基因的重组DNA(pNT24)的大肠埃希氏菌NM522株，有来自大肠埃希氏菌的代有含pfkB基因的重组DNA(pNT47)的大肠埃希氏菌NM522株，有来自大肠埃希氏菌的代有含pgm和pfkB基因的重组DNA(pNT55)的大肠埃希氏菌NM522株。
利用(11)和(12)的酶活性从G-6-P和F-6-P提供Glc-1，6-P2从而使(8)的磷酸葡糖胺变位酶的表达活性增强的方法是本发明首次公开的。
利用(13)的半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)从GlcNAc制备GlcNAa-1，6-P2的方法是本发明首次公开的。可用该方法制备GlcNAc-1-P。即，可用半乳糖激酶强的微生物，例如带有含编码galK的基因的DNA片段和载体的重组DNA的微生物的培养液或该培养液的处理物作为酶源，使该酶源和GlcNAc存在于水溶性介质中，使GlcNAc-1-P在水溶性介质中生成和积累并从水溶性介质中回收GlcNAc-1-P。
在水溶性介质中回收GlcNAc-1-P，可以使用活性炭和离子交换树脂等常用的的方法。

(式3)(7)己糖激酶(EC 2.7.1.1)或葡糖激酶(EC 2.7.1.2)(8)磷酸葡糖胺变位酶(9)葡糖胺-1-磷酸乙酰基变位酶(10)N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶(EC 2.7.7.23)
(11)磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11)(12)磷酸葡糖变位酶(EC 2.7.5.1)(13)半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)在2)-④UDP-GalNAc的生产中，优选使用在下面通式3中所示的(7)到(12)和通式4所示的(14)以及通式1中所示的(4)的酶活性强的微生物，或者优选使用通式3中所示(13)和(10)，或者通式4中所示的(14)的酶活性强的微生物。
具体地说，可以例举出埃希氏菌属的微生物和棒杆菌属的微生物，优选的具体的例子有大肠埃希氏菌或产氨棒杆菌。
另外，可以使用其中选自(7)到(14)和(4)中至少之一的酶已由基因重组技术增强的转化株。

(式4)(14)UDP-GlcNAc 4-差向异构酶(EC 5.1.3.7)在2)-⑤UDP-GlcUA的生产中，优选使用在下面通式1中所式的(1)到(4)和通式5所示的(15)的酶活性强的微生物。
具体地说，可以例举出埃希氏菌属的微生物或棒杆菌属的微生物，优选的具体的例子有大肠埃希氏菌或产氨棒杆菌。
另外，可以使用其中选自(1)，(2)，(3)，(4)和(15)中至少之一的酶活性已由基因重组技术增强的转化株。

(式5)(15)UDP-Glc脱氢酶(EC 1.1.1.22)在2)-⑥GDP-Man的生产中，优选使用在下面通式6中所示的(16)到(18)和通式3所示的(11)和(12)的酶活性强的微生物。
具体地说，可以例举出埃希氏菌属的微生物或棒杆菌属的微生物，优选的具体的例子有大肠埃希氏菌或产氨棒杆菌。
另外，可以使用其中选自(16)，(17)和(18)的酶活性已由基因重组技术增强的转化株。该转化株的具体例子有来自大肠埃希氏菌的代有含ManB和ManC基因的重组DNA(pNK7)的大肠埃希氏菌NM522株，有来自大肠埃希氏菌的代有含glk基因的重组DNA(pNT46)的大肠埃希氏菌NM522株菌。
尽管对于(17)的磷酸甘露糖变位酶活性的表达和增强来说，必须添加Glc-1，6-P2，但可以不添加Glc-1，6-P2而通过使用其中(11)和(12)的酶活性已由基因重组技术增强的转化株而从G-6-P和F-6-P提供Glc-1，6-P2。该转化株的具体例子有来自大肠埃希氏菌的代有含pgm基因的重组DNA(pNT24)的大肠埃希氏菌NM522株，有来自大肠埃希氏菌的代有含pfkB基因的重组DNA(pNT47)的大肠埃希氏菌NM522株，有来自大肠埃希氏菌的代有含pgm和pfkB基因的重组DNA(pNT55)的大肠埃希氏菌NM522株等。
利用(11)和(12)的酶活性从G-6-P和F-6-P提供Glc-1，6-P2从而使(17)的磷酸甘露糖变位酶的表达活性增强的方法是本发明首次公开的。

(式6)(16)己糖激酶(EC 2.7.1.1.)或葡糖激酶(EC 2.7.1.2)(17)磷酸甘露糖变位酶(EC 2.7.5.7)(18)甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(EC 2.7.7.13)在2)-⑦GDP-Fuc的生产中，优选使用在下面通式7中所示的(19)和(20)和通式6所示的(16)到(18)以及通式3中所示的(11)和(12)的酶活性强的微生物。
具体地说，可以例举出埃希氏菌属的微生物或棒杆菌属的微生物，优选的具体的例子有大肠埃希氏菌或产氨棒杆菌。
另外，可以使用其中选自(16)，(17)，(18)，(19)和(20)中至少之一的酶活性已由基因重组技术增强的转化株。该转化株的具体例子有来自大肠埃希氏菌的代有含ManB和ManC基因的重组DNA(pNK7)的大肠埃希氏菌NM522株，自大肠埃希氏菌的代有含gmd和wcaG基因的重组DNA(pNK8)的大肠埃希氏菌NM522株，有来自大肠埃希氏菌的代有含glk基因的重组DNA(pNT46)的大肠埃希氏菌NM522株等。
尽管对于(17)的磷酸甘露糖变位酶活性的表达和增强来说，必须添加Glc-1，6-P2，但可以不添加Glc-1，6-P2而通过使用其中(11)和(12)的酶活性已由基因重组技术增强的转化株而从G-6-P和F-6-P提供Glc-1，6-P2。
该转化株的具体例子有来自大肠埃希氏菌的代有含pgm基因的重组DNA(pNT24)的大肠埃希氏菌NM522株，有来自大肠埃希氏菌的代有含pfkB基因的重组DNA(pNT47)的大肠埃希氏菌NM522株，有来自大肠埃希氏菌的代有含pgm和pfkB基因的重组DNA(pNT55)的大肠埃希氏菌NM522株等。

(式7)(19)GDP-Man-4，6-脱水酶(EC 4.2.1.47)(20)GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖差向异构酶/还原酶在2)-⑧CMP-NeuNAc的生产中，优选使用在下面通式8中所示的(21)，(22)或(23)，(24)和(25)的酶活性强的微生物。
具体地说，可以例举出埃希氏菌属的微生物或棒杆菌属的微生物，优选的具体的例子有大肠埃希氏菌或产氨棒杆另外，可以使用其中选自(21)，(22)，(23)，(24)和(25)中至少之一的酶活性已由基因重组技术增强的转化株。该转化株的具体例子有来自大肠埃希氏菌的代有含nanA基因的重组DNA(pNAL1)的大肠埃希氏菌C600株[应用和环境微生物学.，51，562，(1986)]，来自大肠埃希氏菌的代有含neuA基因的重组DNA(pTA14)的大肠埃希氏菌NM522株等。

(式8)(21)GlcNAc 2-差向异构酶(EC 5.1.3.8)(22)NeuAc醛缩酶(EC 4.1.3.3)(23)NeuAc合成酶(EC 4.1.3.19)(24)CMP-NeuAc合成酶(EC 2.7.7.43)(25)CTP合成酶(EC 6.3.4.2)当微生物通式具有1)的微生物的性质和2)的微生物的性质时，可以利用该微生物，从核苷酸的前体物质和糖产生糖核苷酸。
当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-①中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等UTP的前体物质和葡萄糖生产UDP-Glc；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-②中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等UTP的前体物质和半乳糖生产UDP-Gal；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-③中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等UTP的前体物质和葡糖胺和N-乙酰葡糖胺生产UDP-GlcNAc；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-④中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等UTP的前体物质和葡糖胺和N-乙酰葡糖胺生产UDP-GalNAc；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-⑤中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等UTP的前体物质和葡萄糖生产UDP-GlcUA；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-⑥中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从GMP等GTP的前体物质和甘露糖生产GDP-Man；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-⑦中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从GMP等GTP的前体物质和甘露糖生产GDP-Fuc；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-⑧中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等CTP的前体物质和N-乙酰葡糖胺以及N-乙酰甘露糖胺生产CMP-NeuAc。
这些微生物的具体例子有来自大肠埃希氏菌的能表达galT和galK基因的产氨棒杆菌。
与上述菌株情况不一样的情况是，当一个菌株仅具有生产糖核苷醇所需的部分活性时，可通过对具有各自活性的微生物的任意组合来生产糖核苷醇。
1)中所述的性质不必要仅由一种微生物所具有，可以利用构成1)的性质的两种以上的微生物。具体地说，有能表达来自大肠埃希氏菌的pyrG基因的大肠埃希氏菌和产氨棒杆菌的组合(特开平5-276974)。
同样地，2)中的性质也没有必要仅有一种微生物所具有，其性质可以由两种以上的微生物所具有。通过对这些微生物群体的任意组合，可以产生各种目的糖核苷酸。
例如，当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-①中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，可从乳清酸等UTP的前体物质和葡萄糖生产UDP-Glc；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-②中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等UTP的前体物质和半乳糖生产UDP-Gal；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-③中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等UTP的前体物质和葡糖胺或N-乙酰葡糖胺生产UDP-GlcNAc；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-④中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等UTP的前体物质和葡糖胺和N-乙酰葡糖胺生产UDP-GalNAc；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-⑤中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等UTP的前体物质和葡萄糖生产UDP-GlcUA；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-⑥中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从GMP等GTP的前体物质和甘露糖生产GDP-Man；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-⑦中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从GMP等GTP的前体物质和甘露糖生产GDP-Fuc；当微生物同时具有1)所述的微生物的性质和2)-⑧中所述的微生物的性质时，即可利用该微生物，从乳清酸等CTP的前体物质和N-乙酰葡糖胺或N-乙酰甘露糖胺生产CMP-NeuAc。
如上所述，在糖核苷酸的制备中，可以利用基因重组微生物，该制备方法涉及表2中所示的基因，这些基因克隆自大肠埃希氏菌，其碱基序列已被测定。
表2


涉及基因重组的各种方法可按已知的方法[如J.Sambrook等编分子克隆，操作指南，第二版，冷泉港实验室(1989)]进行操作，从带有含基因的质粒的大肠埃希氏菌分离纯化质粒DNA；质粒DNA的限制性酶切；切断后的DNA片段的分离纯化；用酶连接DNA片段；用重组DNA转化大肠埃希氏菌等。另外，可用Perkin-Elmer-Cetus公司生产的热循环仪进行聚合酶链反应(下文称为PCR)。
为了在宿主中表达与糖核苷酸相关的基因，以限制性酶类或PCR获得适当长度的含该基因的DNA片段，将含该基因的DNA片段导入表达载体的启动子的下游，接着将插入了上述DNA的表达载体导入合适的宿主中即可。
对宿主微生物来说，只要其可以表达目的基因即可。例如，可以例举出埃希氏菌属，沙雷氏菌属，棒杆菌属，短杆菌属，假单孢菌属，芽孢杆菌属的微生物，以及糖酵母属和假丝酵母属的酵母。
对所使用的载体来说，只要其可在上述宿主中自主复制或能整合到染色体中，并在与糖制备相关的基因转录的位置含有启动子即可。
当用上述的微生物作为宿主时，与糖核苷酸制备相关基因的表达载体应该可以在微生物宿主中自主复制并优选包含启动子，核糖体结合序列，与糖核苷酸制备相关的基因，转录终止序列。最好还含有启动子调控基因。
对表达载体来说，有例如，pBTrp2，pBTac2，pBTac1(均由BoehringerMannheim公司生产)，pKYP10(特开昭58-110600)，pKYP200[农业生物化学.，48，669(1984)]，pLSA1[农业生物化学.，53，277(1989)]，pGEL1[美国国家科学院院刊，824306(1985)]，pBluescript II SK+(STRATAGENE社制)，pTrS30[大肠埃希氏菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)调制]和pTrS32[大肠埃希氏菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)调制]，pUC19[基因，33，103(1985)]，pSTV28(宝酒造社制)，pPA1(特开昭63-233798)，pCG11(特公平6-91827)等。
对启动子来说，只要其可以在上述的宿主中表达即可。例如，来自大肠埃希氏菌和噬菌体的trp启动子，lac启动子，PL启动子，PR启动子。另外，人工设计和修饰的启动子如含有两个直线排列的trp启动子的trp串列启动子，tac启动子等。
对核糖体结合序列来说，只要其可在宿主中表达即可，优选使用将核糖体结合序列与起始密码子之间调节为合适的距离的质粒(例如，6-18个碱基)。
尽管对与糖核苷酸表达相关的基因的表达来说，转录终止序列并不总是必须的，但优选在结构基因的下游配置转卢终止序列。
对宿主来说，只要其能表达重组DNA并能利用于糖核苷酸的生成即可。具体地有大肠埃希氏菌XL1-Blue，大肠埃希氏菌XL2-Blue，大肠埃希氏菌DH1，大肠埃希氏菌MC1000，大肠埃希氏菌KY3276，大肠埃希氏菌W1485，大肠埃希氏菌JM109，大肠埃希氏菌HB101，大肠埃希氏菌No.49，大肠埃希氏菌W3110，大肠埃希氏菌NY49，大肠埃希氏菌KY8415，大肠埃希氏菌NM522，枯草芽孢杆菌，短芽孢杆菌，淀粉液化芽孢杆菌，未成熟短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)ATCC14068，解糖短杆菌ATCC14066，黄色短杆菌ATCC14067，乳发酵短杆菌ATCC13869，产氨棒杆菌ATCC21170，谷氨酸棒杆菌ATCC13032，嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870，嗜氨微杆菌ATCC15354，恶臭假单孢菌，粘质沙雷氏菌等。
在用酵母作宿主时，表达载体有例如YEp13(ATCC37115)，YEp24(ATCC37051)，Ycp50(ATCC37419)等。
