一种融合蛋白及其在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种融合蛋白及其在制备sars-cov-2疫苗中的应用。

背景技术：

1、

2、截止2021年4月，全球已经研发并上市了多个sars-cov-2疫苗，包括灭活疫苗、mrna疫苗、重组腺病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗。其中mrna疫苗、重组腺病毒载体疫苗和重组蛋白疫苗均以sars-cov-2的结构蛋白包括s蛋白(刺突蛋白)为免疫原。综合分析全球的sars-cov-2疫苗与基础研究，基本可以确定sars-cov-2s蛋白是最有潜力的疫苗靶点。sars-cov-2s蛋白位于sars-cov-2外膜上，是病毒识别宿主细胞上的ace2受体并侵入细胞的关键分子。完整的s蛋白由1273个氨基酸构成，结合宿主细胞ace2受体后被酶切为s1和s2两个亚基，s1亚基由ntd和ctd两个部分组成，其中ctd包含受体结合结构域(receptorbinding domain，rbd)，负责与ace2受体分子结合；s2亚基负责介导病毒与宿主细胞的膜融合，引导病毒颗粒进入细胞。

3、目前已上市的sars-cov-2疫苗在控制sars-cov-2方面大多数并不理想。现有疫苗不理想的主要原因在于它们诱导人体产生的平均中和抗体滴度仅为100左右，仅勉强达到恢复期病人血清的抗体平均水平，如此低的抗体滴度不足以完全防止sars-cov-2感染。只要sars-cov-2的刺突蛋白突变几个氨基酸，或者因个体差异抗体效价稍微降低几倍，就可能导致sars-cov-2逃逸免疫系统的攻击。因此，需要继续研发更高效安全的疫苗。

4、重组蛋白疫苗是目前疫苗开发最成熟、最先进、使用最安全的疫苗。利用该技术研发上市的疫苗有重组乙肝疫苗、带状疱疹病毒疫苗及hpv宫颈癌疫苗等。该类疫苗有如下突出优势：(1)使用安全性好；因为注射入人体的是纯的蛋白质，辅助免疫的是同样安全的传统佐剂，因此非常安全。从某种意义来说，mrna疫苗和重组腺病毒疫苗也是亚单位疫苗，区别在于它们二者是将编码疫苗蛋白的基因注射至人体中，让人体细胞生产疫苗蛋白。由于编码疫苗蛋白的核酸载体是否全部进入预期的生产细胞？疫苗蛋白的合成量是多还是少？免疫完成后如何停止合成？这些问题都没有答案，所以该疫苗风险重重。(2)生产安全、便于大规模生产，质量可控。重组蛋白疫苗具有工业化生产潜力。利用现代生物制药的大规模细胞培养技术，可以实现疫苗的工业规模生产，一台细胞生物反应器的培养规模就能够达到10000l以上，每个批次可以稳定地获得公斤级甚至吨级规模的疫苗蛋白，按照疫苗剂量一般在25μg/人/次计算，25kg重组蛋白疫苗就可以分装成10亿支，可以非常轻松地满足市场的巨大需求。生产工艺相近的吨级规模的抗体药物生产已是非常常规的大分子生物药生产规模，重组蛋白疫苗不涉及活病毒的扩增，非常易于规模化生产。(3)重组蛋白疫苗产品无毒无害，生产环境友好。(4)重组蛋白疫苗运输储存条件方便，仅需要2-8℃，常规的冷链运输和4℃冰箱就可以达到要求。

5、在sars-cov-2重组蛋白疫苗的研发中，s蛋白是公认最有潜力的疫苗靶点，但是具体哪种形式的s蛋白免疫效果最好，却未有定论，莫衷一是。现有研究成果中，充满了相互矛盾的结论，比如，有的研究表明s1免疫产生的中和抗体水平远高于rbd；而有的研究却说rbd才是产生中和抗体的主要免疫原，s1里的ntd对中和抗体几乎没有贡献。

