AaPDR3基因启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及一种启动子及其应用，尤其涉及一种在植物非分 泌型腺毛中特异表达的转运蛋白基因启动子(pr 〇AaH)R3)及其在转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002] 青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性 香气，其植株中含有许多次级代谢产物:青蒿素、挥发油、α-蒎烯、樟脑、青蒿酮等，此外还含 有黄酮类化合物。目前，青蒿素联合疗法(Artemisinin-based combination therapies， ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量 低，尚无法完全满足全球的市场需求。
[0003] 青蒿具有分泌型腺毛（glandular trichomes)和非分泌型腺毛(nonglandular trichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、茎杆、花上都大量存在腺毛，这里是大量次生代谢 物的累积场所，青蒿素被认为储存于分泌型腺毛。两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花 粉传播等都起到至关重要的作用。
[0004] 启动子是位于结构基因 5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启 动子就像一个"开关"，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功 能。启动子一共分三种:组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在青蒿基因工程研究 中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子。这类启动子能够驱动基因在植物所有 的组织和器官中表达，会导致植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的 负担和危害。而非分泌型腺毛特异表达的启动子只对植物的非分泌型腺毛系统进行遗传操 作，不会对植物造成代谢的浪费和生长发育造成危害。
[0005] ABC(ATP binding cassette)转运蛋白是一大类非常多样化非常特殊的超级家 族。大部分ABC转运蛋白直接参与到各种分子的跨膜运输。AaH)R3是从青蒿中克隆得到的一 个ABC转运蛋白中]^I^Pleiotropic drug resistance)亚家族的转运蛋白。
[0006] 因此，本领域技术人员致力于开发一种腺毛特异表达的AaH)R3基因的启动子。
【发明内容】
[0007] 有鉴于现有技术中的启动子会驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致 植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害的这些缺陷，本发 明所要解决的技术问题是提供一种在植物非分泌型腺毛中特异表达的启动子，能引导基因 在转基因植物非分泌型腺毛中特异表达。
[0008] 为实现上述目的，本发明的一方面提供了一种启动子，该启动子是能调控基因在 非分泌型腺毛中特异表达，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。该启动子为转运蛋白基因启 动子，是诱导型启动子，也是特异型启动子。
[0009] 进一步地，该启动子是青蒿AaH)R3基因上游的启动子。
[00?0] 进一步地，该启动子上的顺式作用元件包括:TATA box、CAAT box、G-box、AE-box、 八1^、6八-1]1〇1:1;1^、6-13(?、]\033和？13〇叉〇
[0011] 本发明的另一方面提供上述启动子的应用，是在利用植物非分泌型腺毛组织表达 和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
[0012] 进一步地，其中代谢产物为青蒿素。
[0013] 本发明的又一方面提供一种载体，该载体连接有如上所述的启动子。该载体可以 是 pCAMBIA1391z 载体。
[0014] 本发明的再一方面，提供一种制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，包括以下步 骤：
[0015] 步骤一、根据青蒿基因组中AaPDR3基因启动子序列，利用巢式PCR克隆如权利要求 1中所述的启动子的序列；
[0016] 步骤二、将步骤一中获得的AaH)R3基因的所述启动子的序列连入PCAMBIA1391Z载 体，获得 ?041^141391211(^&?01?3载体；
[0017] 步骤三、将步骤二中获得的pCAMBIAl 391Z-proAaPDR3载体转化根癌农杆菌；
[0018] 步骤四、将步骤三中获得的带有pCAMBIA1391Z-proAaroR3载体的根癌农杆菌转化 青高，并进行检测；
[0019] 步骤五、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位。
[0020] 优选地，其中启动子与青蒿素合成途径中的关键酶基因融合，从而加强青蒿合成 途径，最终提高青蒿素的合成。该青蒿素合成途径中的关键酶基因可以是TOR3基因等。
[0021] 优选地，其中巢式PCR的引物序列为：
[0022] 第一轮PCR:PF1:5' -CTTTTCCAGCCAAATAAGTATGCCG-3' ；
[0023] PR1:5 '-TTCTTCCACTATTGCTCCCTAACCT-3 '；
[0024] 第二轮PCR: PF2:5，-TTTCTTTGGTGTTGTATCAATCTCTG-3，；
[0025] PR2:5 '-TTCTTCCACTATTGCTCCCTAACCT-3 '；
