计的针 对CCR5基因的各个靶位点有不同程度的突变。申请人进一步将PCR产物连接至T-easy载体 (购买自Promega)并测序鉴定(参见图3)，结果证实CCR5靶位点具有不同程度的基因插入或 缺失和突变，甚至移码突变。CCR5基因的5'引物为 ：TTATCAAGTGTCAAGTC(SEQIDN0.6)所 示，3'引物为：TCTGTGGGCTTG(SEQ ID N0·7)
[0107] PCR体系如下：
[0108]
[0109] PCR 程序：951€5111丨11，951€3〇846〇1€3〇8468°(：1111丨11共进行30个循环，最后68 1€ lOmin，4°C保存。所有循环结束后，暂停反应，在反应体系中加0.5μ1 taq酶，72 °C40min给 PCR片段加 A尾。
[0110] 将上述PCR片段用胶回收试剂盒回收（购买自OMEGA)，回收的13个PCR片段经 T7Endonuclease 1(购买自 BioLabs)酶切鉴定。
[0111] 酶切体系：
[0112]
[0113] 37°C 反应 60min。
[0114] 酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0115] T克隆连接体系：
[0116]
[0117] 将上述连接产物转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞，筛选阳性克隆并测序鉴定；
[0118] 慢病毒重组载体的4个靶位点和打靶效率：
[0119]
[0120] 腺相关病毒重组载体的6个靶位点和打靶效率：
[0121]
[0122]
[0123]【实施例3】CRISPR/SaCas9慢病毒系统和腺相关病毒系统的包装 [0124 ]为了使CRISPR/ SaCa s 9重组慢病毒和腺相关病毒载体的切除效率达到更好的效 果，申请人把CRISPR/SaCas9重组慢病毒和腺相关病毒载体在HEK-293T细胞中包装成慢病 毒和腺相关病毒。
[0125] 慢病毒系统的包装体系如下:
[0126] psPAX2慢病毒辅助包装质粒(购自Addgene)
[0127] pMD2. G慢病毒辅助包膜质粒(购自Addgene)
[0128] 不同靶点的lentiCRISPR载体
[0129] 具体过程如下：
[0130] I、转染前24小时铺HEK-293T细胞(购自CCTCC)于一个直径10cm的细胞培养皿中；
[0131] II、待细胞密度细胞达到80~90%为时，以标准的Lipofectamine2000转染试剂将 上述质粒共转染细胞，转染后6~8小时换液。
[0132]转染体系：
[0133]
[0134] 在500μ1 Opti-MEM中加入三种不同量的质粒DNA，同样用500μ1 Opti-MEM稀释 Lipid reagent，将稀释后的DNA按1:1的比例加入到转染试剂中，混勾静止放置20min后，加 入到培养皿里，培养7小时后换液。
[0135] 转染后72小时收集病毒上清（即细胞培养基)过滤，然后对病毒上清进行浓缩，在4 °C，24000rpm，高速离心2小时，弃去上清后加入一定量的培养基重悬，分装后-80°C保存。
[0136] III、病毒滴度检测：将病毒上清以10倍梯度稀释，利用病毒计数仪进行病毒滴度 的初步测定。将病毒分别感染293T细胞，48小时之后药物检测阳性细胞比率，并以比率在 0.1-10%之间的稀释度进一步精确计算出病毒滴度。
[0137] 腺相关病毒系统的包装体系如下:
[0138] pDF腺相关病毒辅助包装质粒(购自Addgene)
[0139] AAV6腺相关病毒辅助包膜质粒(购自Addgene)
[0140] 不同靶点的AAVCRISPR载体
[0141] 具体过程如下：
[0142] I、转染前24小时铺HEK-293T细胞(购自CCTCC)于一个直径10cm的细胞培养皿中；
[0143] II、待细胞密度细胞达到80~90%为时，以标准的Lipofectamine2000转染将上述 质粒共转染细胞，转染后6~8小时换液。
[0144] 转染体系：
[0145]
[0146]
[0147] 在500μ1 Opti-MEM中加入三种不同量的质粒DNA，同样用500μ1 Opti-MEM稀释 Lipid reagent，将稀释后的DNA按1:1的比例加入到转染试剂中，混勾静止放置20min后，加 入到培养皿里，培养7小时后换液。
[0148] 转染后72小时收集病毒上清（即细胞培养基)过滤，然后对病毒上清进行浓缩，在4 °C，24000rpm，高速离心2小时，弃去上清后加入一定量的培养基重悬，分装后-80°C保存。
[0149] III、病毒滴度检测：将病毒上清以10倍梯度稀释，利用病毒计数仪进行病毒滴度 的初步测定。将病毒分别感染293T细胞，48小时之后药物检测阳性细胞比率，并以比率在 0.1-10%之间的稀释度进一步精确计算出病毒滴度。
[0150]【实施例4】利用CRISPR/Cas9重组慢病毒和腺相关病毒建立稳定敲除CCR5基因的 细胞系。
[0151] 用上述中包装的慢病毒和腺相关病毒以m.o.i.为100(lml病毒上清加到含4ml DMEM细胞中）感染TZM-bl细胞，72小时后流式检测CCR5阳性细胞比率，流式检测APC-CCR5阳 性细胞比率，以检测改造后的效率(参见图4)。
[0152] 【实施例5】检测CRISPR/SaCas9重组慢病毒载体和腺相关病毒载体改造后的细胞 系TZM-bl对HIV-1感染的抑制水平检测。
[0153] 申请人利用pYU2质粒在HEK-293T细胞中包装成HIV-1型病毒。
[0154] I、转染前24小时铺HEK-293T细胞(购自CCTCC)于一个直径10cm的细胞培养皿中；
[0155] II、待细胞密度达到80~90%时，以PEI转染试剂操作将上述质粒转染细胞6~8小 时后换液。
