一种基于高通量基因测序无创活检病毒的方法及标签接头的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种病毒检测方法，具体涉及一种基于高通量基因测序无创活检病毒 的方法和所使用的标签接头。
【背景技术】
[0002] 病毒主要分为DNA病毒、RNA病毒和蛋白质病毒，以异养寄生的方式存在于近乎所 有的生物中，有些病毒能对寄主造成危害甚至是死亡。在各种环境中，往往是由多种病毒构 成生态系统，交叉感染并导致疾病并发，而这些病毒的核酸遗传物质可存在双链DNA、单链 DNA、双链RNA和单链RNA四种类型。
[0003] 传统的病毒鉴定方法包括过滤筛选、组织培养、电子显微镜观察、血清学、疫苗接 种，以及细胞培养观察等。但这些方法都依赖对病毒的分离富集、病毒在蛋白和核酸水平上 序列的保守性等信息，对于不能在实验条件下培养、不易扩增的一些病毒或者是己知序列 保守性很低的新病毒的鉴定就无能为力。常规PCR的通量低，检测区域短，只针对DNA类型的 病毒，这些特点制约着病毒核酸检测技术的发展。
[0004] 病毒宏基因组学作为一种新兴的病毒组学研究技术，不需要对病毒进行培养，且 在未知病毒序列的情况下，可以直接以环境样本中所有病毒的遗传物质作为研究对象，快 速地鉴定出样本中的病毒组成。但所用的常规的单一核酸类型的测序方法也存在缺陷：在 DNA建库的时候，将RNA视为污染去掉，而RNA建库的时候，则将DNA视为杂质去掉，其最终测 得的DNA和RNA并不等于完整的宏基因组总和，不能完整反映病毒样品原始的生态组成。
[0005] Ion Torrent PGM高通量测序平台具有快速、通量适中、不依赖已知序列来扩增的 优点，非常适用于小型基因组测序。需要考虑的问题是目前高通量测序平台均为进口仪器， 而且测序实验指定使用官方独家配套的试剂盒，仅单次上机的样品处理的成本就一千以 上，这让众多用户难以承担。
[0006] 同时，由于高通量测序的灵敏性，对样品纯度具有极高的要求。但病毒基因组在常 规细胞内外中仅有几个拷贝，3kb到上百kb，而人的核基因组为3Gb，相差几百万倍。所以，传 统的抽提方法往往无法避免宿主细胞核基因组的污染，导致测序数据无法使用。要想经济 有效、完整地反映样本中病毒的原始生理状态，还要考虑解决两个问题，一是如何有效降低 测序成本，二是如何有效地去除宿主核酸污染，提高病毒核酸的丰度。
[0007] 因此，建立一种既可以缩短时间周期，能同一时间原位检测样品所有核酸(包括双 链DNA、单链DNA、双链RNA和单链RNA四种类型），又能降低实验成本，有效去除宿主核酸污 染，还能完整反映样本原始生理状态的病毒检测方法尤为重要。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种基于高通量基因 测序无创活检病毒的方法，本发明提供了该方法中所使用的DNA标签以及DNA标签接头。
[0009] 为实现上述目的，所采取的技术方案:一组DNA标签接头，所述DNA标签接头包括A- BarcodeOOl-F/R~A-BarcodeOlO-F/R。
[0010] 优选地，所述 DNA 标签接头包括 A-BarcodeOll-F/R ~A-Barcode020-F/R。
[0011] 优选地，所述 DNA 标签接头包括 A-Barcode021-F/R ~A-Barcode030-F/R〇
[0012] 优选地，所述 DNA 标签接头包括 A-Barcode031-F/R~A-Barcode040-F/R。
[0013] 优选地，所述 DNA 标签接头包括 A-Barcode041_F/R ~A-Barcode050_F/R。
[0014] 优选地，所述 DNA 标签接头包括 A-Barcode051-F/R~A-Barcode060-F/R。
[0015] 优选地，所述 DNA 标签接头包括 A-Barcode061-F/R~A-Barcode070-F/R。
[0016] 优选地，所述 DNA 标签接头包括 A-Barcode071-F/R~A-Barcode080-F/R。
[0017] 本发明所述△-1^1'(3〇(16001-卩/1?~八-13&1'(3〇(16010-卩/1?是指八-13&1'(3〇(16001-卩、八-Barcode001-R、A-Barcode002-F、A-Ba;rcode002-R、A-Ba;rcode003-F、A-Ba;rcode003-R、A-Barcode004-F、A-Barcode004-R、A-Ba;rcode005-F、A-Ba;rcode005-R、A-Ba;rcode006-F、A-Barcode006-R、A-Barcode007-F、A-Ba;rcode007-R、A-Ba;rcode008-F、A-Ba;rcode008-R、A-Barcode009_F、A-Barcode009-R、A-BarcodeO 10-F和 A-BarcodeO 10-R 的组合。所述 A-BarcodeOl 1-F/R~A-Barcode020-F/R，A-Barcode021-F/R~A-Ba;rcode030-F/R，A-Barcode031-F/R~A-Barcode040-F/R，A-Ba;rcode041-F/R~A-Ba;rcode050-F/R，A-Barcode051-F/R~A-Barcode060-F/R，A-Ba;rcode061-F/R~A-Ba;rcode070-F/I^PIA-Barcode071_F/R ~A-Barcode080_F/R 所分别指代的意思可参照上述 A-Barcode001-F/R ~ A-BarcodeO 10-F/R的定义进行解释。