对启动子来说，只要其能在酵母宿主中表达即可。例如，己糖激酶等糖酵解途径基因的启动子，gal 1启动子，gal 10启动子，热休克蛋白启动子，MFα1启动子，CUP1启动子。
对宿主来说，只要其是能表达重组DNA并可利用于糖核苷酸的酵母即可。具体地有啤酒糖酵母，产朊假丝酵母，近平滑假丝酵母，克鲁斯氏假丝酵母，易变假丝酵母，解脂假丝酵母，涎沫假丝酵母，季也蒙式假丝酵母，白色假丝酵母，土生假丝酵母，粉状毕赤酵母，奥默列氏毕赤酵母，白色球拟酵母，球面球拟酵母，Torulopsis xylinus，无名球拟酵母，易变球拟酵母，类球形德巴利氏酵母，Debaryomycescantarellii，球形德巴利氏酵母，汉逊氏德巴利氏酵母，日本德巴利氏酵母，Zygosaccharomyces rouxii，拜列氏结合酵母，乳克鲁维氏酵母，马克斯克克鲁维氏酵母，异常汉逊氏酵母，杰丁汉逊氏酵母，蓝母啤可酒香酵母，异酒香酵母，粟酒裂殖糖酵母，茁芽丝孢酵母和河岸许望氏酵母。
对本发明所用的微生物的培养来说，可以用常规的方法进行培养。对培养该微生物用的培养基来说，只要其含有可被该微生物同化的炭源，氮源和无机盐类并可以有效地培养该微生物。
炭源的例子有可被各种微生物同化的，如糖类葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，麦芽糖，甘露糖醇，山梨糖醇，蜂蜜，淀粉，淀粉水解物等。有机酸丙酮酸，乳酸，柠檬酸，富马酸等。各种氨基酸如谷氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸等。以及醇如乙醇，丙醇，甘油等。另外天然有机源有稻糠，木薯，蔗渣，玉米浆等。
氮源的例子有各种无机和有机铵盐氨，氯化铵，硫酸铵，碳酸铵，乙酸铵，磷酸铵等；氨基酸如谷氨酸，谷氨酰胺，甲硫氨酸等；胨，NZ胺，玉米浆，肉回收物，酵母回收物，麦芽回收物，酪蛋白水解物，大豆粉，鱼粉或其水解物等。
无机盐类有例如磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸镁，硫酸镁，氯化镁，氯化钠，氯化钙，硫酸亚铁，硫酸锰，硫酸铜，硫酸锌，碳酸钙等。如果需要，还可以加入维生素类，氨基酸类，核酸类等。
培养在振荡培养或通气搅拌培养等需氧条件下进行。优选培养温度为15-45℃，培养时间通常为5-96小时。在培养时pH保持3.0-9.0。调整pH时，可以使用无机或有机酸，碱溶液，尿素，碳酸钙，氨等。另外，在需要时可以向培养基中加入氨苄青霉素或四环素等抗生素。
在培养用含诱导性表达载体转化的微生物时，可以向培养基中加入诱导剂。例如在培养用含lac启动子的表达载体转化的微生物时，可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)；在培养用含trp启动子的表达载体转化的微生物时添加吲哆乙酸(IAA)。
在本发明的糖核苷酸的制备中，在使用两种以上的微生物时，可以将微生物分别培养或者在同一个培养容器中同时接种，混合培养后，将该培养液用于糖核苷酸的制备。另外，可以在各微生物的培养中或培养后的残存的微生物中接种其他的微生物，培养后，以培养也用于糖核苷酸的制备。另外，可以对具有1)的性质和2)的性质的微生物分别进行培养，并将培养液用于糖核苷酸的制备。
可以将该培养中得到的培养液和各培养液的各种处理物用作酶源，在水溶性介质中生成糖核苷酸。
培养液的处理物有培养液的浓缩物，培养液的干燥物，培养物离心分离得到的培养上清，该培养上清的浓缩物，从培养上清得到的酶样品，从培养液离心分离得到的细胞(含菌体)，该细胞的干燥物，该细胞的冷冻干燥物，该细胞的表面活性剂处理物，该细胞的超声波处理物，该细胞的机械磨碎处理物，该细胞的溶剂处理物，该细胞的酶处理物，该细胞的蛋白质分级分离物，该细胞的固定化物或者从该细胞抽提得到的酶样品等。
糖核苷酸生成中所用的酶源的量为，湿菌体1-500g/l，优选5-300g/l。另外，在利用两种以上的微生物在水溶性介质中进行反应时，水溶性介质中总的湿菌体的量为2-500g/l，优选5-400g/l。
糖核苷酸的生成中所用的水溶性介质有水，磷酸盐，碳酸盐，醋酸盐，硼酸盐，柠檬酸盐，Tris等的缓冲液，甲醇，乙醇等醇类，乙酸乙酯等酯类，丙酮等酮类，乙酰胺等酰胺类等。作为酶源的微生物的培养液也可以以水溶性介质的形式使用。
在糖核苷酸的生成中所用的核苷酸的前体物质有乳清酸，尿嘧啶，尿嘧啶，乳清苷，胞嘧啶，胞苷，腺嘌呤，腺苷，鸟嘌呤，鸟苷，次黄嘌呤，肌苷，黄嘌呤，黄苷，肌苷-5’-一磷酸，黄苷-5’-一磷酸，鸟苷-5’-一磷酸，尿苷-5’-一磷酸，胞苷-5’-一磷酸等。优选乳清酸和鸟苷-5’-一磷酸。对该前体物质来说，可以使用其纯品和含该前体物质的的培养液和该培养液中的前体物质的粗制品，只要其杂质不抑制反应即可。核苷酸前体物质的使用浓度为0.1-1.0M，优选为0.01-0.3M。
糖核苷酸生成中所用的糖有葡萄糖，果糖，半乳糖，葡糖胺，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，甘露糖，岩藻糖，N-乙酰甘露糖胺，乙酰神经氨酸等及其衍生物。糖，可以是纯品或者是含糖的物质，只要其中的杂质不影响反应即可。糖，可以在反应时一并加入，或分步加入或连续加入，浓度为0.1mM-2.0M。
在糖核苷酸生成中，必要时可以加入对ATP再生时必须的能量供体，辅酶，磷酸根离子，镁离子，肌醇六磷酸等螯合剂，表面活性剂和有机溶剂。
能量供体有葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，麦芽糖，甘露醇，山梨糖醇等糖类，丙酮酸，乳酸，乙酸，等有机酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸等氨基酸类，蜂蜜，淀粉水解物等，浓度为1.0mM-2.0mM。
磷酸根离子的例子有正磷酸和多磷酸如焦磷酸，三聚磷酸，四聚磷酸，四聚偏磷酸等。多聚偏磷酸和无机磷酸盐如磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠等多聚偏磷酸，浓度为1.0mM-1.0M。
镁离子的例子有如硫酸镁，硝酸镁，氯化镁等无机镁盐，柠檬酸镁等有机镁盐等，浓度为1-100mM。
可增强糖核苷酸产生的表面活性剂的例子有聚氧乙烯十八烷基酰胺等非离子型表面活性剂(如日本油脂社的Nymeen S-215)，十六烷基三甲基溴化铵，烷基二甲基苄基氯化铵等阴离子表面活性剂(例如日本油脂社的Cation F2-40E)，月桂酰基肌氨酸盐等阳离子表面活性剂和烷基二甲基胺等叔胺类(如日本油脂社的Tertiary Amine FB，其可单独或两个或两个以上的混合物。表面活性剂的浓度通常为0.1-50g/l。
有机溶剂的例子有二甲苯，甲苯，脂肪醇，丙酮，乙酸乙酯，等，使用浓度通常为0.1-50ml/l。
糖核苷酸反应可在水溶性介质中进行，pH为5-10，优选6-9，温度为20-50℃，时间2-96小时。
可用该方法生成糖核苷酸，例如尿苷二磷酸化合物，鸟苷二磷酸化合物和胞苷一磷酸化合物。具体地有选自UDP-Glc，UDP-Gal，UDP-GlcNAc，UDP-GalNAc，UDP-GlcUA，GDP-Man，GDP-Fuc，CMP-NeuAc等及其衍生物。
水溶性介质中生成的糖核苷酸的定量可按已知的方法进行，例如以分析生物化学216，188(1994)中记载的高效液相色谱(下文称为HPLC)对UDP-Glc和UDP-Gal进行分离定量。另外，可用下面的HPLC条件对UDP-GlcNAc，GDP-Man，GDP-Fuc，CMP-NeuAc进行分离定量。
洗脱液0.1M KH2PO4(用H3PO4调pH为3.2)流速1ml/min柱子Partisil-10SAX(Whatman)检测UV 262nm定量根据与标准吸光度进行比较而计算出来。
可用常规的活性炭和离子交换树脂法对反应液中生成的糖核苷酸进行回收。例如UDP-Gal UDP-Glc按组织化学杂志.，57，152(1992)的方法，UDP-GlcNAc按组织化学杂志.，57，146(1992)的方法进行。
能在本发明复合糖类制备中使用的微生物或动物细胞或昆虫细胞，只要其是可以从糖核苷酸和复合糖类前体物质产生复合糖类的微生物或动物细胞或昆虫细胞即可。这些微生物、动物细胞或昆虫细胞的实例包括那些具有以下酶活性的种类例如有葡糖酰基转移酶，半乳糖酰基转移酶，N-乙酰葡糖胺转移酶，N-乙酰半乳糖胺转移酶，葡糖醛酸基转移酶，甘露糖基转移酶，唾液酸基，岩藻糖基转移酶等。
另外，以重组DNA技术修饰的微生物，动物细胞，昆虫细胞也可以同样的方式用于糖核苷酸的制备。此类微生物，动物细胞，昆虫细胞的例子有表达来自人黑素瘤细胞系SK-Mel-28的神经酰胺葡糖酰基转移酶基因的大肠埃希氏菌(美国国家科学院院刊.，93，4638(1996))，产生β1，3-半乳糖基转移酶的人黑素瘤细胞系WM266-4(ATCC CRL 1676)，含来自人黑素瘤细胞系WM266-4的β1，3-半乳糖基转移酶基因的重组细胞系如namalwa细胞系KJM-1等(特开平6-181759)；表达来自人Hela细胞的β1，4-半乳糖基转移酶基因的大肠埃希氏菌(EMBOJ.，9，3171(1990))或啤酒糖酵母(生物化学与生物物理研究通讯.，201，160(1994))；表达大鼠β1，6-N-乙酰葡糖胺基转移酶基因的COS-7细胞(ATCC CRL 1651)(生物化学杂志.，268，15381(1993))；表达人N-乙酰葡糖胺基转移酶基因的sf9细胞系(生物化学杂志.，118，568(1995))；表达人葡糖醛酸基转移酶基因的大肠埃希氏菌(生物化学与生物物理研究通讯.，196，473(1993))；表达人α1，3-岩藻糖基转移酶基因的namalwa细胞系(生物化学杂志.，269，14730(1994))；表达人α1，3/1，4-岩藻糖基转移酶基因的COS-1细胞系(遗传和发育.，4，1288(1990))；表达人α1，2-岩藻糖基转移酶基因的COS-1细胞系(美国国家科学院院刊.，87，6674(1990))；表达鸡α2，6-唾液酸基转移酶基因的COS-7细胞系(欧洲生物化学杂志.，219，375(1994))；表达来自人α2，8-唾液酸转移酶的COS细胞系(美国国家科学院院刊.，91，7592(1994))；表达来自奈瑟氏球菌的β1，3-N-乙酰葡糖胺基转移酶，β1，4-半乳糖基转移酶，β1，3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶或α1，4-半乳糖基转移酶的大肠埃希氏菌(WO 96/10086)；表达来自奈瑟氏球菌的表达α2，3-唾液酸基转移酶的大肠埃希氏菌(生物化学杂志.，271，28271(1996))；表达来自幽门螺杆菌的α1，3-岩藻糖基转移酶的大肠埃希氏菌(生物化学杂志.，272，21349(1997))；表达来自酵母的表达α1，2-甘露糖基转移酶的大肠埃希氏菌(有机化学杂志.，58，3985(1993))。
当微生物被用于产生本发明的复合糖类时，可将该微生物培养在上述用于从糖核苷酸前体和糖产生糖核苷酸的微生物的相同的培养基中。
当用动物细胞产生复合糖类时，该动物细胞的培养基一般使用RPMI1640或Eagle氏MEM培养基，或向该培养基中添加了胎牛血清的培养基。培养通常在5％CO2的存在下进行。通常培养温度20-40℃，培养时间3-14天。必要时，可以添加抗生素。
当用昆虫细胞制备本发明的复合糖类时，该昆虫细胞的培养液按已知的方法进行(生物化学杂志.，268，12609(1993))。
可将该培养中得到的微生物或动物细胞或昆虫细胞的培养液以及该培养液的各种处理物作为酶源，在水溶性介质中生成复合糖类。培养液的处理物有培养液的浓缩物，培养液的干燥物，培养物离心分离得到的培养上清，该培养上清的浓缩物，从培养上清得到的酶样品，从培养液离心分离得到的细胞(含菌体)，该细胞的干燥物，该细胞的冷冻干燥物，该细胞的表面活性剂处理物，该细胞的超声波处理物，该细胞的机械磨碎处理物，该细胞的溶剂处理物，该细胞的酶处理物，该细胞的蛋白质分级分离物，该细胞的固定化物或者从该细胞抽提得到的酶样品等。
如果以37℃1分钟生成1μmol复合糖类的酶量为1活性单位的话，在复合糖类生成中所用的酶源的量为0.1mU/l-10000U/l，优选浓度为1mU/l-1000U/l。
复合糖类的生成中所用的水溶性介质有水，磷酸盐，碳酸盐，醋酸盐，硼酸盐，柠檬酸盐，Tris等的缓冲液，甲醇，乙醇等醇类，乙酸乙酯等酯类，丙酮等酮类，乙酰胺等酰胺类等。作为酶源的微生物，动物细胞或昆虫细胞的培养液也可以以水溶性介质的形式使用。
如果需要，可以加入肌醇六磷酸等螯合剂，氯化锰等无机盐，2-巯基乙醇等。
作为在复合糖类形成中使用的糖核苷酸，可以使用在上述糖核苷酸生成中生成的溶液或从该溶液中纯化而来的糖核苷酸，浓度为0.01mM-2.0M。
另外，可将用上述的方法制备的糖核苷酸应用于复合糖类形成反应中。
对用于复合糖类形成的复合糖类前体来说，只要其可被用作糖基转移酶的底物即可。例如，单糖类，寡糖类，与载体等连接的单糖类或寡糖类，蛋白类，肽类，脂类，糖蛋白类，糖脂类，糖肽类，甾类化合物等。
具体的例子有葡萄糖，半乳糖，甘露糖，唾液酸，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，乳糖，N-乙酰乳糖胺，乳-N-二糖，GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc，球状三糖(globotriose)，Galα1-4Galβ1-4GlcNAc，2’-岩藻糖基乳糖，3-岩藻糖基乳糖，3’-唾液酸基乳糖，6’-唾液酸基乳糖，3’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，6’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，唾液酸基-N-二糖，Lewis X，Lewisa，乳-N-四糖，乳-N-新四糖，乳二岩藻四糖，3’-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖，唾液酸基-Lewis X，唾液酸基-Lewis a，乳-N-岩藻五糖I，乳-N-岩藻五糖II，乳-N-岩藻五糖III，乳-N-岩藻五糖V，LS-四糖a，LS-四糖b，LS-四糖c，(α2，3)唾液酸基乳-N-新四糖及其衍生物，丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺及含这些氨基酸的肽类，神经酰胺及其衍生物等。复合糖类前体的使用浓度为0.01mM-2.0M。
本发明复合糖类的例子有含有至少一种选自如下的糖的复合糖类葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，葡糖醛酸，甘露糖，岩藻糖，唾液酸，乳糖，N-乙酰乳糖胺，乳-N-二糖，GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc，球状三糖(globotriose)，Galα1-4Galβ1-4GlcNAc，2’-岩藻糖基乳糖，3-岩藻糖基乳糖，3’-唾液酸基乳糖，6’-唾液酸基乳糖，3’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，6’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，唾液酸基-N-二糖，Lewis X，Lewis a，乳-N-四糖，乳-N-新四糖，乳二岩藻四糖，3’-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖，唾液酸基-Lewis X，唾液酸基-Lewisa，乳-N-岩藻五糖I，乳-N-岩藻五糖II，乳-N-岩藻五糖III，乳-N-岩藻五糖V，LS-四糖a，LS-四糖b，LS-四糖c，(α2，3)唾液酸基乳-N-新四糖，乳-N-二岩藻己糖I，乳-N-二岩藻己糖II，乳-N-己糖，乳-N-新己糖，二唾液酸基乳-N-四糖及其衍生物，及含上述复合糖类的复合糖类以及含上述复糖类的复合糖类。具体地，其包括有选自如下的糖键的糖的复合糖类Galβ1-3Glc、Galβ1-4Glc、Galβ1-3GlcNAc、Galβ1-4GlcNAc、Galβ1-3Gal、Galβ1-4Gal、Galβ1-3GalNAc、Galβ1-4GalNAc、Galα1-3Glc、Galα1-4Glc、Galα1-3GlcNAc，Galα1-4GlcNAc、Galα1-3Gal、Galα1-4Gal、Galα1-3GalNAc、Galα1-4GalNAc、GlcNAcβ1-3Gal、GlcNAcβ1-4Gal、GlcNAcβ1-6Gal、GlcNAcβ1-3Glc、GlcNAcβ1-4Glc、GlcNAcβ1-3GlcNAc、GlcNAcβ1-4GlcNAc、GlcNAcβ1-6GalNAc、GlcNAcβ1-2Man、GlcNAcβ1-4Man、GlcNAcβl-6Man、GalNAcβ1-3Gal、GalNAcβ1-4Gal、GalNAcβ1-4GlcNAc、GalNAcα1-3GalNAc、Manβ1-4GlcNAc、Manα1-6Man，Manα1-3Man，Manα1-2Man，GlcUAβ1-4GlcN、GlcUAβ1-3Gal、GlcUAβ1-3GlcNAc、GlcUAβ1-3GalNAc、NeuAcα2-3Gal、NeuAcα2-6Gal、NeuAcα2-3GlcNAc、NeuAc2-6GlcNAc、NeuAcα2-3GalNAc、NeuAcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、Fucα1-3Glc、Fucα1-4Glc、Fucα1-3GlcNAc、Fucα1-4GlcNAc、Fucα1-2Gal和Fucα1-6GlcNAc
