转基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁侧序列及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属植物生物技术领域，具体地，涉及一种抗病转基因大豆事件B4J8049外源 插入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物，本发明还涉及利用该引物对转基因大 豆事件B4J8049进行特异性检测的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]大豆疫霉根腐病（Phytophthora root rot, PRR)是由大豆疫霉菌（Phytophthora so jae)引起的一类土传检疫性病害。该病原菌在大豆整个生育期都能侵染大豆并造成危 害，导致早期大豆烂种、猝倒和中后期根、茎腐烂。大豆疫霉根腐病在全球各大豆主产区均 有发生，每年造成大豆产量损失超过10亿美元，是危害大豆生产的毁灭性病害之一。我国自 1989年首次在东北地区分离到该病原菌以来，随着国外大豆品种的不断引入，大豆疫霉根 腐病在我国大豆主要产区特别是东北大豆主产区的发生和为害程度逐步加重。一般发病率 在5%左右，感病品种一般减产25 %-50%，高感品种可达90%以上。严重地块的大豆植株成片 枯死，甚至绝产，对我国大豆生产构成巨大的潜在威胁。
[0003]大豆疫霉菌为寄主专化性病原菌，属鞭毛菌亚门卵菌纲疫霉属。该病原菌生理小 种分化明显，自1965年首次报道1号、2号生理小种以来，目前已报道的大豆疫霉菌生理小种 至少有55种以上(Leiz RA等，2000)，且不同地区的生理小种分布不同。朱正东和马淑梅等 (2005)对我国东北地区大豆疫霉菌生理小种分布情况鉴定表明，该地区疫霉菌生理小种组 成多样化，包括1号、3号、4号、13号、15号等，其中1号生理小种为优势种群，占鉴定小种数量 的60%以上。目前生产上对大豆疫霉菌的防治主要采用种植抗病品种，改进栽培措施和化学 防治等方法。由于大豆疫霉根腐病为土传病害，采用化学防治较为困难，且常用的化学杀菌 剂如甲霜灵等并不是对所有生理小种都有效。轮作等栽培措施虽然可以在一定程度上减缓 病原菌的危害，但并不能够完全控制病害，且在大豆实际生产中应用具有一定的局限性。抗 病品种的培育和种植是防治大豆疫霉根腐病最为经济、有效和环境安全的措施。
[0004]目前在大豆资源中发现了多个对疫霉根腐病存在小种特异性抗性的大豆品种，携 带 1个或多个抗性基因如Rpsla、Rpslb、Rpsld、Rpslk、Rps3a、Rps3b、Rps3c、Rps4、Rps5、 Rps6、Rps7、Rps8等。由单一抗性基因 Rps介导的抗性，在受到病原菌侵染后，通常会引发寄 主产生超敏感反应(hypersensitive response，HR)，从而对病原产生较强的抗性。但由于 单基因控制的抗性极易造成病原生理小种的快速分化，导致新的病原小种产生并对原有抗 病品种产生抗性。由于抗源基础狭窄，病原生理小种毒性类型复杂，而且变化很快，新的小 种不断出现，利用常规育种方法育成的大豆疫霉根腐病抗病品种的平均使用寿命很短，易 出现抗性退化等方面问题。因此，如何进一步拓宽大豆霉根腐病抗源基础，提高大豆抗疫霉 根腐病水平及抗性持久性，延缓病原生理小种的进化速度，对于减少大豆病害的发生，提高 大豆产量和保护环境等方面均具有重要的意义。
[0005]目前国际上利用转基因技术提高大豆疫霉根腐病抗性的研究较少。Sumit R.等 (2012)报道利用拟南芥非宿主抗性基因 pssl转化大豆品种，转基因大豆对疫霉根腐病的抗 性显著提高。Fan S等(2015年)研究表明，编码抗菌活性蛋白基因 Gly m 41在大豆中的过量 表达可以显著增强转基因大豆抗疫霉根腐病能力。国内郭玉双等(2006)在大豆中过表达菜 豆几丁质酶基因 chi和大豆核糖体失活蛋白基因 rip，获得抗性水平较受体品种明显提高的 转基因大豆株系。我们采用转基因技术，将我国自主克隆的广谱抗病基因 hrpZPsta按照大豆 偏爱性密码子进行人工优化，并导入栽培大豆基因组，获得了一个对疫霉根腐病抗性水平 显著提高的转基因大豆事件B4J8049。该转基因大豆事件已进入环境释放，今后有可能进入 商业化种植。对转基因事件进行特异性检测，能更好的对转基因植物进行监督管理，而外源 插入片段的旁侧序列和根据此旁侧序列建立的检测方法，是对转基因植物及其产品进行有 效监督管理的一个重要依据。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种抗病转基因大豆事件B4J8049外源插入片段旁侧序列 以及用于检测该序列的PCR引物。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种转基因大豆事件的特异性PCR检测方法和试剂 盒。
