可分泌型trail蛋白构建物和表达载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因重组和蛋白表达领域。本发明提供了一种可分泌型TRAIL蛋白构 建物和其表达载体，具体的，提供了一种可表达分泌型TRAIL蛋白构建物和慢病毒表达载 体。本发明的慢病毒表达载体可在宿主细胞中表达TRAIL蛋白分子，并可将表达的TRAIL 蛋白分泌至宿主细胞外的培养液中，便于收集和纯化，以及更有效地在需要TRAIL蛋白的 个体的体内发挥TRAIL蛋白的生理生化作用。
【背景技术】
[0002] 癌症和恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康的最主要疾病之一，每年的发病率和 死亡率都在逐渐攀升，世界各个国家的卫生组织，都对癌症和恶性肿瘤给予越来越多的关 注。目前对于癌症和恶性肿瘤的治疗中，化疗、放疗和手术治疗依然是临床最常使用的主要 手段。手术治疗受病灶部位限制，而化疗和放疗的副作用显著，不仅对肿瘤细胞产生抑制， 也对正常细胞和组织产生严重杀伤作用，因此临床使用上受到严重限制。需要新的有效的 低副作用的抗肿瘤制剂出现。
[0003] 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand, TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一员。参见W097/33899 和Wiley, S.R.等，Immunity 3:673-682(1995)。TRAIL主要通过与细胞表面的死亡受体 (DR4和DR5)结合，启动外源性凋亡途径，从而诱导肿瘤细胞产生凋亡。并且，该凋亡诱导 活性主要是针对肿瘤细胞，而对正常细胞不产生杀伤作用，因此具有一定肿瘤特异性。获得 TRAIL蛋白最经济的方式是基因工程表达纯化，目前多用的表达系统包括大肠杆菌原核表 达系统和细胞真核表达系统。由于TRAIL蛋白是哺乳动物起源，因此真核细胞表达系统具 有更好的兼容性。
[0004] 真核细胞表达TRAIL蛋白过程中有两个问题需要解决。1. TRAIL的可分泌性：一 般的真核细胞表达载体缺乏有效的分泌型信号肽序列，不能将表达的目的蛋白输送到细胞 外培养基当中去，而是累积在细胞内部，一方面影响了目的蛋白的积累，另一方面也为后续 分离纯化过程增加了困难。2.构建的基因工程细胞基因稳定性：普通真核细胞表达载体， 将目的基因片段带入宿主细胞基因组中后，并不能稳定存在，目的基因随着宿主细胞传代 分裂过程会逐渐丢失，因此需要不断的抗生素选择和单克隆细胞筛选。
[0005] 本领域仍需要更好的在体内或体外表达TRAIL蛋白的表达载体。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种用于构建可分泌型TRAIL蛋白表达载体的核苷酸构建体。本 发明还提供了可表达分泌型TRAIL蛋白的表达载体，该载体可稳定的转染哺乳动物宿主细 胞，并可将表达的TRAIL蛋白分泌到宿主细胞外的细胞培养液中，便于后续的收集，分离和 纯化。
[0007] 本发明提供了一种核苷酸分子，其包括如SEQ ID N0 :1所示序列中第7-930位的 核苷酸序列。其中，SEQ ID NO :1的第91-930位的核苷酸序列编码TRAIL蛋白。本发明的 所述核苷酸分子为DNA构建体，具体的，为可分泌型TRAIL表达构建体，可用于插入到合适 的载体中，形成表达可分泌型TRAIL蛋白的表达载体。在本发明的其中一个方面，本发明的 核苷酸分子的核苷酸序列为如SEQ ID NO :1的第7-930位所示。
[0008] 氨基酸是由多核苷酸编码的。多核苷酸中的信使RNA链上决定一个氨基酸的相邻 的三个碱基叫做一个"密码子"，亦称三联体密码。同一种氨基酸可以由几个不同的密码子 来决定。本发明的核苷酸分子还包括其核酸序列中的对应SEQ ID N0 :1的第91-930位编 码TRAIL蛋白的核酸序列与SEQ ID N0 :1的第91-930位不同，但符合氨基酸编码简并性， 也可表达SEQ ID N0 :1的第91-930位编码的TRAIL蛋白的核苷酸分子。
[0009] 本发明的核苷酸分子还包括其核酸序列中的对应SEQ ID N0 :1的第91-930位的 核酸序列与SEQ ID N0 :1的第91-930位不同，但可编码与SEQ ID N0 :1的核苷酸序列中第 91-930位编码的TRAIL蛋白具有相同或相似的活性的蛋白的核苷酸分子，所述具有相同或 相似的活性的蛋白与SEQ ID N0 :1的核苷酸序列中第91-930位编码的TRAIL蛋白比较，在 其氨基酸序列中可引入了一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位后所得的氨基 酸序列，但保持和具有TRAIL蛋白的活性。
[0010] 本发明还提供了一种含有上述本发明的核苷酸分子的载体。所述载体可为能够独 立复制并具有选择标记的载体，如质粒、噬菌体和病毒等。根据载体的性质不同，可采用转 染、转化、转导等方式，将重组DNA分子导入宿主细胞内，并使其大量繁殖。合适的基因工程 宿主是本领域公知的，可以是大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等。在本发明的其中一个方面，其中 所述载体为病毒载体，其中所述核苷酸分子可表达地插入到所述病毒载体中。在本发明的 其中一个方面，本发明的载体可转染哺乳动物宿主细胞和表达TRAIL蛋白，并且所述TRAIL 蛋白可分泌到宿主细胞外。
[0011] 在本发明的其中又一个方面，所述载体为慢病毒载体，其中所述的核苷酸分子可 表达地克隆入慢病毒表达载体pLVTHM。
