]
[0047]
[0048]将第一轮PCR的产物稀释50倍用作为第二轮PCR的模版，第二轮PCR的引物是FP2和 RP2，反应体系如表3所示，PCR反应条件为：94°C预变性lOmin; 94°C40s，55°C40s，68°C2min， 34个循环；68 °C延伸lOmin WCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，回收特异条带，连接到 PJET1.2载体用于测序。将该片段的序列与AaH)R3基因的序列进行拼接，结果获得了 AaH)R3 基因上游约2kb的序列。获得的AaTOR3基因启动子proAaroR3的序列如SEQ ID No: 1所示。
[0049] 表3第二轮PCR反应体系
[0050]
[0051] 实施例2分析启动子proAaroRS的顺式作用元件，确定proAaroRS的类型 [0052] 实施例1中获得的启动子pr〇AaroR3序列长度为2059bp。为了寻找启动子上面的顺 式作用元件，用Plantcare( http: //bio informat ics · psb · ugent · be/webtools/plantcare/ html/)对启动子proAaPDR3进行分析。分析发现多克隆到的启动子上面具有除了TATA box 和CAAT box，还具有很多顺式作用元件，如:G-box、AE-box、ARE、GA-motif、G-box、MBS和W box等，具体如表4所示。其中，G-box在很多植物启动子中都有发现，它是很多应激响应启动 子行使功能所必须的元件，在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到很 重要的作用;此外，GA-motif受光调控，ABRE在植物中能够响应脱落酸;MBS是MYB转录因子 结合位点。以上结果分析表明，AaPDR3基因的启动子pr 〇AaPDR3是一个诱导型的启动子，能 受多种因素诱导。
[0053] 表4启动子proAaFOI^序列中调控元件分析
[0054]
[0055] 实施例3将AaH)R3基因启动子proAaPDR3连入pCAMBIA-1391z载体，融合GUS报告 基因
[0056]为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将AaPDR3基因的启动子 pr〇AaroR3连接pCAMBIA-1391z载体，从而融合⑶S报告基因。为了实现对表达载体的构建， 在对启动子proAaPDR3进行扩增时，通过正向引物引入EcoRI酶切位点，通过反向引物中引 入Nco頂每切位点，引物序列如表5所示：
[0057] 表5 pCAMBIA1391z-proAaPDR3载体构建使用的PCR引物
[0058]
[0059] 通过对扩增的proAaPDR3片段和pCAMBIA-1391z载体的双酶切以及连接，获得 pCAMBIAl 391 z-proAaPDR3 载体。
[0060] 实施例4将构建好的pCAMBIA1391z-proAaroR3载体转化根癌农杆菌并检测 [0061 ] 将含有构建完成的植物表达载体pCAMBIA1391z-proAaPDR3转入根癌农杆菌 (EHA105)，并进行PCR验证。结果表明：含有基因启动子片段的植物表达载体pCAMBIA1391z-pr 〇AaPDR3成功的构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含基因启动子和GUS基因融合的植物 表达载体pCAMBIAl 391 z-proAaFORS的根癌农杆菌菌株。
[0062] 实施例5将带有pCAMBIA1391z-proAaPDR3载体的根癌农杆菌转化青蒿并进行检 测
[0063] 1)外植体的预培养
[0064] 青蒿种子用体积分数为75 %的乙醇浸泡lmin;再用20 % (w/v)的NaCIO浸泡20min; 无菌水冲洗3-4次；用无菌吸水纸吸干表面水分;接种于无激素的MS培养基中，25 °C、16小时 的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外 植体用于转化。
[0065] 其中，MS培养基为Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基 可以通过商业渠道获得。
[0066] 2)农杆菌与外植体的共培养
[0067]将所述的叶片外植体，转到1 /2MS和100μπιο 1/L AS(乙酰丁香酮)组成的共培养培 养基中，滴加活化好的含有pCAMBIA1391z-pr〇AaroR3植物表达载体的根癌农杆菌工程菌的 1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28°C暗培养3天。以滴加不带有目的基因的根癌农杆 菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
[0068] 3)抗性再生植株的筛选及检测
[0069]将所述的共培养3天的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤）、 0.05mg/L NAA(萘乙酸）、50mg/L Kan(卡那霉素)和500mg/L Cb(羧苄青霉素)组成的发芽筛 选培养基上，于25°C、16小时的日光和8小时的黑暗中培养，每两周继代培养一次，经过2-3 次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入l/2MS〇(无激素的MS 培养基)和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。