[0156]转染体系：
[0157]
[0158] 在500μ1 Opti-MEM中加入质粒DNA，同样用500μ1 Opti-MEM稀释PEIreagent，将稀 释后的DNA按1:1的比例加入到转染试剂中，混匀静止放置20min后，加入到培养皿里，培养7 小时后换液。
[0159]转染后72小时收集病毒上清（即细胞培养基)过滤分装，_80°C保存备用。
[0160] ①病毒滴度检测：将病毒上清以10倍梯度稀释，利用病毒计数仪进行病毒滴度的 初步测定。用滴度测定的病毒感染Ghost CD4/CXCR4细胞，48小时之后流式检测GFP阳性细 胞比率，并以比率在0.1-10%之间的稀释度进一步精确计算出病毒滴度。
[0161] ②用上述包装的HIV-1病毒以m.〇. i .为0.1感染TZM-bl细胞和改造成功的TZMBI细 胞系，分别利用单荧光素酶报告基因检测HIV病毒的入侵、转录以及基因组复制水平(参见 图5)，和野生型TZM-bl细胞(con)相比，慢病毒载体的2、6、8、11号和腺相关病毒载体的8、11 号改造的TZM-bl细胞系中HIV的复制水平显著降低。这说明该发明方法能够成功地改造细 胞，可用于改造包括造血干细胞、胚胎干细胞等以阻止HIV入侵，对艾滋病进行临床基因治 疗。
【主权项】
1. 在CRISPR/SaCas9特异性敲除人CCR5基因中用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA，其特 征在于：所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列符合5'-G(21N)NNGRRT-3'或者5'-ARRCNN(21N) C-3 '的序列排列规则，下划线代表PAM，21N代表靶位点的21个碱基序列，其对应的DNA序列 如SEQ ID NO. 1-4任意一条序列所示，其中SEQ ID NO. 1-3在人与恒河猴的基因位点上保 守。2. 含有CRISPR/SaCas9系统的靶向敲除人CCR5基因的慢病毒载体，其特征在于： ① 所述靶向敲除载体是将Addgene公司PX601载体上的SaCas9基因通过PCR扩增后转移 到lentiCRISPR-V2载体上，取代原来的SpCas9;将PX601载体上的SaCas9对应的crRNA通过 重叠 PCR扩增后转移到lentiCRISPR-V2载体上，取代原来的SpCas9对应的crRNA; ② 此载体含有一个人的U6启动子，该启动子控制着sgRNA的表达，用BsmBI核酸内切酶 对此载体进行消化，然后再插入含有突出粘性末端和长为21bp的靶序列sgRNA片段； ③ 在酶切位点BsmBI后有长为81bp的crRNA核酸序列为sgRNA的骨架序列； ④ crRNA核酸序列后的EFS的启动子控制人类编码最优的SaCas9的表达； ⑤ 含有自切割多肽P2A和带有筛选标记的基因 Puromycin的编码序列。3. 根据权利要求2所述的含有CRISPR/SaCas9系统的靶向敲除人CCR5基因的慢病毒载 体，其特征在于:所述的慢病毒载体的序列如SEQ ID NO. 15-18任意一项所示。4. 含有权利要求3所述靶向敲除人CCR5基因的慢病毒载体的慢病毒。5. 含有CRISPR/SaCas9系统的靶向敲除人CCR5基因的腺相关病毒载体，其特征在于： ① 选择的腺相关病毒载体为Addgene公司PX601; ② 此载体含有一个U6启动子，控制着sgRNA的表达，用Bsal核酸内切酶切割载体后，插 入含有突出粘性末端和长为21bp的靶序列sgRNA片段，靶序列如SEQ ID NO. 1-4任意一项所 示； ③ 含有一个TBG启动子来调控SaCas9的表达。6. 含有权利要求5所述靶向敲除人CCR5基因的腺相关病毒载体的腺相关病毒。7. 权利要求1所述的在CRISPR/SaCas9特异性敲除人CCR5基因中用于特异性靶向CCR5 基因的sgRNA在非诊疗目的的敲除人或恒河猴CCR5基因中的应用。8. 权利要求2或3所述的含有CRISPR/SaCas9系统的靶向敲除人CCR5基因的慢病毒载体 在非诊疗目的的敲除人或恒河猴CCR5基因中的应用。9. 权利要求5所述的含有CRISPR/SaCas9系统的靶向敲除人CCR5基因的腺相关病毒载 体在非诊疗目的的敲除人或恒河猴CCR5基因中的应用。10. 权利要求2或3所述的含有CRISPR/SaCas9系统的靶向敲除人CCR5基因的慢病毒载 体在制备抗艾滋病药物中的应用。11. 权利要求5所述的含有CRISPR/SaCas9系统的靶向敲除人CCR5基因的腺相关病毒载 体在制备抗艾滋病药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及CRISPR/SaCas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA。本发明提供了CRISPR/SaCas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA以及涉及到的CRISPR/SaCas9重组慢病毒和腺相关病毒载体系统和应用。本发明所提供的CRISPR/SaCas9重组慢病毒载体和腺相关病毒载体能够表达针对于人和恒河猴同一基因的CCR5靶点的SaCas9-RNA，使得应用范围更广，效率更高。该制备方法构建简单，靶向效率高，为HIV的基因治疗提供了一种新型的技术。
【IPC分类】C12N15/867, C12N15/113, A61P31/18, C12N15/864, A61K48/00
【公开号】CN105567688
【申请号】CN201610056141
【发明人】郭德银, 陈述亮, 肖巧巧, 刘哲鹏
【申请人】武汉大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月27日