[0012] 本发明还提供了转化细胞的方法，所述方法包括用前述本发明的核苷酸分子或载 体来转化哺乳动物细胞。
[0013] 本发明还提供了包含前述本发明的核苷酸分子或载体的哺乳动物细胞。
[0014] 本发明还提供了用于生产TRAIL蛋白的方法，所述方法包括用前述本发明的核苷 酸分子或载体来转化哺乳动物细胞，在所述哺乳动物细胞中表达TRAIL蛋白，所述TRAIL蛋 白可分泌到宿主细胞外的培养液中。
[0015] 本发明提供的可分泌型TRAIL表达构建体中，包括了高效的分泌信号肽序列和其 它表达操控元件序列，可使位于其下游的TRAIL蛋白编码基因表达的TRAIL蛋白分子在表 达后能够分泌到细胞外培养基中。特别是当本发明的表达构建体被克隆到慢病毒载体，例 如慢病毒表达载体PLVTHM中，能够在哺乳动物细胞中高效和稳定地表达TRAIL蛋白分子。 本发明提供的表达可分泌型TRAIL蛋白的慢病毒载体，利用慢病毒的特点将TRAIL蛋白表 达基因稳定的整合在宿主细胞的基因组中，不易丢失。由此，本发明提供的表达可分泌型 TRAIL蛋白的慢病毒载体和生产、分离、纯化TRAIL蛋白的方法，既方便了后续的纯化提取， 省略了细胞破碎的过程；又避免表达的TRAIL蛋白在细胞内被胞内蛋白酶水解，因此可以 显著提高蛋白表达效率。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明的可分泌型TRAIL蛋白构建体的一种实施方式的核苷酸序列；
[0017] 图2为本发明的可分泌型TRAIL蛋白表达基因片段的琼脂糖凝胶电泳图；
[0018] 图3经双酶切回收的慢病毒表达载体pLVTHM质粒片段的琼脂糖凝胶电泳图；
[0019] 图4为HEK293细胞经慢病毒包装三质粒共转染48小时后的荧光显微照片图；
[0020] 图5为慢病毒颗粒感染MSC细胞的荧光和白光显微照片图；
[0021] 图6为检测TRAIL蛋白的ELISA标准曲线图；
[0022] 图7为MTS法检测感染了慢病毒的MSC细胞上清液条件培养基对U87肿瘤细胞的 生长抑制作用图。
【具体实施方式】
[0023] 为了更好地理解和阐释本发明，下面将参照附图对本发明作进一步的详细描述。
[0024] 实施例1
[0025] 1、编码可分泌型TRAIL蛋白构建体的制备
[0026] 合成具有SEQ ID NO : 1 (如图1所示）的核苷酸序列的双链DNA分子。该DNA分 子包含本发明的核苷酸分子，其核苷酸序列为如SEQ ID N0 :1所τκ序列中第7-930位的核 苷酸序列。在合成的DNA分子中，其两端的六个核苷酸分别是额外增加的用于构建载体的 限制性核酸内切酶Cla I和Mlu I的酶切位点。
[0027] 2、双链DNA分子的双酶切和胶回收
[0028] 合成的双链DNA分子经限制性核酸内切酶Cla I和Mlu I (NEB公司）充分消化。 消化产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，以Qiagene公司的胶回收试剂盒纯化约930bp片段。
[0029] 图2为经双酶切回收的可分泌型TRAIL蛋白表达基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。 该基因片段约为930bp。图中右侧为目的DNA条带，左侧为使用的Invitrogen公司1Kb Plus DNA ladder 分子量 marker。
[0030] 实施例2可分泌型TRAIL慢病毒表达载体pLVTHM-seTRAIL的构建
[0031] 1、pLVTHM载体的双酶切
[0032] 将 pLVTHM 载体质粒（Addgene，cat. no.为 Plasmid 12247)DNA 经 NEB 公司的限制 性核酸内切酶Cla I和Mlu I充分消化，消化产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳分析，以Qiagene 公司的胶回收试剂盒纯化约7500bp的片段。
[0033] 图3为经双酶切回收的慢病毒表达载体pLVTHM质粒DNA电泳图，基因片段约为 11，OOObp，右侧为目的DNA条带，左侧为使用的Invitrogen公司1Kb Plus DNA ladder分 子量 marker。
[0034] 2、酶切产物的连接及转化
[0035] 将实施例1经过酶切回收的约930bp小片段DNA和实施例第1步经同样酶切回 收的约11，ooobp大片段质粒DNA以5:1的摩尔比例混合，并以NEB公司的T4DNA连接酶 16°C连接过夜，构建成表达载体pLVTHM-seTRAIL。连接产物转化E. coli DH5a感受态细 胞（转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯， K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley&Sons出版社1995年第三版 P39-40)，以氨卞青霉素抗性筛选转化子。
[0036] 3、表达载体 pLVTHM-seTRAIL 的验证
[0037] 将挑选的阳性转化子扩培，提取质粒DNA (质粒DNA提取方法按J.萨姆布鲁克， E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》美国纽约冷泉港出版社2001年第三版 P27-30)，并以Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序证实连接正确。
[0038] 实施例3表达可分泌型TRAIL慢病毒颗粒的包装
[0039] 1、表达质粒pLVTHM-seTRAIL和辅助质粒浓度和纯度的测定
[0040] 采用第二代慢病毒包装系