[0070] 根据表达盒proAaPDR3-GUS序列中的proAaPDR3和GUS序列分别设计正向引物 (proPDR3-F : 5 ' -TGAAATTACTATATAATTAGCATAG-3 '）和反向弓|物（GUS-R: 5 ' -GACATCGGCTTCAAATGGCGTA-3 '）对⑶S基因进行检测。利用所设计的PCR特异引物，对挑取的 10株转基因植株分别进行PCR检测。结果表明，其中8株能扩增出特异DNA片段（即GUS基因部 分片段），如图1所示。
[0071] 实施例6启动子pr〇AaroR3所引导的⑶S报告基因在植株中的表达部位的确定
[0072] 对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行⑶S组织染色，结果如图2所示，其中， 染色部位在青蒿的非分泌型腺毛中特异性表达，说明AaH)R3基因启动子pr 〇AaPDR3在转基 因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达。由此可见，本发明所克隆的pr〇AaH)R3基因 启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。
[0073] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种启动子，其特征在于，所述启动子是能调控基因在非分泌型腺毛中特异表达，其 核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。2. 如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子是青蒿AaH)R3基因上游的启动 子。3. 如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子上的顺式作用元件包括:TATA box、CAAT box、G-box、AE-box、ARE、GA-motif、G-box、MBS和Wboχ04. 如权利要求1所述的启动子的应用，其特征在于，在利用植物非分泌型腺毛组织表达 和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述代谢产物为青蒿素。6. -种载体，其特征在于，所述载体连接有如权利要求1所述的启动子。7. -种制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、根据青蒿基因组中AaPDR3基因启动子序列，利用巢式PCR克隆如权利要求1中 所述的启动子的序列； 步骤二、将步骤一中获得的AaPDR3基因的所述启动子的序列连入pCAMB IA1391 z载体， 获得 pCAMB IA1391 Z-proAaPDR3 载体； 步骤三、将步骤二中获得的pCAMBIA1391Z-proAaPDR3载体转化根癌农杆菌； 步骤四、将步骤三中获得的带有pCAMBIA1391Z-pr〇AaPDR3载体的根癌农杆菌转化青 蒿，并进行检测； 步骤五、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位。8. 根据权利要求7所述的制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，其特征在于，所述启动 子与青蒿素合成途径中的关键酶基因融合。9. 根据权利要求7所述的制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，其特征在于，所述巢式 PCR的引物序列为： 第一轮PCR: PF1:5 ' -CTTTTCCAGCCAAATAAGTATGCCG-3 ' ； PR1:5 '-TTCTTCCACTATTGCTCCCTAACCT-3 '； 第二轮PCR: PF2:5 ' -TTTCTTTGGTGTTGTATCAATCTCTG-3 ' ； PR2:5 '-TTCTTCCACTATTGCTCCCTAACCT-3 '； 为构建pCAMBIA1391z-proAaroR3载体，proAaH)R3两端分别引入了 EcoRI的酶切位点和 NcoI的酶切位点，使用的引物序列为： EcoRI-Pro_PDR3-FP:5 '-CGGAATTCGAACTGTTGAATTAGTATTTAC-3 '； Pr〇-PDR3-NcoI-RP:5 '-CATGCCATGGTTTTAATGCTCAAAAAGCCC-3 ' 〇10. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括如权利要求1所述的启动子。
【专利摘要】本发明公开了一种启动子，该启动子是能调控基因在非分泌型腺毛中特异表达，其核苷酸序列如SEQ？ID？No：1所示，是AaPDR3基因的启动子。该启动子可以应用于利用植物非分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。另外，本发明还公开了包含该启动子的载体和表达盒。本发明也为深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控，尤其是通过AaPDR3基因的启动子proAaPDR3进行研究奠定了基础。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/82, A01H5/00
【公开号】CN105567685
【申请号】CN201610031095
【发明人】唐克轩, 付雪晴, 石璞, 刘萌, 沈乾, 颜廷祥, 唐岳立, 黎凌, 孙小芬
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月18日