专利名称：胃泌素在抑制胃肠肿瘤细胞中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、细胞生物学、药理学领域，更具体地说，涉及胃泌素的新 用途。
背景技术：
胃癌是在每年的新发病例中所有恶性肿瘤中排在第四位，而在所有因肿瘤导致死 亡原因中排第二位，大约每年有1000000胃癌病例并且每年超过850000死亡，而且胃癌的 早期诊断困难，5年生存率只有20%。关于胃癌的发生机制近年来取得了多方面的进展，包 括幽门螺杆菌感染、环境因素、基因突变等。胃泌素是一种多肽激素，主要由胃肠道G细胞 分泌，与胃泌素受体特异性结合，大量研究表明，胃泌素不仅具有刺激胃酸分泌和对胃肠粘 膜的营养作用，胃泌素还影响胃肠肿瘤的生长，胃泌素一直被认为是诱发肿瘤的重要因素。所有的药物几乎都有双重性(既治病也致病，关键在浓度)。以前的研究发现胃泌 素有促进肿瘤细胞增殖的作用，但忽视了实验中使用的10_7mol/L几乎是生理情况下胃泌 素浓度的1000倍，不能客观反映其生理作用，且初期的诱导作用并不一定表示在延长作用 时间时作用效果不发生改变。另外胃体癌时由于胃泌素的靶细胞(泌酸细胞)被破坏，胃 酸分泌减少，机体反馈性大量分泌胃泌素(目前认为的最重要的胃酸调节因子)，大大超出 生理浓度，因此具有诱发肿瘤的作用。但在胃窦癌时，分泌胃泌素的G细胞被破坏，胃泌素 低于生理水平，其抑制胃窦癌组织中AE1和pl6的功能大大削弱，促进胃窦癌发生和进展。本实验室的中国发明专利申请阴离子交换蛋白1及其基因作为靶标在制备治疗 消化道肿瘤药物中的应用(专利号2006100249109，公开号CN1861190)公开了阴离子交 换蛋白1与肿瘤抑制蛋白P16相互作用。通过实验，发现在正常情况下只表达在红细胞膜 的阴离子交换蛋白1 (AnionExchanger 1，AE1)在胃癌出现高频率表达，AE1通过与pl6直 接相互作用扣押后者于细胞浆，使之不能入核，诱发肿瘤，同时P16在胃癌时高表达于细胞 浆，进一步研究发现在胃窦癌AE1和pl6的表达明显高于胃底或胃体癌，并与胃癌的进展、 浸润和低生存期显著相关。本实验室进一步研究发现，基础和临床的研究结果证实了这种表达与胃泌素的水 平相关胃泌素显著下调胃癌细胞P16的表达，胞浆内pl6减少使AE1蛋白稳定性下降而降 解。最新的研究发现，胃窦癌发生时，由于G细胞破坏，血浆胃泌素水平下降，而胃泌素的减 少导致两种重要的胃癌标志性分子——AE1和pl6异常表达，诱发胃癌发生。目前在市场上有五肽胃泌素注射液和片剂，主要的药物作用为促进胃酸、胃蛋白 酶及内因子的分泌，其促胃酸分泌作用相当于内源性胃泌素的1/4，可持续10 40分钟。 主要的适应症为胃酸分泌机能的检查，用法是皮下注射或肌内注射，一次6 u g/Kg，或按此 量在1小时内静脉滴注。目前临床上还没有直接利用胃泌素抑制肿瘤细胞的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供胃泌素(H-pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu
3-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2)在抑制胃肠肿瘤细胞中的应用，其特征在于，胃泌素 抑制胃癌标志分子阴离子交换蛋白1和P16的表达。本发明的第二个目的提供胃泌素抑制胃肠肿瘤细胞的浓度10-10mol/L l(T7mol/L。本发明的第三个目的提供胃泌素抑制胃肠肿瘤细胞的优选方案浓度为lO.mol/ L时，作用时间为10天以上。本发明的第四个目的提供胃泌素抑制胃肠肿瘤细胞的另一个优选方案胃泌素的 浓度为10_7mol/L时，作用时间为7天以上。本发明是基于发现胃癌靶基因阴离子交换蛋白1与肿瘤抑制蛋白P16相互作用， 诱发胃癌的基础上，进一步发现一定浓度范围的胃泌素抑制胃癌标志分子AE1和pl6的表 达，提示可应用于抑制胃肠肿瘤细胞中，而传统理论认为胃泌素诱导肿瘤细胞增殖，提示可 通过调整胃泌素的浓度和作用时间，来寻找抑制肿瘤细胞增殖的胃泌素最佳剂量。为实现上述目的，本发明公开以下技术方案1、胃泌素对胃癌细胞AE1和pl6表达 的影响首先，用不同浓度的胃泌素处理胃癌细胞SGC7901，其次western-blot蛋白印迹技 术对AE1和pl6的表达的检测，再次RT-PCR技术对AE1和pl6的表达的检测，通过以上实 验得出胃泌素抑制胃癌细胞系AE1和pl6的表达；2、临床病理分析胃泌素与AE1和pl6表 达的相关性；3、通过MTT实验显示胃泌素对胃癌细胞活力具有抑制作用。研究结果对探索新的胃窦癌治疗方法具有重要的指导意义，胃泌素可能成为潜在 的临床应用药物。本发明具有以下有益效果胃泌素能够有效地抑制胃癌靶基因AE1和pl6的表达，打破了传统研究中胃泌素 诱发肿瘤的观念，临床病理显示胃泌素与AE1和pl6的表达具有显著的负相关性，并且通 过细胞活力检测证实胃泌素对胃癌细胞活力有抑制作用，提示胃泌素对胃窦癌具有治疗作 用，实验结果为胃癌的治疗提供新的方向。