另外，该复合糖类中所含的糖的个数为10个或以下，6个或以下。
具体的复合糖类的制备方法为(1)将能表达奈瑟氏球菌来源的β1，4-糖基转移酶(WO 96/10086)的微生物的培养液，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，以及能从糖和UTP产生UDP-Gal的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，半乳糖和葡萄糖产生乳糖。
(2)将能表达奈瑟氏球菌来源的β1，4-糖基转移酶(WO 96/10086)的微生物的培养液，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，以及能从糖和UTP产生UDP-Gal的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，半乳糖和N-乙酰葡糖胺产生N-乙酰乳糖胺。
(3)将能表达奈瑟氏球菌来源的α2，3-唾液酸基转移酶(生物化学杂志.，271，28271(1996))的微生物的培养液，能从CTP的前体物质产生CTP的微生物的培养液，以及能从糖和CTP产生CMP-NeuAc的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，N-乙酰甘露糖胺，丙酮酸和乳糖产生3’-唾液酸基乳糖。
(4)将能表达奈瑟氏球菌来源的α2，3-唾液酸基转移酶(生物化学杂志.，271，28271(1996))的微生物的培养液，能从CTP的前体物质产生CTP的微生物的培养液，以及能从糖和CTP产生CMP-NeuAc的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，N-乙酰甘露糖胺，丙酮酸和N-乙酰葡糖胺产生3’-唾液酸基-N-乙酰乳糖胺。
(5)将能表达小鸡来源的α2，6-唾液酸基转移酶(欧洲生物化学杂志.，219，375(1994))的COS-7细胞系的培养液，能从CTP的前体物质产生CTP的微生物的培养液，以及能从糖和CTP产生CMP-NeuAc的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，N-乙酰甘露糖胺，丙酮酸和N-乙酰乳糖胺产生6’-唾液酸基-N-乙酰乳糖胺。
(6)将能表达奈瑟氏球菌来源的β1，3-N-乙酰基葡糖胺基转移酶(WO 96/10086)的微生物的培养液，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，以及能从糖和UTP产生UDP-GlcNAc的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，N-乙酰葡糖胺和乳糖产生GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。
(7)将能产生β1，3-半乳糖基转移酶(ATCC CRL 1676)的人黑素瘤细胞系WM266-4的培养液或能表达来源于人黑素瘤细胞系WM266-4的β1，3-半乳糖基转移酶基因的namalwa细胞系KJM-1转化体的培养液(特开平6-181759)，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，以及能从糖和UTP产生UDP-Gal的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，半乳糖和GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc产生乳-N-四糖。
(8)将能表达来源于人Hela细胞系的β1，4-半乳糖基转移酶大肠埃希氏菌(EMBO J.，9，3171(1990))或啤酒糖酵母(生物化学和生物物理研究通讯.，201，160(1994))的培养液，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，以及能从糖和UTP产生UDP-Gal的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，半乳糖和GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc产生乳-N-新四糖。
(9)将能表达来源于奈瑟氏球菌的β1，4-半乳糖基转移酶(WO96/10086)的微生物的培养液，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，以及能从糖和UTP产生UDP-Gal的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，半乳糖和GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc产生乳-N-新四糖。
(10)将能表达来源于奈瑟氏球菌的β1，4-半乳糖基转移酶(WO96/10086)的微生物的培养液，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，能从糖和UTP产生UDP-GlcNAc的微生物的培养液以及能从糖和UTP产生UDP-Gal的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，N-乙酰葡糖胺，半乳糖和乳糖产生乳-N-新四糖。
(11)将能表达奈瑟氏球菌来源的α2，3-唾液酸基转移酶(生物化学杂志.，271，28271(1996))的微生物的培养液，能从CTP的前体物质产生CTP的微生物的培养液，以及能从糖和CTP产生CMP-NeuAc的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，N-乙酰甘露糖胺，丙酮酸和乳-N-新四糖产生(α2，3)唾液酸基乳-N-新四糖。
(12)将能表达人来源的α1，3-岩藻糖基转移酶(生物化学杂志.，269，14730(1994))的namalwa细胞系的培养液，能从GTP的前体物质产生GTP的微生物的培养液，以及能从糖和GTP产生GDP-Fuc的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从GMP，甘露糖，乳-N-新四糖产生乳-N-岩藻五糖III。
(13)将能表达幽门螺杆菌来源的α1，3-岩藻糖基转移酶(生物化学杂志.，272，21349和21357(1997))微生物的培养液，能从GTP的前体物质产生GTP的微生物的培养液，以及能从糖和GTP产生GDP-Fuc的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从GMP，甘露糖，乳-N-新四糖产生乳-N-岩藻五糖III。
(14)将能表达来源于奈瑟氏球菌的α1，4-半乳糖基转移酶(WO96/10086)的微生物的培养液，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，以及能从糖和UTP产生UDP-Gal的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，半乳糖和乳糖产生球状三糖。
(15)将能表达来源于奈瑟氏球菌的β1，4-半乳糖基转移酶(WO96/10086)的微生物的培养液，能表达来源于奈瑟氏球菌的α1，4-半乳糖基转移酶(WO 96/10086)的微生物的培养液，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，以及能从糖和UTP产生UDP-Gal的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，半乳糖和葡萄糖产生球状三糖。
(16)将能表达奈瑟氏球菌来源的α1，4-半乳糖基转移酶(WO96/10086)的微生物的培养液，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，以及能从糖和UTP产生UDP-Gal的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，半乳糖，N-乙酰乳糖胺产生Galα1-4Galβ1-4GlcNAc。
(17)将能表达人来源的β1，3-半乳糖基转移酶(特开平6-181759)的动物细胞系的培养液，能从UTP的前体物质产生UTP的微生物的培养液，以及能从糖和UTP产生UDP-Gal的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，半乳糖和N-乙酰葡糖胺产生乳-N-二糖。
(18)将能表达奈瑟氏球菌来源的α2，3-唾液酸基转移酶(生物化学杂志.，271，28271(1996))的微生物的培养液，能从CTP的前体物质产生CTP的微生物的培养液，以及能从糖和CTP产生CMP-NeuAc的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从乳清酸，N-乙酰甘露糖胺，丙酮酸和乳-N-二糖产生唾液酸基乳-N-二糖。
(19)将能表达人来源的α1，3-岩藻糖基转移酶(生物化学杂志.，269，14730(1994))的动物细胞系的培养液，能从GTP的前体物质产生GTP的微生物的培养液，以及能从糖和GTP产生GDP-Fuc的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从GMP，甘露糖和3’-唾液酸基-N-乙酰乳糖胺产生唾液酸基-Lewis X。
(20)将人α1，3/1，4-岩藻糖基转移酶(糖类研究.，190，1，(1989))，能从GTP的前体物质产生GTP的微生物的培养液，以及能从糖和GTP产生GDP-Fuc的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，进行酶反应，可从GMP，甘露糖和唾液酸基乳-N-二糖产生唾液酸基-Lewis a。
(21)将能表达酵母来源的α1，2-甘露糖基转移酶(有机化学杂志.，58，3985，(1993))，能从GTP的前体物质产生GTP的微生物的培养液，以及能从糖和GTP产生GDP-Man的微生物的培养液或这些培养物的处理物作为酶源，可从GMP和甘露糖通过酶反应产生Manα1-2Man。
复合糖类的制备方法不受上述例子的限制，可在本发明的糖基转移酶的范围内结合本文所述的糖核苷酸的制备方法并在该酶的底物特异性范围内，以核苷酸前体物质，糖和复合糖类前体物质作为原料工业化生产这样的糖链。
能用本发明的制备方法制备的复合糖类有，例如(1)与病原性微生物和病毒感染相关的复合糖类，例如，作为病原性微生物和病毒的受体进行识别的复合糖类；(2)作为病原性微生物和病毒产生的毒素的受体进行识别的复合糖类；(3)在生物体内与细胞粘着，异物识别以及各种淋巴因子的结合相关的复合糖类，例如以化学上可结合的方式含有如下一个或多个糖的复合糖类葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，葡糖醛酸，甘露糖，N-乙酰甘露糖胺，果糖和唾液酸等。其具体的例子有(1)包含在人和动物乳汁中并参与抗微生物感染保护的复合糖类，例如，乳-N-四糖，乳-N-新四糖等复合糖类；
(2)识别，下述微生物的受体的复合糖类，例如大肠埃希氏菌，颗粒丙酸杆菌，结核分枝杆菌，粘膜炎莫拉氏菌，白色假丝酵母，腐生葡萄球菌，肺炎链球菌，无乳链球菌，铜绿假单孢菌，内氏放线菌，淋病奈瑟氏球菌，幽门螺杆菌，流感嗜血菌等。
(3)病毒如流感病毒，冠形病毒，仙台病毒，新城疫病毒，呼肠弧病毒，轮状病毒，艾滋病病毒(HIV)等的受体复合糖类；(4)原生动物如，隐子芥属(Cryptosporidium)，锥体虫属等；(5)与毒素有亲和性的受体复合糖类，毒素有例如霍乱毒素，大肠埃希氏菌热不稳定毒素，肉毒杆菌毒素，梭菌δ毒素，梭菌A毒素，志贺菌毒素，Vero细胞毒素，志贺样毒素，副溶血弧菌热稳定毒素，破伤风毒素等。
(6)癌症相关复合糖类，如神经节苷脂类(例如GD3，GM3等)，红细胞糖苷脂，糖脂类等。
(7)与白细胞向炎症区粘附及其功能修饰相关的复合糖类，例如唾液酸基-Lewis X糖链等。
(8)与自身免疫病如类风湿性关节炎，IgA肾小球肾炎等相关的复合糖类。
(9)与识别异物和癌细胞相关的被各种凝集素样的物质所识别的复合糖类。
可根据已知的方法对在水溶性介质中生成的复合糖类进行定量(美国国家科学院院刊.，85，3289(1988)，分析生物化学.，174，459(1988))。
可根据常规的如活性炭，离子交换树脂等方法对在反应液中生成的复合糖类进行回收，例如可根据组织化学杂志.，47，5416(1982)中所述的方法回收N-乙酰乳糖胺。
下面将用实施例说明本发明，但不限制本发明。
以下为本发明的实施例。
实施发明的最佳方式实施例1.galU，ppa表达重组质粒的构建下面对galU，ppa表达重组质粒pNT12的构建方法进行描述(图1，图2)。
1)含PL启动子的表达载体的构建用下述的方法构建含PL启动子的表达载体pPA31和pPAC31(图1)。
将带有含色氨酸启动子的质粒pTrS30的大肠埃希氏菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)和带有含PL启动子的pPA1质粒(特开昭63-233798)以及含PL启动子和cI857阻遏物的质粒pPAC1(FERM BP-6054)的大肠杆菌细胞分别接种在LB培养基[10g/l细菌培养用蛋白胨(Difco产)，5g/l酵母回收物(Difco产)，NaCl 5g/l，pH 7.2]并30℃培养18小时。
可用已知的方法，从该培养得到的菌体中分离纯化出pTrS30，pPA1，pPAC1质粒的DNA。
用限制性酶PstI和ClaI切割纯化后的pTrS30 DNA 0.2μg，之后用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene CleanII(Bio 101社制)试剂盒回收3.4kb的片段。将0.5μg纯化的pPA1 DNA用限制性酶PstI和ClaI切割后，用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收1.0kb的DNA片段。
将该3.4kb和1.0kb DNA片段用连接反应试剂盒(TAKARA ligationkit宝酒社造)，于16℃进行16小时的连接反应。根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml青霉素的LB琼脂培养基中，37℃培养过夜。
根据上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到含PL启动子的表达载体pPA31。经限制性酶消化以确认该质粒的结构(图1)。
用限制性酶PstI和ClaI切割纯化后的pPA31 DNA 0.2μg，之后用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene CleanII(Bio 101社制)试剂盒回收3.4kb的片段。将0.5μg纯化的pPAC1 DNA用限制性酶PstI和ClaI切割后，用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收2.3kb的DNA片段。
将该3.4kb和2.3kb DNA片段用连接反应试剂盒(TAKARA ligationkit宝酒社造)，于16℃进行16小时的连接反应。根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml青霉素的LB琼脂培养基中，37℃培养过夜。
根据上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到含受cI857阻遏物影响的PL启动子的表达载体pPAC31。经限制性酶消化以确认该质粒的结构(图1)。
2)galU表达质粒的构建用已知的方法分离纯化大肠埃希氏菌W3110的染色体DNA[例如，当今分子生物学方法，John Wielyand Sons Inc.(1994)]。
用Appiled Biosystems公司的380A DNA合成仪合成序列号1中所示的有义链DNA引物和序列号2中所示的反义链引物。
以该合成DNA作为引物，W3110株的染色体DNA作为模板进行PCR反应。在40μl的反应液中含有W3110染色体DNA 0.04μg，引物各0.5μM，TAKARA Ex Taq(宝酒造)1.0U，10×ExTaq缓冲液(宝酒社造)4μl，dNTP各200μM，于94℃1分钟，42℃2分钟，72℃3分钟30个循环进行PCR反应。
