一种可用于艾滋病基因治疗的CRISPR/SaCas9系统的制作方法
【技术领域】
[00011本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR/SaCas9特异性敲除人CCR5基 因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA。
【背景技术】
[0002] 人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)归属于逆转录病毒科 慢病毒属中的人类慢病毒组，其感染引起的获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是目前威胁全球人类健康的主要疾病之一。人类免疫 缺陷病毒通常也俗称为"艾滋病毒"，截止到2014年底，艾滋病毒携带者多达3690万人。自 1981年发现第一例由HIV引起的艾滋病的25年以来，尽管对艾滋病的临床治疗已有了很大 进展，但是仍无有效治愈手段攻破此科学难题。
[0003] 病毒特异的⑶4+T细胞是针对HIV免疫应答的重要组成部分，也是HIV-1感染过程 的首要靶点。自1984年发现HIV-1通过与⑶4结合感染宿主细胞，随后研究又发现仅有⑶4分 子并不能介导HIV-1的侵入，同时还需要一种或几种辅助受体。1996年证实，趋化因子受体 CXCR4和CCR5是HIV-1感染的辅助受体。其中，趋化因子CCR5,作为G蛋白偶联因子超家族 (GPCR)成员的细胞膜蛋白，是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一。一个接触HIV但未 检测到HIV感染的个人，带有CCR5编码基因32个核苷酸缺失，表明了 CCR5影响HIV病毒入侵 细胞。因而以CCR5为靶点的HIV-1受体拮抗剂越来越受关注，主要有趋化因子衍生物、非肽 类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等。这些抗病毒活性强、亲和力高的CCR5拮抗剂， 已有一部分进入了临床试验阶段。
[0004] 尽管辅助受体拮抗剂可有效预防HIV-1感染，遏制艾滋病的流行，但是此类抑制剂 的发展也面临着挑战。长期使用一种抑制剂，最终会使HIV-1产生耐药性。随着耐药性的不 断出现，使得现有的抗HIV-1药物难以达到理想的治疗效果。因此，从基因组层面失活CCR5 具有重要的治疗价值，这样，特异性靶向CCR5引起了人们的广泛关注。
[0005] 2008年，Sangamo成功的利用Engineered zinc finger nucleases(ZFNs)在CD4+T 细胞上实现CCR5的敲除，如今这项名为SB-728-T的项目已被尝试应用于HIV感染人群的基 因治疗，并已进入临床二期阶段。这一基因编辑产品通过敲除分离到的病人的CD4+T细胞的 CCR5，然后自体回输到病人，可以用于HI V感染的治疗。越来越多的实验结果表明CCR5基因 是一个可靠、高效和安全的治疗HIV的靶点，能够实现CCR5在基因组层面上的敲除也是可 靠、高效和安全的治疗方法。然而，即使在经过真核抗性筛选之后，ZFN祀向敲除CCR5的效率 也只有大约为30%。很明显，这个效率还是差强人意。
[0006] 1987年，日本研究员在试验中发现大肠杆菌中存在串联间隔重复序列DNA，但是并 不知道它们具体的功能。经过深入的研究发现，这是广泛存在于细菌和古生菌中的一种序 列，最终在2002年将其正式命名为规律成簇间隔短回文重复系统CRISPR(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats)。在2007年，研究者发现细菌可以 利用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵，接着又有研究发现细菌的CRISPR系统能够阻止外源质 粒的侵入，由此可见这种存在于大多数细菌和所有古生菌中的特殊的DNA重复序列在获得 性免疫系统发挥着重要的作用。