[0026] 优选地，为构建 pCAMBIA1391 z-proAaroR3 载体，proAaroR3 两端分别引入了EcoRI 的酶切位点和Ncol的酶切位点，使用的引物序列为：
[0027] EcoRI-Pro_PDR3-FP:5 '-CGGAATTCGAACTGTTGAATTAGTATTTAC-3 '；
[0028] Pr〇-PDR3-NcoI-RP:5 '-CATGCCATGGTTTTAATGCTCAAAAAGCCC-3 ' 〇
[0029] 本发明还提供了一种表达盒，该表达盒包括如前所述的启动子。优选地，该表达盒 为proAaPDR3-⑶S表达盒。进一步地，在该表达盒中，可以插入青蒿素合成途径中的关键酶 基因。
[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明利用有效的青蒿表皮腺毛组织特 异性启动子代替组成型启动子，可以通过分子生物学的方法构建在青蒿非分泌型腺毛特异 表达目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目 的基因的定向操作已获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于 利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。另外，本发明也为深入研究非 分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控，尤其是通过AaH)R3基因的 启动子pr 〇AaH)R3进行研究奠定了基础。
[0031] 以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0032]图1是本发明的一个较佳实施例的转基因青蒿植株的PCR检测结果图。其中，Μ:分 子量标记;泳道1:阴性对照；泳道2:阳性对照;泳道3-12:分别是10株转基因青蒿植株基因 组为模版，进行PCR得到的产物。
[0033]图2是本发明的一个较佳实施例利用AaH)R3基因启动子pr〇AaPDR3与GUS基因融合 的载体pCAMBIA1391z-pr〇AaroR3转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中的⑶S组织染色图。
【具体实施方式】
[0034]下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年 版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0035]本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄； 根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3): 38-43》文 献中公开。根癌农杆菌EHA105和质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可 以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambarl。
[0036] 实施例1 AaH)R3基因启动子proAaroR3的获得 [0037] 1、培养青蒿无菌苗
[0038] 青蒿种子用体积分数为75%的乙醇浸泡lmin，再用20%(w/v)的NaCIO浸泡20min 后，无菌水冲洗3次-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25 °C、16h/8h(日光/黑夜)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗。
[0039] 2、基因组DNA的提取
[0040]在1.5mL离心管中放一片青蒿叶片（1cm2左右大小，用冰盒盛取），加入2粒钢珠。加 入300yL TPS buf f er (通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇），55-60HZ，震荡90秒。再加入300 yL TPS buffer(通风橱）。65"€水浴lh(每隔20min摇一摇），可适当延长时间，最长1.5h。冷 却至室温，4 °C lOOOOrpm离心15min。取300yL-400yL上清液。加入300yL-400yL异丙醇（异丙 醇在-20°C预冷）。混合后在_20°C冰箱中放置10_15min(可延长至lh)。取出4°C离心 12000rpm，吸去上清，在通风橱中倒置10-15min。加入75%乙醇500-600yL，将沉淀吹打起或 用手指弹起，放在摇床上摇15_20min，重复一次。吸干液体，放在37 °C中烘干，直到沉淀变为 透明。加入50yL ddH20回溶，即获得基因组DNA，4 °C保存。
[0041 ] 3、PCR 扩增
[0042]以上述获得的基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子 pr〇AaPDR3序列。为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，根据基因组测序得到的 AaH)R3基因的启动子序列设计巢式PCR引物如表1所示，第一轮PCR反应体系如表2所示。PCR 条件为：94°C 预变性 1〇111丨11;941€4〇8,5〇1€4〇8,681€31^11，34个循环 ；68°(：延伸1〇1^11。在1% 的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。
[0043] 表1巢式PCR引物
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[0045] 表2第一轮PCR反应体系
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