将1/10量的反应液上琼脂糖凝胶电泳以确证目的片段的扩增，剩下的反应液加入等量(1vol/1vol)的用TE[10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mMEDTA]饱和的苯酚/氯仿，并混合。将该混合液离心分离后，在得到的上成液中加入2倍量的冷乙醇进行混合，-80℃放置30分钟。将该放置液离心分离得到DNA沉淀。将该沉淀用70％冷乙醇洗涤，真空干燥得到沉淀。下文，将加入TE饱和的苯酚/氯仿，用乙醇洗涤沉淀得到DNA沉淀的操作称为乙醇沉淀法。
将该DNA用20μl TE溶解。将5μl该溶解液用DNA限制性酶HindIII和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒回收0.9kb的DNA片段。将实施例1-1)中得到的pPA31 DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收4.2kb的DNA片段。
将该0.9kb和4.2kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌KY8415株，将该转化体涂布在含50μg/ml青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
根据上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达galU的质粒pNT9。经限制性酶消化以确认该质粒的结构(图2)。
3)同时表达galU，ppa的质粒的构建合成了序列号3所示的有义链引物和序列号4所示的反义引物，以该合成的DNA为引物W3110株的染色体DNA为模板，按上述的相同条件进行PCR。
PCR反应后，用乙醇沉淀法得到DNA沉淀。
将该DNA用20μl TE溶解。将5μl该溶解液用DNA限制性酶BamHI和SalI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene CleanII试剂盒回收1.0kb的DNA片段。将实施例1-2)中得到的pNT9 DNA 0.2μg用限制性酶BamHI和SalI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收4.9kb的DNA片段。
将该1.0kb和4.9kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌KY8415株，将该转化体涂布在含50μg/ml青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
根据上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到同时表达galU，ppa的质粒pNT12。经限制性酶消化以确认该质粒的结构(图2)。
将该pNT12 DNA 0.5μg用限制性酶EcoRI和SalI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒回收2.2kb的DNA片段。令一方面，将pSTV28 DNA(宝酒社造)0.2μg用限制性酶EcoRI和SalI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收3.0kb的DNA片段。
将该2.2kb和3.0kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含10μg/ml氨霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
根据上述已知的方法从培养的转化体菌落中回收质粒，得到同时表达galU，ppa的质粒pNT32。经限制性酶消化以确认该质粒的结构(图2)。
实施例2.UDP-Glc的生产将实施例1得到的大肠埃希氏菌KY8415/pNT12株接种到在1L带档板的锥形瓶中的125ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，30℃220rpm的条件下培养17小时。将该培养液125ml接种到存在于5L培养容器中的2.5L的液体培养基(pH无需调整)中，其中该液体培养基含有葡萄糖10g/l，细菌培养用蛋白胨(Difco)12g/l，酵母回收物(Difco)24g/l，KH2PO42.3g/l(另外灭菌)，K2HPO412.5g/l(另外灭菌)，氨苄青霉素50μg/ml；在600rpm，通气量2.5L/分的条件下于30℃培养4小时，接着在40℃培养3小时。
在该培养中，使用28％的氨水使培养液的pH维持在7.0。另外，必要时可在培养中加入葡萄糖。将该培养液离心分离得到湿菌体。必要时，可将这些湿菌体保存于-20℃并在使用前解冻。
将产氨棒杆菌ATCC 21170株接种在存在于300ml体积的带挡板的锥形瓶的20ml液体培养基中，于28℃220rpm的条件下培养24小时，其中该液体培养基含有葡萄糖50g/l，蛋白胨(日本制药)10g/l，酵母回收物(Oriental Yeast产)10g/l，尿素5g/l，(NH4)2SO45g/l，KH2PO41g/l，K2HPO43g/l，MgSO4.7H2O 1g/l，CaCl2.2H2O 0.1g/l，FeSO4.7H2O 10mg/l，ZnSO4.7H2O 10mg/l，MnSO4.4-6H2O 20mg/l，L-半胱氨酸20mg/l，D-泛酸钙10mg/l，维生素B15mg/l，烟酸5mg/l生物素30μg/l(10N NaOH调pH为7.2)。
将20ml该培养液接种到含250ml的上述相同液体培养基的2L带挡板的锥形瓶中，28℃220rpm的条件下，培养24小时。
将该种培养液250ml接种到含2.25L液体培养基的5L的培养容器中，于32℃600rpm，通气量2.5L/min的条件下培养24小时；其中液体培养基由如下物质组成葡萄糖150g/l，肉回收物(极东制药)5g/l，KH2PO410g/l，K2HPO410g/l，MgSO4.7H2O 10g/l，CaCl2.2H2O 0.1g/l，FeSO4.7H2O 20mg/l，ZnSO4.7H2O 10mg/l，MnSO4.4-6H2O 20mg/l(另外灭菌)，β-丙氨酸15mg/l(另外灭菌)，L-半胱氨酸20mg/l，生物素100μg/l，尿素2g/l，维生素B1 5mg/l(另外灭菌)(10N NaOH调pH为7.2)。在培养中，使用28％的氨水使pH维持在6.8。
将该培养液离心分离得到湿菌体。该湿菌体必要时可保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌KY8415/pNT12湿菌体40g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株150g/l，葡萄糖100g/l，KH2PO420g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(钾盐)21.2g/l，Nymeen S-2154g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)于32℃反应21小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入葡萄糖和KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了43.9g/l的UDP-Glc(2Na盐)。
实施例3.表达galT，galk的重组质粒的构建下面描述表达galT，galk的重组质粒pNT25的构建方法(图3)。
合成了序列号5的有义链DNA引物，序列号6的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，W3110株的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶Hind III和HincII切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene CleanII试剂盒回收2.3kb的片段。将pluescriptIISK+DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和EcoRV切断后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收3.0kb的片段。
将该2.3kb和3.0kb的片段用连接反应试剂盒在16℃进行16小时连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml的LB琼脂培养基上，于30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到含galT，galK基因的质粒pNT19。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图3)。
将该pNT19 DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒回收2.2kb的DNA片段。实施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收5.5kb的DNA片段。
将该2.3kb和5.5kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到同时表达galT，galK基因的质粒pNT25。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图3)。
实施例4.UDP-Gal的生产1)galT，galK，galU，ppa表达株的构建用常规方法以实施例1-3)中得到的pNT32 DNA转化大肠埃希氏菌NM522/pNT25株，将得到的转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上，于30℃培养过夜。选择生长的转化体，得到galT，galK，galU，ppa表达株大肠埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32。
2)UDP-Gal的构建用与实施例2同样的方法培养在实施例4-1)中得到大肠埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32株，将得到的培养物离心分离得到湿菌体。另外，以与实施例2相同的方法培养产氨棒杆菌ATCC 21170株，将得到的培养物离心分离得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌KY8415/pNT25/pNT32湿菌体50g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株150g/l，葡萄糖80g/l，半乳糖20g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(钾盐)21.2g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液2L接种到5L的培养容器中，在600rpm搅拌下，1L/min通气于32℃反应26小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入葡萄糖和KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了47.4g/l的UDP-Gal(2Na盐)。实施例5.能在产氨棒杆菌中表达galT，galK的重组质粒的构建下面描述能在产氨棒杆菌中表达来源于大肠埃希氏菌的galT，galK的重组质粒pTK7的构建(图4)。
1)pCG116的构建能在产氨棒杆菌中复制的质粒pCG116的构建如下将质粒pCG11(特公平6-91827)用DNA限制性酶PstI和StuI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒回收6.5kb的片段。
另一方面，将质粒pUC19 DNA 1.0μg用限制性酶EcoRI切断后，用DNA末端平滑化试剂盒(宝酒造社制)。用PstI切割末端平滑化的DNA，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用MERmaid(Bio101)s试剂盒回收43bp的片段。
将该6.5kb和43bp的片段用连接反应试剂盒在16℃进行16小时连接反应。
根据电穿孔的方法[FEMS微生物学快报.，65，299(1989)]用该连接反应液转化产氨棒杆菌ATCC21170株，将该转化体涂布在含100μg/ml壮观霉素的LB琼脂培养基上，于30℃培养2天。
用上述已知的方法[细菌学杂志.，159，306(1984)]从生长的转化体菌落中回收质粒，得到质粒pCG116。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图4)。
2)galT，galK表达质粒pTK7的构建将实施例3得到的galT，galK表达质粒pNT25 DNA 1.0μg用限制性酶XhoI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用GeneClean II试剂盒回收3.5kb的DNA片段。
另一方面，实施例5-1)中得到的pCG116 DNA 0.5μg用限制性酶SalI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收6.5kb的DNA片段。
将该3.5kb和6.5kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据电穿孔的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌ATCC21170株，将该转化体涂布在含100μg/ml壮观霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养2天。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到同时表达galT，galK基因的质粒pTK7。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图4)。
实施例6.UDP-Gal的生产用与实施例2同样的方法将在实施例5中得到的产氨棒杆菌ATCC21170/pTK7株于32℃培养20小时后，再于40℃培养4小时，将得到的培养物离心分离得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由产氨棒杆菌ATCC21170/pTK7株湿菌体150g/l，葡萄糖40g/l，半乳糖20g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(钾盐)10.6g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml置于到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应22小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入果糖，半乳糖和KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了7.2g/l的UDP-Gal(2Na盐)。
实施例7.glmU，ppa，pgm，glmM，glk，pfkB的表达质粒的构建1)glmU，ppa表达质粒的构建合成了序列号7的有义链DNA引物，序列号8的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，W3110株的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶Hind III和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene CleanII试剂盒回收1.4kb的片段。将实施例1-1)得到pPA31 DNA 0.5μg用限制性酶HindIII和BamHI切断后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收4.2kb的片段。
将该1.4kb和4.2kb的片段用连接反应试剂盒在16℃进行16小时连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌KY8415株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，于30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长出的转化体菌落中回收质粒，得到含glmU基因的质粒pNT10。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图5)。
