一种花生种子特异启动子ahssp1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花生种子特异启动子AHSSP1及其应用。
【背景技术】
[0002] 花生是世界重要的油料作物，其籽仁中蛋白质含量为24%~36%;含油量高达 38%~60%，是重要的食用蛋白源和食用植物油源。此外，花生中还富含植物固醇、白藜芦 醇、维生素 E、维生素 C和叶酸等植物活性物质，对促进健康、预防疾病十分有益。随着生物技 术的发展，利用基因工程技术对花生籽仁中蛋白质、油脂及其它营养成分进行遗传改良或 以花生籽仁作为"生物反应器"异源合成蛋白疫苗等已成为一种非常有效的手段。
[0003] 花生种子特异启动子作为一类专一性启动子，能指导外源基因在花生种子中特异 表达，它不仅能使目的基因的表达产物在种子中积累，增加在种子中的表达量，而且也避免 了植物营养的浪费。所以，利用花生种子特异性启动子控制目的基因在种子中特异表达具 有重要的理论和实践意义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种花生种子特异启动子AHSSP1及其应用，本发明在花生中克隆到 一个951bp的启动子片段AHSSP1，经生物信息学分析、RT-PCR以及转基因验证，确定AHSSP1 是一个能驱动外源基因在种子中特异表达的启动子。
[0005] 本发明具体采用的技术方案如下：
[0006] 一种花生种子特异启动子AHSSP1，其具有如SEQ ID No:l所示的核苷酸序列。
[0007] 进一步的：所述花生种子特异启动子AHSSP1含有RNA聚合酶结合位点TATA box、 CAAT box和RY元件。
[0008] 进一步的：扩增所述花生种子特异启动子AHSSP1的引物AHSSP1-F2和AHSSP1-R2序 列为：
[0009] AHSSP 卜F2:5，-AAGCTTGCAGAAATAGAAAGTGGGAACAAA-3，；
[0010] AHSSP1-R2:5 '-GGATCCGTGGTGGTTATGGAATGTGTATTGAAGA-3 '。
[0011] 进一步的：扩增所述花生种子特异启动子AHSSP1的PCR扩增体系为:ddH2〇 31yL， 含 Mg2+的 5XHF buffer 10yL;浓度为 2.5mM 的 dNTP 2yL;浓度均为 5μΜ 的 AHSSP 卜 F2 和 AHSSP1-R2各2yL; DMS0 0 · 6yL; Phus ion酶0 · 5yL;基因组模板2yL。
[0012]进一步的：扩增所述花生种子特异启动子AHSSP1的PCR反应条件为：98°C预变性 30s ;98°C 变性 10s，58°C 退火 10s，72°C50s，30 个循环；72°C 后延伸 lOmin。
[0013] 本发明还提供了所述的花生种子特异启动子AHSSP1在驱动外源基因在植物的种 子中特异表达中的作用。
[0014] 进一步的:所述外源基因为⑶S基因。
[0015] 进一步的:所述植物为拟南芥。
[0016] 本发明的优点和技术效果是:本发明首先提取花生叶片总DNA，用启动子特异引物 AHSSP1-F2和AHSSP1-R2进行PCR扩增，将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体pEASY-Blunt simple中。生物信息学分析，该启动子含有重要的RNA聚合酶结合位点TATA box、 CAAT box，以及种子启动子所特有的RY元件，初步证明AHSSP1是种子特异启动子。
[0017] 经RT-PCR对其驱动的下游基因 AHSSP1进行检测，发现该基因在成熟种子表达，而 在成熟植株的根、茎和叶片中不表达。这进一步表明AHSSP1是种子特异启动子。用Hindi和 BamHI从pEASY-Blunt simple载体切下该片段，替换掉植物表达载体pBI 121中的35S。将构 建好的植物表达载体转入农杆菌GV3101。利用"蘸花法"对拟南芥(Co 1 0生态型)进行遗传 转化，对转基因 T2代拟南芥萌发1-8天的幼苗进行GUS组织化学染色分析发现：刚萌发的幼 胚染色最深，未长出真叶、保持胚性的幼苗也有较深的染色，而在长出真叶的幼苗中没有检 测到蓝色。这说明，AHSSP1能驱动GUS报告基因在植物种子中特异表达，足以证明它是一个 种子特异启动子。
[0018] 所以本发明获得了一个新的花生种子特异启动子AHSSP1，其克隆鉴定将对花生籽 仁品质改良或以花生籽仁作为"生物反应器"异源合成药物蛋白等具有重要的应用价值。
[0019] 结合附图阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他特点和优点将变得更加清 楚。
【附图说明】
[0020] 图1是RT-PCR检测AHSSP1基因在花生根、茎、叶和成熟种子中的表达情况，Actin是 内标基因。
[0021] 图2是AHSSP1启动子的PCR扩增及植物表达载体构建示意图。A:启动子AHSSP1片段 示意图；B:植物表达载体pBI121结构示意图；C:启动子AHSSP1片段与植物表达载体pBI121 连接得到质粒PBI121-AHSSP1 ;D:PCR获得启动子AHSSP1片段。M:分子量标记Marker (Trans2K PlusII);⑶S:β-葡聚糖苷酶基因；NPTII:新霉素磷酸转移酶基因；N0S-P:胭脂碱 合酶基因启动子;N0S-T:胭脂碱合酶基因终止子;35S-P:烟草花叶病毒35S启动子;LB:左边 界;RB:右边界。
[0022]图3是AHSSP1启动子序列及顺式作用元件分析。
[0023]图4是转AHSSP1::⑶S拟南芥PCR检测，其中1-10:随机选取的10株卡那抗性的转基 因拟南芥;Ρ质粒对照;WT:野生型拟南芥Col 0;Μ:分子量标记Marker(Trans2K PlusII)。
[0024]图5是GUS组织化学染色，其中A:萌发第1天的种子，能染较深的蓝色;B:种子萌发 第5天，保持胚性的根、茎和子叶均能染色;C:幼苗长至第8天，此时种子胚性完全丧失，不能 再被染成蓝色。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明技术方案作进一步详细的说明。
[0026] 实施例1
[0027] 本实施例具体包括以下试验过程：
[0028] 1 · 1试验材料
[0029]植物材料为市售的花生品种"花育33"和拟南芥(生态型ColO)。大肠杆菌DH5a感受 态、DNA分子量标记、PCR mix等购自北京全式金生物有限公司；高保真酶Phusion购自New England Biolabs公司；X-Gluc购自北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶BamHI和 Hindlll购自Fermentas公司；T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试 剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；农杆菌菌株GV3101以及超表达载 体PBI121为本申请人提供。
[0030] 1.2 AHSSP1所驱动基因内源表达分析
[0031] 设计基因特异引物AHSSP1-F1和AHSSP1-R1 (如表1所示），提取花生栽培种"花育 3 3"根、茎、叶片和成熟种子的RNA，反转录成cDNA。利用RT-PCR方法检测其在根、茎、叶片和 种子中的表达情况，以花生基因 Actin作为内参基因（表1)。
[0032]图1实验结果显示:该基因只在种子中有很强的表达信号，在根、茎和叶片中均不 表达。这表明该基因在种子中特异表达。
[0033] 该启动子DNA序列（SEQ IN N0:1)如下：
[0034]
[0035] 1.3花生幼嫩叶片DNA提取及AHSSP1启动子片段的克隆
[0036]本发明用植物DNA提取试剂盒提取"花育33"幼嫩叶片基因组，以此为模板，使用高 保真酶Phusion，利用AHSSP1特异引物AHSSP1-F2和AH