将用于下一步的质粒提取、酶切及测序。大于500bp的片段可能 是由载体自连造成的。
[0023] 图2是由阳性克隆提取的质粒DNA用EcoR I酶切后得到的产物的1. 5%琼脂糖凝 胶电泳图。图中从左到右的泳道依次为Marker和12个不同质粒酶切后的产物。Marker的 分子大小由上到下依次是 5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 100bp。 酶切实验结果与理论上得到126bp和3004bp两条片段相符，进一步证明所选白色菌落为阳 性菌落。
[0024] 图3为本发明DNA核酸适体与其靶物质或干扰蛋白质结合前后的电化学发光强 度一电压曲线，及反映结合前后电化学发光强度变化的柱方图。其中A，B展示了草酸体系 (5mM，pH= 5.5)中 DNA 核酸适体 Aptamer-18(liiM)与[Ru(bpy)2dppz]2+(20tiM)结合后的 ECL。-电压曲线（a)，及其进一步与60 y g ml/1的（A)Pro-GRP 31_98或⑶干扰蛋白质BSA结 合后的ECL「电压曲线（b)。曲线c为草酸溶液中只存在[R U(bpy)2dppz]2+时的电化学发 光强度一电压曲线。可以看出，Aptamer-18结合Pro-GRP^iJg ECL值明显降低（降低了 47% )，而与干扰蛋白质BSA孵育后ECL值没有明显改变。C为Aptamer-18，Aptamer-W 和Aptamer-18"在[Ru(bpy) 2dppz]2+存在下与60yg rnL"不同蛋白质（或多肽）结合前后 ECL峰值的相对变化值：（ECU-ECI^/ECL。的柱方图。结果显示，Aptamer-18，Aptamer-lV 和Aptamer-18〃三条DNA核酸适体与Pr〇-GRP 31_98结合后，其与[Ru (bpy) 2dppz]2+结合而产 生的ECL信号明显降低，降低比例分别为47%，44%和81% ;而与所检测干扰蛋白质（或 多肽）孵育后ECL信号或没有明显变化，或变化值大大小于与Pr〇-GRP31_ 98结合的ECL信 号变化值。该结果说明这三条DNA序列均是针对Pr〇-GRP31_ 98的高特异性DNA适体，能与 Pr〇-GRP31_98特异性结合，与所检测干扰蛋白质（或多肽）没有明显的结合。
[0025] 图 4 为草酸体系（5mM, pH = 5. 5)中 DNA 核酸适体 Aptamer-18 (1 y M)与 [Ru(bpy)2dppz]2+(20iiM)结合后，在梯度批量加入不同浓度的Pr〇-GRP 3H8时，Pr〇-GRP3h98 的浓度（C)的倒数1/C ( y M_〇与ECL变化值的倒数1/ A ECL的线性回归关系曲线：1/ A ECL =2. 3X 10_3/C+3. 7X 10_4。由该直线得出 Aptamer-18 与 Pr〇-GRP31_982间的解离常数 KA 6. 2 yM。采用同样的方法，得出Aptamer-18 ^和Aptamer-18"与Pr〇-GRP31_98之间的解离 常数分别为8. 6和8. 1 yM。该结果说明Aptamer-18、Aptamer-18 ^和Aptamer-18"均可 以与？1~〇-61^31_98高亲和力结合。
[0026] 图 5 为米用 Integrated DNA Technologies 公司 OligoAnalyzer 3. 1 在线工具 对 Aptamer-18，Aptamer-18 '和 Aptamer-18"模拟的二级结构。Aptamer-18 '是本发明 对Aptamer-18序列在不改变二级结构的条件下减少核苷酸数目得到的序列。Aptamer-18， Aptamer-18^均含有两个小的、主要以G-C配对形成的颈环结构。Aptamer-18"含有四个 小的主要以G-C配对形成的颈环结构。Aptamer-18，Aptamer_18 '和Aptamer-18"均含有 由5' -CCAGATAGTCCCTGG-3'序列形成的具有4个碱基对颈的颈环结构（如图5中箭头指示 的圆圈区域），推测其为与Pr〇-GRP 31_98结合的主要结合位点，其应为Pro-GRP 31_98的DNA核 酸适体序列。
[0027] 图 6 为草酸体系（5mM, pH = 5. 5)中 Aptamer-18 (1 y M)在 [Ru(bpy)2dppz]2+(20 yM)存在下对（a)0,（b)0. 48,（c) 1. 44,（d) 1. 92,（e)2. 40,（f)2. 88 和 (g) 3. 36 y M Pr〇-GRP^_98响应的ECL信号-电压曲线。插图为加入Pro-GRP 3卜98后ECL峰信 号强度的变化值（A ECL)与对应Pr〇-GRP31_98&度的关系曲线。采用该ECL法对Pro-GRP 31_98 的最低检测极限达到了 IX 1(T8M(信噪比=3)。在所测的Pr〇-GRP31_98&度范围（0. 48 yM- 3. 36 yM)内，ECL峰信号的变化值与Pr〇-GRP31_98的浓度成线性正相关，线性相关系数为 0.9969。
【具体实施方式】
[0028] 为对本发明进行更好的说明，对磁珠上偶联蛋白及上述SELEX筛选过程的具体操 作步骤及方法描述如下：
[0029] 实施例：
[0030] (1)为了在羧基修饰的微米磁珠上偶联蛋白，首先对磁珠上的羧基用1-乙 基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS)进 行活化；活化后的磁珠用〇. 01M MES缓冲液（2. 13g/L吗啉-乙磺酸*H20,0. 31g/L硼酸，pH =9. 0)洗涤后，与需要偶联的蛋白质或多肽在MES(0. 01M，pH = 9. 0)溶液中在分子杂交仪 上30°C振荡反应过夜。反应结束后，磁珠经磁回收，然后重悬于0.05M磷酸盐缓冲液（PBS) (pH = 7. 4)中，形成lmg/mL的磁珠溶液。