将实施例1-3)得到的pNT12 DNA 0.5μg用限制性酶BamHI和SalI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收1.0kb的DNA片段。将上述的pNT10 DNA 0.2μg用限制性酶BamHI和SalI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收5.3kb的DNA片段。
将该1.0kb和5.3kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌KY8415株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到同时表达glmU，ppa基因的质粒pNT14。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图5)。
2)pgm表达质粒的构建合成了序列号9的有义链DNA引物，序列号10的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，W3110株的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒回收1.8kb的片段。将实施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收5.5kb的DNA片段。
将该1.8kb和5.5kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达pgm的质粒pNT24。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图6)。
3)glmM的表达质粒的构建合成了序列号11的有义链DNA引物，序列号12的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，大肠埃希氏菌W3110株的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene CleanII试剂盒回收1.6kb的片段。将实施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收5.5kb的DNA片段。
将该1.6kb和5.5kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达glmM的质粒pNT44。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图7)。
4)glk表达质粒的构建合成了序列号13的有义链DNA引物，序列号14的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，大肠埃希氏菌W3110株的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒回收0.5kb的片段。
将实施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收4.2kb的DNA片段。
将该0.5kb和4.2kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达glk的质粒pNT45。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图8)。
用上述同样的条件进行PCR，将得到的溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收0.5kb的片段。将上述方法中得到的pNT45 DNA 0.2μg用限制性酶HindIII切断后，用碱性磷酸酶进行脱磷酸化处理，然后上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收4.7kb的DNA片段。
将该0.5kb和4.7kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达glk的质粒pNT46。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图8)。
5)pfkB的表达质粒的构建合成了序列号15的有义链DNA引物，序列号16的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，W3110株的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和EcoRV切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene CleanII试剂盒回收1.3kb的片段。将pBluescriptII SK+DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和EcoRV切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收3.0kb的DNA片段。
将该1.3kb和3.0kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到含pfkB基因的质粒pNT43。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图9)。
将该pNT43 DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和SacI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收1.3kb的片段。
将实施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和SacI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收5.7kb的DNA片段。
将该1.3kb和5.7kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达pfkB的质粒pNT47。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图9)。
实施例8.UDP-GlcNAc的生产用与实施例2相同的方法培养在实施例7中得到的大肠埃希氏菌KY8415/pNT14，NM522/pNT24，NM522/pNT44，NM522/pNT47株，将得到的各培养物离心分离得到湿菌体。必要时可将湿菌体保存于-20℃，并于使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pNT24湿菌体6g/l，NM522/pNT47湿菌体6g/l，100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，6mM MgCl2.6H2O，10mM葡萄糖-6-磷酸，2.5mM果糖-6-磷酸，2.5mM ATP，Nymeen S-2154g/l组成的0.1ml反应液加入到1.5ml的试管中，37℃反应1小时。将反应液在65℃处理5分钟后，添加菌体和底物如大肠埃希氏菌KY8415/pNT14湿菌体0.3g/l，NM522/pNT44湿菌体6g/l，5mM葡糖胺-6-磷酸，5mM乙酰辅酶A，5mM UTP，于37℃再反应30分钟；在反应液中生成了2.5mM(1.6g/l)的UDP-GlcNAc(2Na盐)。而在不添加大肠埃希氏菌NM522/pNT24株湿菌体或NM522/pNT47株湿菌体时，UDP-GlcNAc的生成量分别为0.08mM和0.16mM。
这些结果表明通过将pgm表达株和pfkB表达株组合起来，就可以提供对glmM的活性表达必需的Glc-1，6-P2。
实施例9.UDP-GlcNAc的生产用与实施例2相同的方法培养在实施例7中得到的大肠埃希氏菌KY8415/pNT14，NM522/pNT24，NM522/pNT44，NM522/pNT46，NM522/pNT47株，将得到的各培养物离心分离得到湿菌体。另外，可用同实施例2相同的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，并离心分离得到的培养物以得到湿菌体。必要时可将湿菌体保存于-20℃，并于使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌KY8415/pNT14株，NM522/pNT24，NM522/pNT44，NM522/pNT47株，NM522/pNT46株的湿菌体各10g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株150g/l，果糖50g/l，葡糖胺盐酸盐80g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(钾盐)10g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的30ml反应液加入到200ml的烧杯中，将该反应液在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)于32℃反应10小时。
在反应中用4N NaOH维持pH在7.2，必要时加入果糖，KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生产了6.2g/l的UDP-GlcNAc(2Na盐)。
实施例10.galK表达质粒的构建将实施例3-1)中得到的pNT25 DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和EcoRV切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene CleanII试剂盒回收6.7kb的DNA片段。所回收的DNA片段用DNA末端平滑化试剂盒使其末端平滑后，用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达galK的质粒pNT54。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图10)。
实施例11.UDP-GlcNAc的生产用与实施例2同样的方法将在实施例10中得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT54株，将得到的培养物离心分离得到湿菌体。另外，用与实施例2同样的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，将得到的培养物离心分离，得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pNT54株湿菌体50g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株湿菌体150g/l，果糖40g/l，N-乙酰葡糖胺67g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(钾盐)10g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应27小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入葡萄糖和KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了17.1g/l的UDP-GlcNAc(2Na盐)。
实施例12.UDP-GlcNAc与UDP-Gal的同时生产用与实施例2同样的方法培养在实施例3中得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT25株，将得到的培养物离心分离得到湿菌体。另外，用与实施例2同样的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，将得到的培养物离心分离，得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pNT25株湿菌体25g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株湿菌体150g/l，果糖60g/l，N-乙酰葡糖胺50g/l，半乳糖40g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(钾盐)10g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应24小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了11.4g/l的UDP-GlcNAc(2Na盐)和18g/l UDP-Gal(2Na盐)。
实施例13.manB，manC，pgm，pfkB表达质粒的构建1)manB，manC表达质粒的构建合成了序列号17的有义链DNA引物，序列号18的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，大肠埃希氏菌W3110株的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μlTE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene CleanII试剂盒回收3.0kb的片段。将pBluescriptII SK+DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和BamHI切断后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收3.0kb的片段。
将该两个3.0kb的片段用连接反应试剂盒在16℃进行16小时连接反应。根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，于30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到含manB和manC的质粒pNK6。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图11)。
将该pNK6 DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收3.0kb的DNA片段。将在实施例1-1)中得到的pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收5.5kb的DNA片段。
将该3.0kb和5.5kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到同时表达manB和manC的质粒pNK7。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图11)。
2)同时表达pgm，pfkB质粒的构建将实施例7中得到的pNT24的DNA 0.5μg用DNA限制性酶XhoI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒回收3.0kb的片段。另一方面将pSTV28 DNA(宝酒造社制)0.2μg用限制性酶SalI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收3.0kb的DNA片段。
将该两个3.0kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达pgm基因的质粒pNT53。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图12)。
合成了序列号19的有义链DNA引物，以该有义链DNA的引物和序列号16的反义链DNA引物作为引物，实施例7中得到的质粒pNT47作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶EcoRV和BglII切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收1.3kb的片段。将pNT53 DNA 0.2μg用限制性酶SmalI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收6.0kb的DNA片段。
将该1.3kb和6.0kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达pgm和pfkB的质粒pNT55。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图12)。