技术实现思路

1、本发明的目的是制备sars-cov-2疫苗。

2、本发明首先保护一种融合蛋白，其自n端至c端依次可包括sars-cov-2s蛋白的ctd结构域和免疫球蛋白fc区；

3、所述免疫球蛋白fc区为人或动物的免疫球蛋白或者它们的亚型重链恒定区的羧基端或其中的一部分。

4、上述融合蛋白中，所述免疫球蛋白可为人免疫球蛋白igg。所述人免疫球蛋白igg可优选为人免疫球蛋白igg2。

5、上述融合蛋白中，所述sars-cov-2s蛋白的ctd结构域的氨基酸序列可如seqidno:2自n末端起第18-388位所示。

6、上述融合蛋白中，所述人免疫球蛋白igg2 fc片段的氨基酸序列可如seq id no:2自n末端起第396-621位所示。

7、上述任一所述融合蛋白还可包括5-30个(如5-7个、7-15个、15-30个、5个、7个或30个)氨基酸残基组成的连接肽；连接肽位于sars-cov-2s蛋白的ctd结构域的下游、免疫球蛋白fc区的上游。

8、所述连接肽的氨基酸序列可如seq id no:2自n末端起389-395位所示。

9、所述sars-cov-2s蛋白的ctd结构域与人免疫球蛋白igg2 fc片段融合，可选择多种连接序列。例如可以选择长度约为20个氨基酸残基，也可选择sars-cov-2s蛋白的ctd结构域与人免疫球蛋白igg2 fc片段的铰链区直接融合，制备的融合蛋白fc序列位于sars-cov-2s蛋白的ctd结构域的氨基端。

10、上述任一所述融合蛋白的氨基酸序列可如seq id no:2所示。

11、本技术中将sars-cov-2s蛋白的ctd结构域与人免疫球蛋白igg2 fc片段进行融合，主要考虑到以下几点：首先，fc片段能够特异性结合到protein a亲和柱，可直接纯化得到较高纯度的目的蛋白，简化融合蛋白的纯化步骤；其次，融合fc片段可以增大蛋白分子量，从而降低肾清除率，并且在fcrn的保护下，融合蛋白可以延长其血浆半衰期；再次，融合蛋白可以通过二硫键形成稳定的二聚体，能够提高蛋白分子的稳定性；最后，融合fc片段能够提高其在哺乳动物细胞内的表达。

12、本发明还保护一种dna分子，其编码上述任一所述的融合蛋白。

13、所述dna分子的核苷酸序列如seq id no:1所示。

14、本发明还保护上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述dna分子的应用，可为a1)或a2)或a3)：

15、a1)中和sars-cov-2；

16、a2)预防sars-cov-2感染；

17、a3)治疗sars-cov-2感染导致的疾病；

18、所述应用用于非疾病的诊断与治疗。

19、本发明还保护上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述dna分子在制备用于中和sars-cov-2的产品中的应用。

20、本发明还保护上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述dna分子在制备用于预防sars-cov-2感染的产品中的应用。

21、本发明还保护上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述dna分子在制备用于治疗sars-cov-2感染导致的疾病的产品中的应用。

22、本发明还保护一种sars-cov-2疫苗，其包括上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述dna分子；

23、所述疫苗可为重组蛋白疫苗、mrna疫苗或腺病毒载体疫苗。

24、所述sars-cov-2疫苗具体可由上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述dna分子组成。