下面结合说明书附图，对本发明进一步详细说明。图1为胃泌素降低pl6的表达具有剂量和时间依赖性。A，western-blot分析不 同浓度的胃泌素对P16的表达的影响；B，10-7mol/L的胃泌素及胃泌素受体拮抗剂丙谷胺 对P16的表达的影响；C，RT-PCR分析胃泌素对pl6mRNA表达的影响；D，胃泌素对外源性 pl6(pEGFP-pl6)表达的影响；图2为胃泌素降低AE1的表达具有剂量和时间依赖性。A，10_7mol/L的胃泌素对 AE1的表达的影响；B，RT-PCR分析lCTmol/L的胃泌素对pl6mRNA表达的影响；C，不同浓度 的胃泌素及胃泌素受体拮抗剂丙谷胺对AE1的表达的影响。图3为胃泌素和pl6在早晚期胃癌的表达频率。A，胃泌素在早期胃窦癌的表达频 率明显高于晚期胃窦癌，说明患者血清中胃泌素水平随着胃窦癌的进展而减少(胃泌素正 常情况下从胃窦G细胞分泌)；B，pl6在胃窦以外部位的胃癌表达随着肿瘤的进展显著减 少，而在胃窦癌的表达始终维持在高水平，说明在胃窦以外部位的胃癌发生时由于泌酸腺 体的破坏而胃酸减少，胃泌素反馈性分泌增加，抑制了 P16的表达，而在胃窦癌，胃酸由于胃泌素的减少而减少，但pl6却由于胃泌素的减少而维持在高水平；图4为AE1的表达与胃窦癌的浸润深度显著相关；图5为AE1的表达与胃窦癌患者的术后生存时间显著负相关；图6为胃泌素对胃癌7901细胞活力的影响，A为胃泌素浓度10_7mol/L时，加 药后第7、10天，实验组细胞活力明显下降，有显著性差异(*p<0.05) ；B为胃泌素浓度 10_10mOl/L时，加药后第10、15天，实验组细胞活力明显下降，有显著性差异(*p < 0. 05)。
具体实施例方式实施例一、胃泌素抑制胃癌细胞系AE1和pl6的表达1、不同浓度的胃泌素处理胃癌细胞』SGC7901。SGC7901细胞(本发明的所涉胃癌细胞均取自中国科学院上海生命科学院)在含 10%胎牛血清(Gibco BRL,Gaithersburg,ML)的 DMEM 培养基(Gibco BRL,Gaithersburg, ML)在含有5% C02-95 % 02的培养箱中37°C培养。分别取0. 0001，0. 01，0. 1禾口 lyM的胃 泌素作用SGC7901细胞72小时及0. 1 ii M的胃泌素作用SGC7901细胞6h、8h、12h、24h。2、AE1和d16的表汰的检测western-blot蛋白印迹技术1)收集细胞；2)用冷PBS洗两次，尽量弃去残余的PBS ；3)用适量体积预冷普通裂解液(SDS)(蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitor cocktail))重悬细胞，95°C -100°C煮5分钟，冰上置5分钟，重复两次，充分裂解细胞；4)将细胞裂解液4°C，12000g离心10分钟，上清液为抽取的总蛋白；5)蛋白定量后，将同等总蛋白量的不同处理样品进行10%-12% SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳；6)电泳后转移蛋白到 PVDF 膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)；7)转好后的PVDF膜先用TBS(TriS-buffered saline)配制的5%脱脂奶粉室温 封闭1小时；8)然后与抗AE1的单克隆抗体抗体(Sigma，St. Louis, M0)和抗pl6的多克隆抗 体抗体(Santa Cruz Biotechnology) 4°C孵育过夜；9)用辣根过氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的二抗室温孵育1小 时；10)最后用 chemiluminescence phototope-HRP kit (Cell Signaling, Beverly, MA)检测蛋白表达变化。3、AE1和pl6的表达的检测RT_PCR技术。1)总RNA的提取a)0. liiM 的胃泌素作用 SGC7901 细胞 6h、8h、12h、24h 后，收集 5-10 X 106 细胞，用 lmL Trizol重悬细胞并反复吹打细胞以充分裂解；b)室温放置5分钟以充分裂解核蛋白复合体；c)按照每lmL Trizol加入0. 2mL氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置2-3分钟；d) 12000g，4°C离心 15 分钟；e)小心转移上层水相至另一离心管中，每lmL Trizol加入0. 5mL异丙醇，充分缓