实施例14.GDP-Man的生产1)manB，manC，pgm，pfkB的表达株的制备根据常规方法用在实施例13-2)中得到的pNT55转化大肠埃希氏菌NM522/pNK7，将该转化体涂布在含50μg/ml和10μg/ml氯霉素的LB培养基，于30℃培养过夜。从所选择的生长的转化体中得到表达manB，manC，pgm，pfkB的表达株大肠埃希氏菌NM522/pNK7/pNT55株。
2)GDP-Man的生产用与实施例2同样的方法分别培养在上述1)中得到的大肠埃希氏菌NM522/pNK7/pNT55和实施例7中得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT46株，将得到的培养物离心分离得到湿菌体。另外，用与实施例2同样的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，将得到的培养物离心分离，得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pNK7/pNT55株湿菌体25g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株湿菌体150g/l，果糖60g/l，甘露糖50g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，GMP(2Na，7H2O盐)60g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应24小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了14.6g/l的UDP-Man(2Na，1H2O盐)。
实施例15.gmd，wcaG表达质粒的构建合成了序列号20的有义链DNA引物，序列号21的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，大肠埃希氏菌W3110株的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和XhoI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒回收2.3kb的片段。
将实施例1-1)中得到的pPA31 DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和SalI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收3.9kb的DNA片段。
将该2.3kb和3.9kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达gmd，wcaG的质粒pNK8。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图13)。
实施例16.GDP-Fuc的生产用与实施例2同样的方法将在实施例14中得到的大肠埃希氏菌NM522/pNK7/pNT55，在实施例15中得到的NM522/pNK8株和实施例7中得到的NM522/pNT46株，将得到的各培养物离心分离得到湿菌体。另外，用与实施例2同样的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，将得到的培养物离心分离，得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pNK7/pNT55株湿菌体25g/l，大肠埃希氏菌NM522/pNK8 25g/l，大肠埃希氏菌NM522/pNT46 25g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株湿菌体150g/l，果糖40g/l，甘露糖60g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，GMP(2Na，7H2O盐)60g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应24小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了1.0g/l的UDP-Fuc(2.5Na，1H2O盐)。
实施例17.neuA表达质粒的构建用同实施例1同样的方法制备大肠埃希氏菌K235株(ATCC 13027)。
合成了序列号22的有义链DNA引物，序列号23的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，大肠埃希氏菌K235株(ATCC13027)的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶EcoRI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene CleanII试剂盒回收1.3kb的片段。将pBluescript IISK+DNA 0.2μg用限制性酶EcoRI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收3.0kb的DNA片段。
将该1.3kb和3.0kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达neuA的质粒pTA12。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图14)。
将pTA12 DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收1.3kb的DNA片段。将实施例1-1)中得到pPAC31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收5.5kb的DNA片段。
将该1.3kb和5.5kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达neuA的质粒pTA14。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图14)。
实施例18.CMP-NeuAc的生产用与实施例2同样的方法将在实施例17中得到的大肠埃希氏菌NM522/pTA14C600/pNAL1株[应用和环境微生物学.，51，562(1986)]和JF646/pMW5株[生物化学杂志.，261，5568(1986)]，将得到的各培养物离心分离得到湿菌体。另外，用与实施例2同样的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，将得到的培养物离心分离，得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pTA14株湿菌体50g/l，大肠埃希氏菌C600/pNAL1湿菌体15g/l，大肠埃希氏菌JF646/pMW5株湿菌体25g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株湿菌体150g/l，乳清酸(钾盐)10g/l，丙酮酸(钠盐)20g/l，果糖40g/l，N-乙酰甘露糖胺10g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应24小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了2.7g/l的CMP-NeuAc(Na盐)。
实施例19.乳-N-四糖的生产1)β1，3-半乳糖基转移酶的制备将用含编码蛋白质A的IgG的结合区和β1，3-半乳糖基转移酶的融合蛋白的基因的质粒pAMoERSAW1(特开平6-181759)转化的namalwaKJM-1的细胞株，以5×104细胞/ml的浓度悬浮在含0.5mg/mlG418(Gibco)的30ml RPMI 640。ITPSGF培养基中，于37℃在CO2培养箱中培养8天。
将该培养液离心得到去除了细胞的上清。必要时，可将该上清保存在-80℃，并在使用前解冻。
向已形成了蛋白质A的IgG结合区与β1，3-半乳糖基转移酶的融合蛋白的上清中加入叠氮化钠至终浓度为0.1％并加入已根据生产商的说明预处理过的IgG Sepharose(Pharmacia)50μl；4℃缓慢搅拌过夜。
搅拌后，通过离心分离回收结合了IgG Sepharose的β1，3-半乳糖基转移酶，用1ml的RPMI 640。ITPSGF培养基洗涤3次，将该IgGSepharose用作β1，3-半乳糖基转移酶的酶源。
2)乳-N-四糖的生产根据已知的方法[农业生物化学.，54，2169(1990)]用2-氨基吡啶对乳-N-新四糖(Oxford Glycosystems)进行荧光标记并与0.1Uβ-半乳糖苷酶(生化学工业社制)混合，然后在37℃反应16小时以去除非还原端的半乳糖。
将该反应液在100℃加热5分钟，使β-半乳糖苷酶失活。
将在该反应液中得到的GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc作为复合糖类的前体物质。
将有该复合糖类前体物质0.5mM，上述步骤1)中得到的IgGSepharose结合的β1，3-半乳糖基转移酶0.5U，含实施例4得到的UDP-Gal的反应液6μl(5mM)，100mM Tris-HCl(pH 7.9)，10mMMnCl2，2mM 2-巯基乙醇组成的反应液36μl，于32℃反应65小时。
反应结束后，用下述条件的HPLC对该反应液中积累的生物物质进行定量。
柱子TSKgel ODS-80TM柱(4.6mm×30cm，TOSOH社制)液相0.02M醋酸氨缓冲液(pH4.0)温度50℃流速1ml/min检出荧光检测器(激发波长320hm，发射波长400nm)通过将标记产物的洗脱时间与氨基吡啶标记乳-N-四糖的洗脱时间进行比较而对产物进行鉴定。
通过该反应，生产了0.17mM(0.12g/l)乳-N-四糖。
实施例20.乳-N-新四糖的生产用与实施例19相同的方法，从乳-N-新四糖制备GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc并用作复合糖类的前体物质。
将有该复合糖类前体物质0.5mM，1，4-半乳糖基转移酶(Sigma)0.5U，含实施例4得到的UDP-Gal的反应液6μl(5mM)，100mMTris-HCl(pH 7.9)，10mM MnCl2，2mM 2-巯基乙醇组成的反应液36μl，于32℃反应65小时。
反应结束后，用与实施例19-2)相同的条件的HPLC对该反应液中积累的生物物质进行定量。另外，通过将标记产物的洗脱时间与氨基吡啶标记乳-N-新四糖的洗脱时间进行比较而对产物进行鉴定。
通过该反应，生产了0.15mM(0.11g/l)的乳-N-新四糖。
实施例21.乳-N-岩藻五糖III的生产以与实施例19-1)同样的方式，IgG Sepharose连接的α1，3-岩藻糖基转移酶的制备来源于用质粒pAMoA-FT6转化的namalwa细胞系KJM-1(生物化学杂志.，269，14730(1994))并被用作α1，3-岩藻糖基转移酶的酶源，其中该质粒含有编码蛋白质A IgG结合区与α1，3-岩藻糖基转移酶的融合蛋白的基因。
在由0.25mM乳-N-四糖(Oxford Glycosystems)，1.0U IgGSepharose连接的α1，3-岩藻糖基转移酶，6μl含实施例16的GDP-Fuc(0.25mM)的反应液，100mM Tris-HCl(pH 7.9)，10mM MnCl2组成的50μl反应液于37℃放置24小时。
反应结束后，以Dionex产的糖分析仪(DX-50)对反应液中所积累的产物量进行测定。通过将产物的洗脱时间与乳-N-岩藻五糖III(OxfordGlycosystems)的洗脱时间进行比较而对产物进行鉴定。
实施例22.α1，4-半乳糖基转移酶(lgtC)表达质粒的构建以与实施例1相同的方法制备淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)的染色体DNA。
合成了序列号24的有义链DNA引物，序列号25的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒回收1.0kb的片段。将实施例1-1)中得到的pPA31 DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收4.2kb的DNA片段。
将该1.0kb和4.2kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。
根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达lgtC的质粒pGT3。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图15)。
实施例23.球状三糖的生产用与实施例2同样的方法将在实施例4中得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32株，和在实施例22得到的大肠埃希氏菌NM522/pGT3进行培养，将得到的各培养物离心分离得到湿菌体。另外，用与实施例2同样的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，将得到的培养物离心分离，得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32株湿菌体50g/l，大肠埃希氏菌NM522/pGT3湿菌体150g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株湿菌体150g/l，果糖100g/l，半乳糖100g/l，乳糖100g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(钾盐)10g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应26小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入半乳糖，乳糖，果糖和KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了188g/l的球状三糖。
将该反应液离心去除菌体，得到10ml上清，将上清用活性炭方法进行纯化，得到1.5g球状三糖的白色粉末。
实施例24.Galα1-4Galβ1-4GlcNAc的生产用与实施例2同样的方法将在实施例4中得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32株，和在实施例22得到的大肠埃希氏菌NM522/pGT3进行培养，将得到的各培养物离心分离得到湿菌体。另外，用与实施例2同样的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，将得到的培养物离心分离，得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pNT25/pNT32株湿菌体50g/l，大肠埃希氏菌NM522/pGT3湿菌体50g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株湿菌体150g/l，果糖50g/l，半乳糖50g/l，N-乙酰乳糖胺96g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，乳清酸(钾盐)10g/l，NymeenS-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应23小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入半乳糖，果糖和KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了10g/l Galα1-4Galβ1-4GlcNAc。
将该反应液离心去除菌体，得到30ml上清，将上清用活性炭方法进行纯化，得到0.2g Galα1-4Galβ1-4GlcNAc的白色粉末。
实施例25.β1，4-半乳糖基转移酶(lgt B)表达质粒的构建合成了序列号26的有义链DNA引物，序列号27的反义链DNA引物；以该合成的DNA作为引物，淋病奈瑟氏球菌(ATCC 33084)的染色体DNA作为模板，用上述的相同条件进行PCR。
PCR结束后，用乙醇沉淀法获得DNA沉淀。该DNA沉淀用20μl TE溶解。将该溶解液5μl用DNA限制性酶HindIII和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用Gene Clean II试剂盒回收0.8kb的片段。将pBluescriptII SK+DNA 0.2μg用限制性酶HindIII和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收3.0kb的DNA片段。