25、所述sars-cov-2疫苗还可包括佐剂。

26、所述sars-cov-2疫苗具体可由上述任一所述的融合蛋白和佐剂组成。

27、所述sars-cov-2疫苗具体可由上述任一所述dna分子和佐剂组成。

28、上述任一所述佐剂具体可为铝佐剂。

29、本发明还保护上述任一所述的融合蛋白或上述任一所述dna分子在制备sars-cov-2疫苗中的应用；

30、所述疫苗可为重组蛋白疫苗、mrna疫苗或腺病毒载体疫苗。

31、本技术的发明人根据sars-cov-2s蛋白的结构与功能特性，将其拆分为ntd、ctd结构域和s2亚基，用cho细胞表达并制备得到sars-cov-2-ntd-fc融合蛋白、sars-cov-2-ctd-fc融合蛋白和sars-cov-2-s2-fc融合蛋白，进而制备二聚体蛋白疫苗，单独或者各种组合使用，免疫动物，测定中和抗体滴度。研究表明，s2亚基免疫产生的抗体完全没有中和病毒的能力，ntd免疫产生的抗体有一定的中和能力，包含完整rbd序列且空间结构良好的ctd产生的中和抗体滴度最高。与ntd和s2组合免疫，不仅没有提高ctd的免疫原性，反而降低了中和抗体滴度；这很可能是因为无效免疫原，占用了免疫系统的潜能。将本发明制备的疫苗免疫小鼠，取小鼠血清，用假病毒细胞中和实验测定的抗体滴度平均值超过5万，比现有疫苗的中和抗体滴度高几十至几百倍。本发明制备疫苗之所以免疫效果这么高，是因为考虑到如下几点，从而保证疫苗有完整而且良好的空间构象：(1)序列设计上，包含完整的rbd结构域，而且含偶数个半胱氨酸，保证其能形成正确的二硫键配对；(2)疫苗属于fc融合蛋白，是一种成熟使用的长效生物药技术，能延长疫苗在人体内的半衰期，对免疫系统造成更持久的激活；(3)使用的cho表达系统属于哺乳动物细胞，能够对疫苗蛋白进行正确的糖基化等修饰。

32、本技术研究表明，s2亚基免疫产生的抗体，跟对照组铝佐剂一样，完全没有病毒中和能力；s1亚基的ntd和ntd结构域都能刺激产生具备病毒中和能力的抗体，但是效价差异非常大。ntd免疫产生抗体的中和滴度平均值为663，ctd免疫产生抗体的中和滴度平均值为75924，是ntd的114倍；ctd与ntd联合免疫产生抗体的中和滴度平均值为18130，约为单独ctd的1/4；ctd与ntd+s2联合免疫产生抗体的中和滴度平均值为13905，约为单独ctd的1/6。

33、ctd是刺激产生有效中和抗体的主要成分；联合免疫ntd和s2不仅没有增强、反而降低了免疫血清的病毒中和抗体效价。

34、本发明制备的疫苗可以诱导身体激发针对sars-cov-2病毒的中和抗体，抑制病毒感染与扩散。此外，本发明提供的用于制备疫苗的sars-cov-2-ctd-fc融合蛋白具有以下有益效果：(1)构建sars-cov-2s蛋白的ctd结构域与人免疫球蛋白igg2 fc片段融合的真核表达载体，表达的sars-cov-2-ctd-fc融合蛋白具备天然的空间结构，免疫产生的抗体能特异性识别sars-cov-2病毒，并激活免疫系统清除病毒；(2)人免疫球蛋白igg2 fc片段增大了目的蛋白分子量，从而降低肾清除率，并且在新生免疫球蛋白fc受体(fcrn)的保护下，延长了sars-cov-2-ctd-fc融合蛋白的血浆半衰期，更持久地刺激免疫系统，提高血清中和抗体水平；(3)sars-cov-2-ctd-fc融合蛋白可以通过fc的链间二硫键形成稳定的二聚体，提高蛋白分子的稳定性；(4)sars-cov-2-ctd-fc融合蛋白疫苗免疫原性高。sars-cov-2-ctd-fc融合蛋白可用于制备sars-cov-2疫苗，为sars-cov-2引起的新型冠状病毒的预防和/或治疗提供了可能性。本发明具有重要的应用价值。