[0007] CRISPR主要有3部分组成，其包括一个前导区（Leader)、多个短而保守的重复序列 区（Repeat)和多个间隔区（Spacer)。前导区是位于CRISPR簇的上游，是富含AT长度300-500bp的区域，被大多数人认为是启动子序列；重复序列区是长度为21-48bp为的含有回文 序列的碱基，其可形成发卡结构，而重复序列间又被26-72bp间隔区碱基序列隔开；间隔区 主要有外源的DNA序列组成，其类似于记忆性的免疫，当含有相同序列的外源DNA再次入侵 机体时，就可被自身机体识别，然后对外源DNA进行切割使之不能表达，以保护自身不被外 源病毒或细菌所侵害，因此，正是这些间隔序列发挥着对靶基因的识别作用。研究人员对 CRISPR进一步研究发现，其侧翼序列附近存在一个多态性家族基因，该基因编码的蛋白质 存在能与核酸相互作用的功能域，此功能域具有整合酶、核酸酶、聚合酶等酶活性，与 CRISPR区域共同起作用，被命名为CRISPR关联基因（CRISPR-associated)，缩写为CasXas 系统有type I，II，III型，其中typell中含有一个特殊的蛋白Cas9，Cas9靶向切割DNA是通 过CRISPR系统中的两种小RNA-crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activatig crRNA) 和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA (single guide RNA) <Xas9和CRISPR形成复合体识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造 成双链DNA断裂，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)，造成移码突变，导致基因敲除（Wiedenheft，Sternberg et al · 2012，Cong， Ran et al.2013，F.Ann Ran et al.2015)。
[0008] 这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关 注，在2012年开始像爆炸一般流行开来。研究人员优先选择改造了来自化脓链球菌的Cas9 酶(SpCas9)来改变高等生物的DNA，并已成为一系列高度通用的基因组修饰技术的基础。之 前的一些研究利用CRISPR/SpCas9系统在CD4+T细胞或者CD34+干细胞对艾滋病毒的辅助受 体CCR5进行基因修饰，在一定的程度上可以抑制HIV-1病毒的侵入，但是也存在着一定的脱 革巴率（Cradick，Fineet al.2013，Ye，Wang et al.2014)〇
[0009] 最近发现了一种新的CRISPR/Cas9系统，它是一种是来自金黄色葡糖球菌的Cas9 酶(SaCas9)，其基因敲除效率与之前的CRISPR/SpCas9系统相当，但是其大小却减少了 25% (F.Ann Ran et al.2015)。腺相关病毒(AAV)是基因治疗的最佳载体，但是由于其负载能力 有限，使其包装SpCas9酶和其他必须的基因元件进入单个病毒颗粒存在一定的难度，而 SaCas9的出现为这一问题的解决带来了新的希望。
[0010] SaCas9与SpCas9存在着不同之处，SaCas9主要识别5'-NNGRRT-3'特征区域的 NGGRRT位点，然后对与sgRNA互补的DNA序列进行剪切，被剪切后断裂的DNA双链通过非同源 末端直接连接（non-homologous end joining，NHEJ)或者同源重组（homology-directed repair，HDR)的修补方法进行修复，修复后的DNA会由于某些碱基的随机插入、缺失、突变等 使基因的序列发生改变从而抑制了基因的表达，由此在DNA水平上对基因进行定向敲除。而 SpCas9的识别位点为PAM序列5' -NGG-3'，然后再对靶位点进行剪切。
[0011] 新发现的SaCas9与之前的SpCas9相比具有很多优点：l)SaCas9在哺乳动物体内具 有很高的剪切效率，其所带有的sgRNA的长度范围为21-23个碱基，其本身的大小比SpCas9 小25%，更有利于AAV载体携带其它相关基因进入单个病毒颗粒，经验证其与SpCas9可以达 到相当的效率。2)在SaCas9系统中，把其sgRNA的第一个碱基替换成鸟嘌呤，使得SaCas9酶 的活性大大提高，从而提高了其在机体内的剪切效率。3)SaCas9在靶向精确性上效率更高。 [0012]目前还没有针对HIV-ι的辅助受体CCR5进行特异性敲除的CRISPR/SaCas9系统。 [0013] 参考文献：
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