将该0.8kb和3.0kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达lgtB的质粒pNT60P。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图16)。
pNT60P DNA 0.5μg用限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，分离得到0.8kb的片段。将实施例1-1)中得到的pPA31 DNA 0.2μg用限制性酶ClaI和BamHI切断后，上琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收5.5kb的DNA片段。
将该0.8kb和5.5kb DNA片段用连接反应试剂盒，于16℃进行16小时的连接反应。根据上述已知的方法用该连接反应液转化大肠埃希氏菌NM522株，将该转化体涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，30℃培养过夜。
用上述已知的方法从生长的转化体菌落中回收质粒，得到表达lgtB的质粒pNT60。用限制性酶消化以确证该质粒的结构(图16)。
实施例26.N-乙酰乳糖胺的生产用与实施例2同样的方法将在实施例25中得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT60株，和在实施例3得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT25进行培养，将得到的各培养物离心分离得到湿菌体。另外，用与实施例2同样的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，将得到的培养物离心分离，得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pNT25株湿菌体50g/l，大肠埃希氏菌NM522/pNT60湿菌体50g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株湿菌体150g/l，乳清酸(钾盐)10g/l，果糖100g/l，N-乙酰葡糖胺100g/l，半乳糖100g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，Nymeen S-2154g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应34小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入半乳糖，果糖和KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了114g/l N-乙酰乳糖胺。
实施例27.乳糖的生产用与实施例2同样的方法将在实施例25中得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT60株，和在实施例3得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT25进行培养，将得到的各培养物离心分离得到湿菌体。另外，用与实施例2同样的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，将得到的培养物离心分离，得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pNT25株湿菌体50g/l，大肠埃希氏菌NM522/pNT60湿菌体50g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株湿菌体150g/l，乳清酸(钾盐)10g/l，葡萄糖115g/l，半乳糖115g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应15小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了49g/l乳糖。
实施例28.球状三糖的生产用与实施例2同样的方法将在实施例25中得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT60株，和在实施例3得到的大肠埃希氏菌NM522/pNT25和在实施例22得到的大肠埃希氏菌NM522/pGT3进行培养，将得到的各培养物离心分离得到湿菌体。另外，用与实施例2同样的方法培养产氨棒杆菌ATCC21170株，将得到的培养物离心分离，得到湿菌体。必要时可将该湿菌体保存在-20℃，在使用前解冻。
将由大肠埃希氏菌NM522/pNT25株湿菌体50g/l，大肠埃希氏菌NM522/pNT60湿菌体50g/l，大肠埃希氏菌NM522/pGT3 50g/l，产氨棒杆菌ATCC21170株湿菌体150g/l，乳清酸(钾盐)10g/l，葡萄糖115g/l，半乳糖115g/l，KH2PO415g/l，MgSO4.7H2O 5g/l，植酸5g/l，Nymeen S-215 4g/l，二甲苯10ml/l组成的反应液30ml接种到200ml的烧杯中，在磁性搅拌子的搅拌下(900rpm)搅拌下，于32℃反应13小时。
在反应中用4N NaOH使pH维持在7.2，必要时加入KH2PO4。
通过该反应，在反应液中生成了5g/l球状三糖。
在工业上应用的可能性通过本发明，可以大规模的高效地以核苷酸的前体物质和糖为原料制备糖核苷酸，以及以糖核苷酸和复合糖类前体物质制备复合糖类。
序列表序列号1序列长度31序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列GGAGAAAGCT TATGGCTGCC ATTAATACGA A 31序列号2序列长度30序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列AACACGGATC CGGATGTTAC TTCTTAATGC30序列号3序列长度28序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列ATGGAGGATC CTGCTCTGTA TACCGTCT 28序列号4序列长度20序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列TGCTGGTCGA CCTGCGCTTG 20
序列号5序列长度31序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列AAGGAAAGCT TATGACGCAA TTTAATCCCG T 31序列号6序列长度20序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列GCAAAGTTAA CAGTCGGTAC20序列号7序列长度31序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列TCAGGAAGCT TATGTTGAAT AATGCTATGA G 31序列号8序列长度27序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列TCTCCGGATC CCATGTGACC GGGTTAG27
序列号9序列长度28序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列TCTAAATCGA TGCAGACAAA GGACAAAG28序列号10序列长度27序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列TTGCAGGATC CTCGTAGGCC TGATAAG 27序列号11序列长度20序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列TGATATCCGC TCCCTTTCCG 20序列号12序列长度26序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列ACAGCGGATC CGATGTGTTC GCTGAG 26
序列号13序列长度29序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列ACAGCAAGCT TTTGACTTTA GCGGAGCAG 29序列号14序列长度29序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列GAGTTGGATC CCGATATAAA AGGAAGGAT 29序列号15序列长度25序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列TTTTTAAGCT TCATTTATCA AGAGT 28序列号16序列长度31序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列TTTTTGATAT CCCCAATGCT GGGGGTTTTT G 31
序列号17序列长度31序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列CGTCAAAGCT TAAATGATAT TCGGGGATAA T31序列号18序列长度25序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列AGGGAGGATC CGACATTACG CGTTC 25序列号19序列长度33序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列CCGCAAGATC TCGTAAAAAG GGTATCGATA AGC 33序列号20序列长度27序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列TTGGGAAGCT TCCGGCAAAT GTGGTTT 27
序列号21序列长度25序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列ATAAACTCGA GAGAGACAAG CGGAG 25序列号22序列长度27序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列TATTATCGAT GAATTAATAA TTCATAG27序列号23序列长度25序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列CTCTGGATCC AGTTACGTAT AATAT 25序列号24序列长度30序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列CGGCAAGCTT ATTGTGCCTT TCCAATAAAA 30
序列号25序列长度28序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列ACTTGGATCC CCGTCAATAA ATCTTGCG 28序列号26序列长度30序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列GGTAAAGCTT ATGCAAAACC ACGTTATCAG 30序列号27序列长度29序列类型核酸拓扑学单链序列种类其它核酸，合成的DNA配列AAACGGATCC TTATTGGAAA GGCACAATA 29
权利要求
1.一种复合糖类的制备方法，其特征在于以a)能从核苷酸的前体物质产生核苷-5’-三磷酸(下文简称NTP)的微生物的培养液或该培养液的处理物，和b)能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物的培养液或该培养液的处理物，和c)能从糖核苷酸和复合糖类前体产生复合糖类的微生物，动物细胞或昆虫细胞的培养液或该培养液的处理物作为酶源；使这些酶源，核苷酸的前体物质以及糖和复合糖类的前体物质存在于水溶性介质中，在该水溶性介质中生成并积累复合糖类；以及从该水溶性介质中回收复合糖类。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于其中培养液的处理物是培养液的浓缩物，培养液的干燥物，培养物离心分离得到的培养上清，该培养上清的浓缩物，从培养上清得到的酶样品，从培养液离心分离得到的细胞，该细胞的干燥物，该细胞的冷冻干燥物，该细胞的表面活性剂处理物，该细胞的超声波处理物，该细胞的机械磨碎处理物，该细胞的溶剂处理物，该细胞的酶处理物，该细胞的蛋白质分级分离物，该细胞的固定化物或者从该细胞回收得到的酶样品等。
3.权利要求1所述的制备方法，其中核苷酸的前体物质为乳清酸，尿嘧啶，乳清苷，尿苷，胞嘧啶，胞苷，腺嘌呤，腺苷，鸟嘌呤，鸟苷，次黄嘌呤，肌苷，黄嘌呤，黄苷，肌苷-5’-一磷酸，黄苷-5’-一磷酸，鸟苷-5’-一磷酸，尿苷-5’-一磷酸，胞苷-5’-一磷酸等。
4.权利要求1所述的制备方法，其中糖核苷酸是尿苷二磷酸化合物，鸟苷二磷酸化合物或胞苷一磷酸化合物。
5.权利要求4的制备方法，其中尿苷二磷酸化合物，鸟苷二磷酸化合物或胞苷一磷酸化合物是选自如下的化合物及其衍生物的化合物尿苷二磷酸葡萄糖，尿苷二磷酸半乳糖，尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺，尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺，尿苷二磷酸葡糖醛酸，鸟苷二磷酸甘露糖，鸟苷二磷酸岩藻糖，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸。
6.权利要求1的制备方法，其中糖选自葡萄糖，果糖，半乳糖，葡糖胺，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，甘露糖，岩藻糖，N-乙酰甘露糖胺，N-乙酰神经氨酸及其衍生物。
7.权利要求1的制备方法，其中复合糖类为含有选自如下的1个或1个以上的糖的复合糖类或含有该复合糖类的复合糖类葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，葡糖醛酸，甘露糖，N-乙酰甘露糖胺，岩藻糖，唾液酸，乳糖，N-乙酰乳糖胺，乳-N-二糖，GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc，球状三糖(globotriose)，Galα1-4Galβ1-4GlcNAc，2’-岩藻糖基乳糖，3-岩藻糖基乳糖，3’-唾液酸基乳糖，6’-唾液酸基乳糖，3’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，6’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，唾液酸基-N-二糖，Lewis X，Lewis a，乳-N-四糖，乳-N-新四糖，乳二岩藻四糖，3’-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖，唾液酸基-Lewis X，唾液酸基-Lewis a，乳-N-岩藻五糖I，乳-N-岩藻五糖II，乳-N-岩藻五糖III，乳-N-岩藻五糖V，LS-四糖a，LS-四糖b，LS-四糖c，3’-唾液酸基乳-N-新四糖，乳-N-二岩藻己糖I，乳-N-二岩藻己糖II，乳-N-己糖，乳-N-新己糖，二唾液酸基乳-N-四糖及其衍生物。
8.权利要求1的制备方法，其中复合糖类是含选自如下的糖键的复合糖类或含该复合糖类的复合糖类Galβ 1-3 Glc、Galβ 1-4 Glc、Galβ1-3 Glc NAc、Galβ 1-4 Glc NAc、Galβ 1-3 Gal、Galβ1-4 Gal、Galβ 1-3 Gal NAc、Galβ 1-4 Gal NAc、Galα1-3 Glc、Galα 1-4 Glc、Galα 1-3 Glc NAc，Galα 1-4 Glc NAc、Galα 1-3 Gal、Galα 1-4 Gal、Galα 1-3 Gal NAc、Galα 1-4 Gal NAc、Glc NAcβ 1-3 Gal、Glc NAcβ1-4 Gal、Glc NAcβ 1-6 Gal、Glc NAcβ 1-3 Glc、Glc NAcβ 1-4 Glc、Glc NAcβ1-3 Glc NAc、Glc NAcβ1-4Glc NAc、Glc NAcβ 1-6 Gal NAc、Glc NAcβ 1-2 Man、Glc NAcβ 1-4 Man、Glc NAcβ 1-6 Man、Gal NAcβ 1-3 Gal、Gal NAcβ 1-4 Gal、Gal NAcβ 1-4 Glc NAc、Gal NAcα1-3 Gal NAc、Manβ 1-4 Glc NAc、Manα 1-6 Man.Manα1-3 Man，Manα 1-2 Man，Glc UAβ 1-4 Glc N、Glc UAβ 1-3 Gal、Glc UAβ 1-3 Glc NAc、Glc UAβ 1-3 Gal NAc、Neu Acα 2-3 Gal、Neu Acα 2-6 Gal、Neu Acα 2-3 Glc NAc、Neu Acα 2-6 Glc NAc、Neu Acα 2-3 Gal NAc、Neu Acα 2-6 Gal NAc、Neu Acα 2-8 Neu Ac、Fucα 1-3 Glc、Fucα 1-4 Glc、Fucα 1-3 Glc NAc、Fucα 1-4 Glc NAc、Fucα 1-2 Gal和Fucα 1-6 Gl-c NAc。