5慢混勻溶液后，室温放置10分钟沉淀RNA，12000g，4°C离心10分钟；f)弃尽上清，每lmL Trizol加入lmL 75%乙醇，洗涤RNA沉淀。用涡旋振荡器短 暂震荡数秒后，7500g，4°C离心5分钟；g)干燥RNA沉淀，加入适量DEPC水溶解，_80°C保存备用。2) RT-PCR总RNA 利用 RT-PCR 试剂盒(TaKara，Dalian, China)反转录成 cDNA。20ii L 反应体系包括2ii L 10XRT buffer,41 u L Mgcl,2u L dNTP,0. 5u L RNase Inhibitor,1u L AMV Reverse Transcriptase,1u L Random 9mers,2 u g RNA, RNase Free双蒸水补足20 ii L。反映程序按照30°C 10分钟，50°C 30分钟，99°C 5分钟，5°C 5分钟。AE1 的 弓丨 物上游 5，-ACCACATCACACCCGGGTA-3，，下游 5，-ACCAACGTGGCCTCTGAATC-3，，301 ii L 反应体系包括3 ii L 10XK0D buffer, 1. 2u L MgS04,3u L dNTP，0. 5ii L 正向引物(10 ii M)，0. 5 ii L 反向引物(10uM),2uL AElcDNA 模 板，1 ii L KODase, 18. 8 u L 双蒸水补足 30 u L。pl6 的上游引物 5，-CCCCCACTACCGTAAATGTCCAT-3，，下游引物 5，-CTGCCATTTGCTAG CAGTGTGACT-3’PCR301 u L反应体系包括:3u L lOXKODbuffer, 1. 2u L MgS04,3u L dNTP, 0.5iiL 正向引物(10iiM)，0.5iiL 反向引物(10iiM)，2iiL pl6 cDNA 模板，1 y L KODase, 18. 8ii L双蒸水补足30u L0AE1的反应程序按照95°C 5分钟；重复如下循环30次94°C 30秒，58°C 45秒， 72°C 1分钟；最后72°C 10分钟。pl6的反应程序按照95°C 5分钟；重复如下循环30次94°C 30秒，56°C 45秒， 72 °C 30秒；最后72 °C 7分钟。结论通过western blot和RT-PCR结果表明在l(rlclmol/L l(T6mol/L浓度范围 内，胃泌素能够抑制AE1和pl6的表达，尤其在10_7mol/L时效果最佳，表明在胃窦癌适当提 高胃泌素的水平能够抑制胃癌重要的靶分子AE1和pl6，见图1和图2。实施例二、胃泌素与AE1和pl6表达的相关性1、取胃癌组织标本(取自上海交通大学附属瑞金医院和仁济医院)4%多聚甲酵 固定，石蜡包埋切片；2、切片常规脱錯；3、胃泌素与AE1和pl6的表达的检测免疫组化1)蒸馏水洗3min/2次；2)为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟； 3) PBS 缓冲液洗 5min/2 次；4)滴加一抗抗胃泌素多克隆抗体(MAIXIN-Bio，Fuzhou, China)，抗AE1单克隆 抗体(Sigma，St. Louis, M0, USA)和抗 pl6 多克隆抗体(SantaCruz Biotechnology)，工作 液37°C孵育1-2小时；5) PBS 缓冲液洗 5min/2 次；6)滴力口 HRP Polymer (酶标二抗 Santa Cruz Biotechnology)，在室温下孵育 30分钟；7)缓冲液洗5min/2次；8)向 lml DAB Plus Substrate 中滴力口 1—2 滴 DAB Plus Chromogen，混勾后滴力口 到切片上，孵育3-15分钟；9)自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。结论随着胃癌的进展胃泌素的表达明显降低，相反，pl6的表达在晚期增加，与 胃泌素的表达明显的相关，见图3。