[0031] (2) SELEX筛选过程中DNA孵育及PCR扩增的操作步骤：
[0032] 首先取30 y L浓度为lmg/mL的Pr〇-GRP31_98包被磁珠，用Binding Buffer充分 洗涤，然后将其重悬于300 yL Binding Buffer中备用。将溶解于Binding Buffer中 的ssDNA文库分装到四个500 y L的离心管中，95°C热变性lOmin后立即置于冰浴中冷 却lOmin。然后将经过变性处理的ssDNA立即加入到上述靶蛋白磁珠溶液中，在分子杂交 仪上37°C振荡孵育2h。最后，用强磁力收集并用无菌水洗涤磁珠，以该磁珠作为PCR的 模板，分装到10个25yL PCR管中，每管中加入lyL浓度为10yM的正向引物F-FAM: 5' -FAM-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-3'，1 y L 浓度为 10 y M 的反向引物 R-Biotin :5' -Biotin-AGTGTCCGCCTATCTCGTCTCC-3'，2 y L 浓度为 2. 5mM 的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP)，0. 25 y L TransTaq-T DNA 聚合酶（5units/yL)，2. 5 yL 10XTransTaq-T Buffer，18.25 yL 高纯水， 进行PCR扩增。PCR扩增反应条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C 延伸30s，扩增15-30轮，最后72°C再延伸10min。磁分离收集PCR扩增产物（即上清液）， 以进行DNA单链分离。
[0033] (3) SELEX筛选过程中DNA单链分离的操作步骤：
[0034] PCR扩增产物为双链DNA，然后采用链霉亲和素包被磁珠法将其分离生成ssDNA : 将2mL lmg/mL的链霉亲和素包被磁珠溶液经TE-NaCl溶液（10mM Tris-HCl，lmM EDTA， 2M NaCl，pH = 8. 0)充分洗涤后，溶于200 y L TE-NaCl溶液中，然后在该溶液中加入PCR 扩增后的上清液，孵育30min ;孵育结束后，将磁珠用强磁性分离并洗涤，然后在磁珠中加 入100 y L的0? 15M NaOH溶液，孵育10min ;然后在磁分离得到的上清液中加入50 y L左右 的0. 3M HC1，中和反应体系中的NaOH，最后加入50yL Binding Buffer，涡旋混勾，得到约 200 y L的ssDNA溶液，作为下一轮筛选的ssDNA文库。
[0035] 应用例：
[0036] 本发明得到了三条能与？1~〇-61^31_98高亲和力、高特异性结合的DNA核酸适体， 并将本发明得到的DNA核酸适体成功应用于在草酸体系中以及[Ru (bpy) 2dppz]2+存在下 对卩1'〇-61^:>31_ 98进行灵敏、特异的 ECL 检测。Primer-18Aptamer_18 '和 Aptamer-18"对 Pr〇-GRP31_98的最低检测极限均达到了 10_8M。在所测的Pr〇-GRP31_9^度范围（0.48yM- 3. 36yM)内，ECL峰信号的变化值（AECL)与Pr〇-GRP31_98的浓度成线性正相关，线性相关 系数为0.9969。
[0037] 本发明所述的胃泌素释放肽前体，其概念等同于胃泌素释放前体肽。
【主权项】
1. 胃泌素释放肽前体Pro-GRP 31-98 a. a.多肽片段的DNA核酸适体，其特征在于，其 DNA序列为NOl。
2. 胃泌素释放肽前体Pro-GRP 31-98 a. a.多肽片段的DNA核酸适体，其特征在于，其 DNA序列为N02。
3. 胃泌素释放肽前体Pro-GRP 31-98 a. a.多肽片段的DNA核酸适体，其特征在于，其 DNA序列为N03。
4. 如权利要求1一 3其中之一所述的DNA核酸适体，其特征在于，序列长度为10 nt到 150 nt〇
5. 胃泌素释放肽前体Pro-GRP 31-98 a. a.多肽片段的DNA核酸适体，其特征在于，含 有如下DNA序列： ccagatagtc cctgg〇
【专利摘要】本发明公开了小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体多肽片段Pro-GRP31-98的DNA核酸适体序列，涉及化学生物学技术领域。该DNA核酸适体序列是通过基于亲和磁珠分离法的SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，通过指数富集对配体的系统进化）筛选方法，从单链DNA文库中筛选出来；然后对筛选出的DNA适体文库经PCR扩增后，以大肠杆菌为受体细胞通过基因克隆技术对DNA适体文库中的DNA核酸适体进行分离；最后通过测序技术对各条DNA核酸适体进行测序得到的。结合实验结果表明：本发明得到的DNA核酸适体序列与胃泌素释放肽前体片段高亲和度高特异性结合。
【IPC分类】C12N15-115
【公开号】CN104845975
【申请号】CN201510287204
【发明人】崔惠芳, 李亚军, 王佳, 栗晓佳
【申请人】郑州大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月29日