9.权利要求7或8的制备方法，其中复合糖类含10个以下的糖。
10.权利要求7或8的制备方法，其中复合糖类含6个以下的糖。
11.权利要求1的制备方法，其中复合糖类的前体物质为单糖，寡糖，蛋白质，肽，脂类，糖蛋白质，糖脂类，糖肽和甾类化合物。
12.权利要求11的制备方法，其中复合糖类前体物质为选自如下的复合糖类前体物质，或含该复合糖类前体物质的复合糖类前体物质葡萄糖，半乳糖，甘露糖，唾液酸，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺，乳糖，N-乙酰乳糖胺，乳-N-二糖，GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc，球状三糖(globotriose)，Galα1-4Galβ1-4GlcNAc，2’-岩藻糖基乳糖，3-岩藻糖基乳糖，3’-唾液酸基乳糖，6’-唾液酸基乳糖，3’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，6’-唾液酸基-N-乙酰基乳糖胺，唾液酸基-N-二糖，Lewis X，Lewis a，乳-N-四糖，乳-N-新四糖，乳二岩藻四糖，3’-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖，唾液酸基-Lewis X，唾液酸基-Lewis a，乳-N-岩藻五糖I，乳-N-岩藻五糖II，乳-N-岩藻五糖III，乳-N-岩藻五糖V，LS-四糖a，LS-四糖b，LS-四糖c，3’-唾液酸基乳-N-新四糖及其衍生物，丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺及含这些氨基酸的肽及其衍生物，以及神经酰胺及其衍生物。
13.权利要求1的制备方法，其特征在于能从核苷酸前体物质产生NTP的微生物是选自棒杆菌属的微生物。
14.权利要求13的制备方法，其特征在于棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌。
15.权利要求1的方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由一种以上的微生物实现的。
16.权利要求15的制备方法，其特征在于微生物是选自埃希氏菌属和棒杆菌属的至少一种微生物。
17.权利要求16的方法，其中埃希氏菌属的微生物是大肠埃希氏菌。
18.权利要求16的制备方法，其中棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌。
19.权利要求1的方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物是具有至少一种高活性的选自如下的酶的微生物葡糖激酶(下文简称glk)，磷酸葡糖变位酶(下文简称pgm)，葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(下文简称galU)和焦磷酸酶(下文简称ppa)。
20.权利要求19的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由至少一种含有重组DNA的微生物实现的，其中重组DNA包含一种载体和一种含有至少一种选自如下的基因的DNA片段编码glk的基因，编码pgm的基因，编码galU的基因和编码ppa的基因。
21.权利要求20的制备方法，其特征在于编码glk的基因，编码pgm的基因，编码galU的基因和编码ppa的基因是来源于大肠埃希氏菌的基因。
22.权利要求19的制备方法，其中糖核苷酸是尿苷二磷酸葡萄糖。
23.权利要求19的制备方法，其中微生物是尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶活性强的微生物，糖核苷酸是尿苷二磷酸葡萄糖。
24.权利要求1的制备方法，其中能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物是半乳糖激酶(下文简称galK)的微生物。
25.权利要求24的制备方法，其特征在于由权利要求24的galK活性强的微生物以N-乙酰葡糖胺为底物而提供N-乙酰葡糖胺-1-磷酸。
26.权利要求24的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由至少一种含有重组DNA的微生物实现的，其中重组DNA带有含编码galK基因的DNA片段和一种载体。
27.权利要求26的制备方法，其特征在于编码galK的基因来源于大肠埃希氏菌。
28.权利要求24的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物是半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(下文简称galT)活性强的微生物。
29.权利要求28的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由至少一种含有重组DNA的微生物实现的，其中该重组DNA带有含编码galT基因的DNA片段和一种载体。
30.权利要求29的制备方法，其特征在于编码galT的基因来源于大肠埃希氏菌。
31.权利要求28的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物是是具有至少一种高活性的选自如下的酶的微生物葡糖激酶(下文简称glk)，磷酸葡糖变位酶(下文简称pgm)，葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(下文简称galU)和焦磷酸酶(下文简称ppa)。
32.权利要求31的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由至少一种含有重组DNA的微生物实现的，其中重组DNA包含一种载体和一种含有至少一种选自如下的基因的DNA片段编码glk的基因，编码pgm的基因，编码galU的基因和编码ppa的基因。
33.权利要求32的制备方法，其特征在于编码glk的基因，编码pgm的基因，编码galU的基因和编码ppa的基因是来源于大肠埃希氏菌的基因。
34.权利要求28或31的制备方法，其中糖核苷酸是尿苷二磷酸半乳糖。
35.权利要求24的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物是N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶(下文简称glmU)活性强的微生物。
36.权利要求35的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由至少一种含有重组DNA的微生物实现的，其中该重组DNA带有含编码glmU基因的DNA片段和一种载体。
37.权利要求36的制备方法，其特征在于编码glmU的基因来源于大肠埃希氏菌。
38.权利要求1的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物是磷酸葡糖变位酶(下文简称pgm)和磷酸果糖激酶(下文简称pfkB)活性强的微生物。
39.权利要求38的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由至少一种含有重组DNA的微生物实现的，其中该重组DNA带有含选自编码pgm基因和pfkB基因的至少一种的DNA片段和一种载体。
40.权利要求38的制备方法，其特征在于编码pgm的基因，编码pfkB的基因来源于大肠埃希氏菌。
41.权利要求38的制备方法，其特征在于葡萄糖-1，6-二磷酸是由权利要求38的pgm和pfkB活性强的微生物葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸为底物而提供的。
42.权利要求41的制备方法，其特征在于磷酸葡糖胺变位酶或磷酸甘露糖变位酶的活性被权利要求41提供的葡萄糖-1，6-二磷酸所增强。
43.权利要求38的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物是具有至少一种高活性的选自如下的酶的微生物葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶，N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶(下文简称glmU)，和焦磷酸酶(下文简称ppa)，磷酸葡糖胺变位酶(下文简称glM)和葡糖激酶(下文简称glk)。
44.权利要求43的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由至少一种含有重组DNA的微生物实现的，其中该微生物带有含选自编码glmU的基因，编码ppa的基因，编码glmM的基因和编码glk的基因中至少一种的DNA片段和一种载体。
45.权利要求44的制备方法，其特征在于编码glmU的基因，编码ppa的基因，编码glmM的基因和编码glk的基因来源于大肠埃希氏菌。
46.权利要求24，35，38或43的制备方法，其中糖核苷酸是尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。
47.权利要求24，35，38或43的制备方法，其中微生物是UDP-GlcNAc4-差向异构酶活性强的微生物，糖核苷酸是尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。
48.权利要求38的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生核苷酸的微生物是其中选自如下的至少一种酶的活性强的微生物磷酸甘露糖变位酶(下文简称manB)，甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(下文简称manC)，葡糖激酶(下文简称glk)。
49.权利要求48的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由至少一种含有重组DNA的微生物实现的，其中该重组DNA带有含选自编码manB的基因，编码manC的基因和编码glk的基因的至少一种的DNA片段和一种载体。
50.权利要求49的制备方法，其特征在于编码manB的基因，编码manC的基因和编码glk的基因是来源于大肠埃希氏菌的基因。
51.权利要求38或48的制备方法，其中糖核苷酸是鸟苷二磷酸甘露糖。
52.权利要求38的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生核苷酸的微生物是其中选自如下的至少一种酶的活性强的微生物磷酸甘露糖变位酶(下文简称manB)，甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(下文简称manC)，葡糖激酶(下文简称glk)，GDP-4，6-甘露糖脱水酶(下文简称gmd)，GDP-4-酮基-6-脱氧甘露糖差向异构酶/还原酶(下文简称wcaG)。
53.权利要求52的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由至少一种含有重组DNA的微生物实现的，其中该重组DNA带有含选自编码manB的基因，编码manC的基因，编码glk的基因，编码gmd的基因和编码wcaG的基因中的至少一种的DNA片段和一种载体。
54.权利要求53的制备方法，其特征在于编码manB的基因，编码manC的基因，编码glk的基因，编码gmd的基因和编码wcaG的基因是来源于大肠埃希氏菌的基因。
55.权利要求38或52的制备方法，其中糖核苷酸是鸟苷二磷酸岩藻糖。
56.权利要求1的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物是其中选自如下的至少一种酶的活性强的微生物GlcNAc2-差向异构酶，CMP-NeuAc合成酶(下文简称neuA)，NeuAc醛缩酶(下文简称nanA)，NeuAc合成酶(下文简称neuB)，CTP合成酶(下文简称pyrG)。
57.权利要求56的制备方法，其特征在于能从糖和NTP产生糖核苷酸的能力是由至少一种含有重组DNA的微生物实现的，其中该重组DNA带有含选自编码GlcNAc2-差向异构酶的基因，编码neuA的基因，编码nanA的基因，编码neuB的基因，编码pyrG的基因的基因中的至少一种的DNA片段和一种载体。
58.权利要求57的制备方法，其特征在于编码neuA的基因，编码nanA的基因，编码neuB的基因，编码pyrG的基因是来源于大肠埃希氏菌的基因。
59.权利要求56的制备方法，其中糖核苷酸是胞苷一磷酸-N-乙酰基神经氨酸。
60.权利要求1的制备方法，其特征在于能从糖核苷酸和复合糖类前体物质产生复合糖类的微生物是大肠埃希氏菌，啤酒糖酵母或产氨棒杆菌。
61.权利要求60的制备方法，其特征在于微生物是含有重组DNA的至少一种微生物，其中该重组DNA带有含选自编码葡糖基转移酶，半乳糖基转移酶，N-乙酰葡糖胺基转移酶，N-乙酰半乳糖胺基转移酶，葡糖醛酸基转移酶，甘露糖基转移酶，唾液酸基转移酶和岩藻糖基转移酶基因的转移酶基因中的至少一种的DNA片段和一种载体。
62.权利要求61的制备方法，其特征在于编码选自如下的酶的基因是来源于微生物的基因编码葡糖基转移酶，半乳糖基转移酶，N-乙酰葡糖胺基转移酶，N-乙酰半乳糖胺基转移酶，葡糖醛酸基转移酶，甘露糖基转移酶，唾液酸基转移酶和岩藻糖基转移酶基因。
63.权利要求1的制备方法，其中动物细胞是COS-7细胞或namalwa KJM-1细胞；昆虫细胞是sf9细胞。
64.权利要求1的制备方法，其特征在于动物细胞或昆虫细胞是含有重组DNA的动物细胞或昆虫细胞，其中含有选自编码葡糖基转移酶，半乳糖基转移酶，N-乙酰葡糖胺基转移酶，N-乙酰半乳糖胺基转移酶，葡糖醛酸基转移酶，甘露糖基转移酶，唾液酸基转移酶和岩藻糖基转移酶基因的转移酶基因中的至少一种的DNA片段和一种载体。
65.权利要求64的制备方法，其特征在于编码选自如下的转移酶的基因是来源于动物细胞的基因编码葡糖基转移酶，半乳糖基转移酶，N-乙酰葡糖胺基转移酶，N-乙酰半乳糖胺基转移酶，葡糖醛酸基转移酶，甘露糖基转移酶，唾液酸基转移酶和岩藻糖基转移酶基因。
66.一种N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的制备方法，其特征在于以权利要求24的galK活性强的微生物的培养液或该培养液的处理物作为酶源，使该酶源和N-乙酰葡糖胺存在于水溶性介质中，使在水溶性介质中生成并积累N-乙酰葡糖胺-1-磷酸，并从该水溶性介质中回收N-乙酰葡糖胺-1-磷酸。
67.权利要求66的制备方法，其中该微生物是带有含编码galK的基因DNA片段的重组DNA的微生物。
68.权利要求67的制备方法，其中编码galK的基因是来源于大肠埃希氏菌的编码半乳糖激酶的基因。
69.权利要求66的制备方法，其特征在于培养液的处理物是培养液的浓缩物，培养液的干燥物，培养物离心分离得到的培养上清，该培养上清的浓缩物，从培养上清得到的酶制品，从培养液离心分离得到的细胞，该细胞的干燥物，该细胞的冷冻干燥物，该细胞的表面活性剂处理物，该细胞的超声波处理物，该细胞的机械磨碎处理物，该细胞的溶剂处理物，该细胞的酶处理物，该细胞的蛋白质分级分离物，该细胞的固定化物或者从该细胞抽提得到的酶样品等。
全文摘要
一种利用下述酶源制备糖核苷酸类的方法a)一种任选地处理过的能从核苷酸前体产生NTP的微生物的培养物，和b)一种任选地处理过的能从糖和NTP产生糖核苷酸的微生物的培养物；一种利用下述酶源产生复合糖类的方法上述的培养物a)和b)，和c)一种任选地处理过的能从糖核苷酸和复合糖前体产生复合糖的微生物，动物细胞或昆虫细胞的培养物；一种利用下述酶源产生复合糖类的方法一种任选地处理过的能从糖核苷酸和复合糖前体产生复合糖的微生物，动物细胞或昆虫细胞的培养物；一种利用下述酶源产生N－乙酰基葡糖胺－1－磷酸的方法一种任选地处理过的能从具有潜在的半乳糖激酶活性的微生物的培养物。
文档编号C12P19/30GK1550554SQ02141259
公开日2004年12月1日 申请日期1997年9月12日 优先权日1996年9月17日
发明者小泉聪司, 佐佐木克敏, 远藤彻夫, 田畑和彦, 克敏, 夫, 彦 申请人:协和发酵工业株式会社