晚期胃癌的病人，AE1的表达明显增加，而且AE1与胃癌 的浸润和淋巴转移相关，见图4和图5。实施例三、MTT实验检测胃泌素对胃癌细胞活力的抑制作用1、MTT实验方法取等量对数期SGC7901细胞种于两个60mm培养皿中(对照组和实验组各一皿)， 细胞接种密度约10%。12小时后细胞贴壁，对照组和实验组细胞换液一次，实验组换液时 加药(胃泌素浓度0. lumol/L或0. lnmol/L)，标记为第0天。对照组和实验组每天同一时 间以同样的方法处理细胞。第四天，对照组和实验组细胞密度达到约80% (未堆积)时予 以传代，用lmlO. 25 %胰酶消化，1. 5ml培养液吹成单细胞悬液，对照组和实验组细胞各取 100ul种于新皿(此时细胞接种密度约10% )，继续用原方法处理对照组和实验组细胞。第 六天换液12小时后，对照组和实验组细胞密度约50%，lmlO. 25%胰酶消化细胞，1. 5ml培 养液吹成单细胞悬液，取30uL细胞悬液接种于96孔板各孔中。对照组和实验组各平行接 种6个孔。12小时后预处理细胞，测量MTT，标记为第7天。第10天和第15天方法同上。弃96孔板中的细胞培养液，用100ul IX PBS每孔洗两遍，每孔加入无血清无抗生 素的80ul DMEM和20ul 2. 5mg/ml MTT。5% C02、37°C培养箱孵育96孔板4小时，弃去混 合液，加入100ul DMS0,水平摇床200rpm室温孵育10分钟，酶标仪490nm测量0D值。2、实验结果如图6，A为0. luM(10_7mol/L)胃泌素对胃癌7901细胞活力的影响。横坐标为药 物作用天数，纵坐标为加药组细胞与对照组细胞活力的比值，以每一个时间点的对照组细 胞活力为1，计算加药组细胞相对于对照组细胞的活力。结果显示，胃泌素作用的初期确实 有促进胃癌细胞活力的作用，但我们的实验并没有止于此。本实验室在基于前期的发现胃 癌靶基因阴离子交换蛋白1与肿瘤抑制蛋白P16相互作用，诱发胃癌的基础上，又进一步发 现一定浓度范围的胃泌素抑制胃癌标志分子AE1和pl6的表达，所以延长作用时间，继续观 察。持续加药到第5天，果然出现对胃癌细胞活力的抑制作用，加药后第7、10天，实验组细 胞活力明显下降，有显著性差异(*P < 0. 05)。同样地，图6中B为0. lnMdO.mol/L，相当于生理浓度)胃泌素对胃癌7901细胞 活力的影响，加药后第10、15天，实验组细胞活力明显下降，有显著性差异(*p < 0.05)。结论胃泌素作用初期，对胃癌细胞活力有促进作用；但延长作用时间，显示胃泌 素显著抑制胃癌细胞活力。胃泌素的浓度为lO.mol/L时，作用时间10天以后，加药组细 胞活力明显下降；胃泌素的浓度为10_7mol/L时，作用时间7天以后，加药组细胞活力明显下 降。进一步得出，在浓度范围为lO-^lCTmol/L时，胃泌素有抑制细胞活力的作用，如果高 于10_7mol/L，胃泌素可能主要呈现诱导胃癌肿瘤细胞，如果低于10_1(lmOl/L，浓度太低没有 生物学意义。
权利要求
胃泌素在抑制胃肠肿瘤细胞中的应用，其特征在于，胃泌素抑制胃癌细胞阴离子交换蛋白1和p16的表达。
2.根据权利要求1所述的胃泌素在抑制胃肠肿瘤细胞中的应用，其特征在于，胃泌素 浓度为 I(T1V)I/L l(T7mol/L。
3.根据权利要求1所述的胃泌素在抑制胃肠肿瘤细胞中的应用，其特征在于，胃泌素 的浓度为I(T1V)VL时，作用时间为10天以上。
4.根据权利要求1所述的胃泌素在抑制胃肠肿瘤细胞中的应用，其特征在于，胃泌素 的浓度为liTmol/L时，作用时间为7天以上。
全文摘要
本发明公开了胃泌素在抑制胃肠肿瘤细胞中的新的应用。胃癌靶基因阴离子交换蛋白1与肿瘤抑制蛋白p16相互作用，诱发胃癌，而17肽胃泌素(H-pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2)能够有效地抑制胃癌靶基因AE1和p16的表达，打破了胃泌素诱发肿瘤的传统观念，临床病理显示胃泌素与AE1和p16的表达具有显著的负相关性。本发明公开了胃泌素浓度为10-10mol/L～10-7mol/L时，一定时间之后对胃癌细胞活力有显著抑制作用，提示胃泌素对胃窦癌具有治疗作用，实验结果为胃癌的治疗提供新的方向。
文档编号A61P35/00GK101890157SQ20091005182
公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者傅国辉 申请人:上海交通大学医学院