[0008] 本发明提供的抗病转基因大豆事件B4J8049按如下方式获得： 根据大豆密码子偏爱性对hrpZPstaS因序列进行人工优化，新序列命名为hrpZm，序列 如SEQ-2所示。优化序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并连接到克隆载体pUC-57 上，构建载体pUC57-hrpZm。分别用Pstl/Xbal双酶切pUC57-Gmubi3和中间载体pTF101-35S， 胶回收Gmubi3酶切片段和pTF101-35S酶切大片段，并利用T4 DNA连接酶连接，构建中间表 达载体pTF101-Gmubi3。采用同样的方法，利用Xbal/SacI双酶切pUC57-hrpZm质粒和中间载 体pTF101-Gmubi3,回收hrpZm酶切片段和pTF101-Gmubi3酶切大片段，构建植物表达载体 pTF101-Gmubi3_hrpZm。载体中目的基因 hrpZm位于大豆组成型强启动子Gmubi3下游，终止 子为nos。构建载体结构如图1所示。
[0009] 采用冻融法将pTF101-Gmubi3-hrpZm质粒转入农杆菌EHA101。利用浸泡24小时的 大豆种子作为外植体。沿大豆种脐部位将大豆种子剖开，并在子叶节位置轻微划伤处理后， 用携带载体质粒的农杆菌进行侵染。共培养4天后，在含6m g//L草丁膦的诱导培养基上进行 连续3轮筛选培养。筛选获得的抗性芽经诱导伸长和生根后再生为完整的小植株。再生苗移 栽至温室中开花、结实。经连续多代PCR检测和田间除草剂(BASTA)喷施筛选，获得转基因大 豆事件B4J8049。
[0010] 采用Southern杂交检测及转基因后代外源片段分离比例分析，确定该转基因事件 外源片段为单拷贝插入。Southern杂交检测结果如图2所示。连续多代接种疫霉菌结果表 明，转基因事件B4J8049对大豆疫霉根腐病具有较好的抗性。
[0011]本发明提供了抗病转基因大豆事件B4J8049外源插入片段右边界旁侧序列， 其具有SEQ-1所示的序列或其特异性片段或互补于该序列的序列。
[0012] 本发明提供了 SEQ-1所示序列在检测抗病转基因大豆事件B4J8049包括亲本、衍生 品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品中的应用。
[0013] 鉴于独立转基因事件中，外源T-DNA片段在植物基因组中的整合具有随机性的特 点，不同转基因事件其外源片段在基因组中的插入位点不同。对于特定的转基因事件来说， 其旁侧序列是特异的。因此，应用插入片段旁侧序列可以对转基因事件进行特异性检测。如 利用包含部分旁侧序列和部分外源插入片段序列的探针进行杂交，或是设计包含部分旁侧 序列和部分外源插入片段序列的特异性引物进行PCR扩增等。可以根据5'端旁侧序列设计 上游引物，外源插入片段序列设计下游引物，扩增特异性片段;或是根据外源插入片段序列 设计上游引物，3'端旁侧序列设计下游引物，扩增特异性片段。
[00M]本发明还提供了用于扩增SEQ-1所示序列的特异性引物。
[0015] 在本发明提供的一个实施例中，提取转基因大豆事件B4J8049叶片基因组DNA，利 用特异性引物和高简并性随机引物进行TAIL-PCR扩增，获得外源片段在转基因大豆基因组 中整合位点的右边界l〇27bp序列。包括第1 一993bp大小为993bp的大豆基因组序列和第 994一 1027bp大小为34bp的外源片段序列，如SEQ-1所示序列。分析外源片段整合位点的右 边界序列，根据插入片段右边界左侧序列(T-DNA区内）设计特异性上游引物财北049? :5'_ TTTCCCGCCTTCAG TTTAAACTATCAG-3 '（ SEQ-5);根据大豆基因组序列设计特异性下游引物 B4J8049R: 5'-GACGCCGTCAACAATGGTGAAC-3'（SEQ-6)。利用PCR反应进行扩增，获得 1010bp 特异性片段，包括第1 一976bp大小为976bp的大豆基因组序列和第977-1010bp大小为34bp 的外源片段序列（SEQ-7)。
[0016] 本发明提供了上述引物在制备检测转基因大豆试剂盒中的应用。
[0017] 本发明提供了一种检测转基因大豆事件B4J8049的方法，以大豆样品总DNA为模 板，利用本发明提供的引物进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。
[0018] 上述检测转基因大豆事件B4J8049的方法，其PCR反应体系（25uL)为：10 X PCR缓冲 液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL, 5U/uL Taq酶0.5uL，大豆样品总DNA 1.0uL，10umol/L上 游引物0.5 uL，10umol/L下游引物0.5 uL，ddH20 19.5 uL〇
[0019] PCR反应条件为：95°