Trpc3抗原多肽和抗trpc3的单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种TRPC3抗原多肽和抗TRPC3的单克 隆抗体。
【背景技术】
[0002] 脉粥样硬化（atherosclorosis, AS)是动脉硬化血管病中最常见一种，其特点是受 累动脉病变从内膜开始。AS的一般形成过程是先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成， 纤维组织增生及钙质沉着，接着是动脉中层的逐渐蜕变和钙化，病变常累及弹性及大中等 肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。动脉 粥样硬化的症状主要决定于血管病变及受累器官的缺血程度，冠状动脉粥样硬化者，若管 径狭窄达75%以上，则可发生心绞痛、心肌梗塞、心律失常，甚至猝死。脑动脉硬化可引起 脑缺血、脑萎缩，或造成脑血管破裂出血。肾动脉粥样硬化常引起夜尿、顽固性高血压、严重 者可有肾功能不全。肠系膜动脉粥样硬化可表现为饱餐后腹痛便血等症状，对人类健康存 在较大的威胁。
[0003] 目前，对于心血管疾病最直接和最准确的方法是侵入性的血管介入诊断技术，但 是该诊断技术存在有创伤性、滞后性、费用昂贵，不方便连续观察及随访的缺点，大大的限 制了其在临床上的应用。因此，研究出无创性、使用简便、方法标准化、重复性好的冠状动脉 粥样硬化检测技术仍然是当前医学研究的重点。
[0004] TRPC3 (瞬时受体电位阳离子通道3)蛋白作为一种非选择性阳离子通道，可调控 钙离子的通透性，而钙离子在循环系统疾病的产生机制中扮演着重要的角色，其表达异常 易导致动脉粥样硬化（atherosclorosis, AS)。AS是引发心血管疾病的常见原因，而内皮细 胞损伤是动脉粥样硬化形成的始动环节，其活性调节受胞内Ca2+浓度与膜电位的影响，在 此过程中TRPC3分子的表达异常参与了 AS的病理过程。利用TRPC3单克隆抗体构建体外 免疫学技术方法，测定蛋白水平的表达，更有利于疾病的分析与病情愈后监测。
[0005] 抗人TRPC3多肽单克隆抗体的制备是采用淋巴细胞杂交瘤技术，该技术的基础是 细胞融合。骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合后，可形成能分泌针对单一抗原表位的均 质的高特异性的抗体，即单克隆抗体。由于骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终 末细胞不能在体外增殖，因此将两种细胞融合后既具有肿瘤细胞无限增殖特性，又具有淋 巴细胞能分泌特异性抗体的能力，同时克服了免疫淋巴细胞不能在体外增殖的缺点，融合 的细胞被称为淋巴细胞杂交瘤。
[0006] 然而，制备能特异性的结合TRPC3蛋白的抗体，首先需要筛选合适的TRPC3多肽序 列，获得良好的免疫原，但目前并没有免疫原性好且特异性高的抗原多肽。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种TRPC3抗原多肽。
[0008] 本发明的另一目的是提供一株能分泌抗上述TRPC3抗原多肽的单克隆抗体的杂 交瘤细胞株。
[0009] 本发明的又一目的是提供上述TRPC3抗原多肽的单克隆抗体。
[0010] 本发明通过以下技术方案实现上述目的： 本发明提供了一种TRPC3抗原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。TRPC3蛋白共 有836个氨基酸，经过对其进行跨膜区域、膜内外区域和保守区域等多方面的研究，最终筛 选确定15个氨基酸序列即YFTYARDKWLPSDPQ，作为抗原多肽，既避开了跨膜结构，又具有高 度的保守性(在人、大鼠和小鼠中均有)。
[0011] 本发明提供了一株杂交瘤细胞株T- II，该杂交瘤细胞株是由所述的TRPC3多肽与 马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH (keyhole limpet hemocyanin，血蓝蛋白）偶联，经 脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，培养， 经ELISA检测筛选，得杂交瘤细胞株T- II，于2015年8月24日保藏于中国典型培养物保 藏中心，保藏编号为C2015140。
[0012] 另外，本发明还提供了一种抗TRPC3的单克隆抗体，该抗TRPC3的杂交瘤细胞株是 由上述杂交瘤细胞株T- II分泌得到的，所述抗TRPC3的单克隆抗体的制备方法包括以下步 骤： Sl将合成后的TRPC3抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐 纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫小鼠； S2取步骤Sl得到的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，培养，经ELISA检测技术筛 选，建立杂交瘤细胞株，得杂交瘤细胞株T- II ; S3将步骤S2得到的杂交瘤细胞株T- II分泌的单抗采用超滤离心管（15ml，50KD)浓缩 后再进行辛酸-硫酸铵沉淀法纯化，即得。
[0013] 本发明提供的抗TRPC3的单克隆抗体可特异性识别各种组织细胞表达的TRPC3蛋 白，该单克隆抗体可用于TRPC3表达研究，借以监测与TRPC3分子表达相关的组织和疾病， 如动脉粥样硬化等。同时也可以用于TRPC3蛋白过表达的组织及疾病监测，亦或经过人源 化改造后与药物偶联进行免疫靶向治疗。
[0014] 与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优势： 1.分析特性表明，本发明提供的TRPC3抗原多肽的抗原指数预测0. 995,表露性预测 值1. 000,柔韧性预测值1. 003, β -转角预测值1. 080,B细胞表位预测较佳，通过免疫小鼠， 检测小鼠血清抗体效价1:12800,达到制备单克隆抗体的要求。
[0015] 2.本发明的杂交瘤细胞株可以在体外"永久"地存活并传代，适合持续性研究以 及进一步的扩大化制备。
[0016] 3.本发明的抗TRPC3的单克隆抗体，同已有的多克隆抗体相比，具有以下优点： ①可获得大量高度特异的、均一的抗体，理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的 特异性强、便于人为处理和质量控制。②能得到"无限量"的均一性抗体，适用于以标记抗 体为特点的免疫学分析方法，如ELISA技