[0018] 本发明还提供了上述所述的一组DNA标签接头在用于构建DNA标签文库中的用途。 [0019]本发明还提供了上述所述的一组DNA标签接头在用于高通量基因测序无创活检病 毒中的用途。
[0020] 本发明提供了一种标签接头的设计方法，所述设计方法包括以下步骤：
[0021] (1)将标签序列barcode X设置为11个碱基且所述标签序列barcode X末端最后一 个碱基为C,与接头核心信号识别序列Barcode Adapter开头的G构成CG稳定碱基对；
[0022] 所述接头核心信号识别序列Barcode Adapter为GAT;
[0023] 双链标签接头的3'突出部分双硫代修饰；
[0024] 所述标签序列barcode X中的GC或CG结构不超过2个；
[0025] 所述标签序列barcode X的碱基百分比：％A、％T、％(：和％6分别为18.00_ 30.00,%A+T = 45.00-60.00；%C+G = 40.00-55.00；%A+%T+%C+%G = 100% ；
[0026] (2)将通用序列、步骤（1)设计的签标序列barcode X和接头核心信号识别序列 Barcode Adapter依次连接，即为所述标签接头。
[0027] 优选地，所述步骤（1)中标签序列barcode X的11个碱基含量比：％ A = 27.27、％G = 18.18、％T = 27.27、％C = 27.27，％A+T = 54.55、％C+G = 45.45;
[0028] 所述标签序列barcode X含有的碱基个数:3六、3(：、26和31'。
[0029] 本发明提供了一种基于高通量基因测序无创活检病毒的方法，所述方法包括以下 步骤：
[0030] (1)往η个待检样品中加入DNAse I和RNase，n为整数且1 <n<80,消化病毒壳外的 宿主核酸后，进行DNA和RNA共抽提；
[0031 ] (2)将步骤(1)提取的DNA和RNA都转变为平末端的双链DNA序列；
[0032] (3)将步骤(2)得到的双链DNA序列打断；
[0033] (4)将步骤(3)打断的双链DNA序列进行DNA片段末端修复；
[0034] (5)3'端连接P1通用接头和5 '端连接DNA标签接头，对不同的样品连接不同的DNA 标签接头，所述DNA标签接头是上述所述的DNA标签接头；
[0035] (6)对步骤（5)中连接上不同DNA标签接头的连接产物进行回收纯化和PCR扩增， PCR扩增引物为pcr-priemer-A和pcr-priemer-Pl;所述pcr-priemer-A的序列如SEQ ID N0:241 所示，所述pcr-priemer-Pl的序列如SEQ ID N0:242所示；
[0036] (7)将步骤(6)中扩增后的连接有不同标签接头的连接产物混合，然后测序，通过 数据库比对和锁定标签接头序列，从而鉴定出每个样品中所含病毒种类和生态系统相关信 息。
[0037] 本发明标签接头设计与合成是根据Ion Torrent高通量测序平台标签接头结构特 征和仪器兼容性最优化进行定义的80种barcode标签序列，并通过退火处理将单链接头变 成特异性的双链接头。
[0038] 文库标签接头分为目的片段的5'端A接头和3'端P1接头，其中A接头为标签接头， 其含部分通用序列，P1为通用接头。其通用序列部分用于与扩增引物的互补结合。接头结构 序列如下：
[0039] A-BarcodeX-F为
[0040] CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG|barcode X-F|Barcode Adapter-F|；
[0041 ] A-BarcodeX-R为
[0042] Barcode Adapter-R|barcode X-R|CTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGA GATGG*T*T；
[0043] Pl-Forward为
[0044] CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT；
[0045] Pi-Reverse为
[0046 ] ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG*T*T 〇
[0047] 最优化自定义标签接头设计原则：
[0048] 自定义标签接头也就是按照一定的接头结构规则和次序自行编码5 '端A接头的 bar codeX-F，bar codeX-R的碱基序列。设计原则如下：
[0049] 1.标签序列barcode X为11个碱基且所有barcode X末端最后一个碱基为C,与 Barcode Adapter开头的G构成CG稳定碱基对；
[0050] 2.接头核心信号识别序列Barcode Adapter为GAT;
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