副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因siRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及副干酪乳杆菌基因的siRNA分子。
【背景技术】
[0002] 近年来研宄中研宄人员发现在某些G+菌QS体系中的AIP不仅仅是信号分子，它 还具有抗菌能力，如乳酸乳球菌的nisin，植物乳杆菌的植物乳杆菌素等等。这些抗菌肽 (antimicrobial peptide，AMP)的基因簇中除了含有ABC转运体编码基因外，还有一个辅 助蛋白（accessory protein，AP)编码基因，它们的产物组成了 AMP输出和处理体系。AMP 的结构基因都位于其相应的免疫蛋白基因之前，产生的AMP大多数富含半胱氨酸，具有疏 水性，而且，经研宄发现，AMP的最大生产量与产生菌的非最佳生长条件有关。
[0003] 根据AMP的性质不同，可将AMP分为两大类：一类是I型AMPs或硫醚抗生素，它 们是一些对热稳定的肽类，在被分泌之前会被进行高度的翻译后修饰，如nisin、枯草菌素； 另一类是II型AMPs或热稳定的AMPs，它们具有特征性的双甘氨酸基序，分泌之前不存在 修饰过程，但在分泌后，前体肽的N端会有一个片段被移去，如植物乳杆菌素、乳酸杆菌素P 等。
[0004] 副干酷乳杆菌（Lactobacillusparacasei)HDl. 7,革兰氏阳性菌，2003年从齐齐 哈尔丰源食品有限公司乳酸酸菜发酵液中分离获得。它最大的特点是在其发酵液中可产生 抑制多种G+、G1P酿酒酵母生长的肽类物质，分子量在10kD左右，热稳定，酸性条件下（pH 2~6)活性高，其性能比目前市面上常用的nisin更为优越，因为nisin能有效的抑制革兰 氏阳性菌如一些腐败菌、致病菌和芽孢菌，而对革兰氏阴性菌起的作用并不大，甚至不起作 用。同时经过研宄还发现，当将高密度菌体发酵液（>l〇 n个/mL)添加到低密度菌体发酵液 (<105个/mL)中时，可促进低密度菌体中这种AMP的生成；发酵24h和48h的菌体发酵液， 其抑菌能力相差较大。以上种种现象说明，该菌产生的这种AMP的产量可能受到菌群密度 影响和控制。
[0005] 国外Nakayama等通过PCR方法克隆到了副干酪乳杆菌拟群体效应相关基因 (prcA、prcK和prcR)，但对于这些基因在群体感应中的具体功能，以及AMP产量是否与群体 感应有关尚不明确。
[0006] 目前，基因功能的研宄方法主要有两种：一种是增强基因表达，然后对获得的表达 产物进行研宄；另一种是减弱或者终止基因表达，通过观察生物整体功能的变化，进而推测 相应的基因功能。由于第一种方法往往不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃。 第二种方法中RNA干扰技术（RNAi)实际上只是在转录后水平上降低基因的表达；其中，基 因敲除技术是构建基因沉默突变株最为常用的方法。但是，构建自杀质粒必须选择出合适 的载体，载体质粒在受体菌中不能复制，载体质粒必须带有一个在整合到染色体内以后可 供选择的抗性标记，载体质粒带有易于克隆的多克隆位点；必须选择出足够长的同源臂，同 源臂越长越有利于同源重组的发生，可降低错误置换的发生率，而且同源臂又必须满足酶 切位点的单一性，在同源臂内部不能包含插入时用到的限制性酶切位点；必须选择出合适 的目标基因，目标基因片段与替换的片段长度相同，且不含插入时用到的限制性酶切位点， 不能引入突变。所以，要同时满足上述所有条件构建自杀质粒的难度非常大；而且，同源臂 的长短依赖目的基因的长短，不利于同源重组的发生。
【发明内容】
[0007] 本发明为了解决构建自杀质粒难度大，同源臂的长短依赖目的基因的长短，不利 于同源重组的发生等问题，而提供的副干酪乳杆菌HD1. 7prcR基因siRNA。
[0008] 本发明第一种副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7prcR 基因 siRNA 的核苷酸序列为5' -AUACCCAACAUUGUUUCGCTT-3' ；第一种副干酪乳杆菌HD 1. 7prcR基因 siRNA的正义链核苷酸序列为5' -GCGAAACAAU⑶UGGGUAUTT-3'。
[0009] 本发明第二种副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7prcR 基因 siRNA 的核苷酸序列为5' -AUGCAGAACGCGAAAUCGCTT-3' ；第二种副干酪乳杆菌HD 1. 7prcR基因 siRNA 的正义链核苷酸序列为 5' -GCGAUUUCGCGUUCUGCAUIT-3'。
[0010] 本发明利用siRNA分子具有独特的双链结构，在协同因子的协同下有效的裂 解靶RNA。本发明的两种siRNA分子都能够高效的阻断副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7prcR基因的表达，从而降低副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei) HD1. 7细菌素的产量。根据测定，siRNA电转化副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei) HD1. 7突变株的生长曲线与原始菌株的生长曲线基本一致，突变株的生长情况与原始菌株 并无显著差异。
[0011] 本发明利用siRNA分子干扰技术构建副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei) HD1. 7prcR基因沉默突变株，对进一步研宄prcR基因对副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei) HD1. 7产细菌素的影响具有重大意义，为之后研宄prcR基因与副干酪乳杆菌拟 群体效应奠定了物质基础。
[0012] 本发明siRNA构建简单，不依赖目的基因的长短，不易发生同源重组。
[0013] 本发明的两种副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7prcR 基因 siRNA 在用量较少的情况下仍能够显著降低prcR基因的表达，具有高效干扰性。
【附图说明】
[0014] 图1是实施例1中荧光标记siRNA(5' -FAM labelled siRNA)分子电转化副干酪 乳杆菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7感受态细胞显微镜观察图。
[0015] 图2是实施例1中荧光标记siRNA(5' -FAM labelled siRNA)分子电转化副干酪 乳杆菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7感受态细胞焚光显微镜观察图。
[0016] 图3是实施例1中荧光定量PCR测定prcR基因相对表达量柱形图。
[0017] 图4是实施例1中不同电转化副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7 突变株及原始副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7发酵上清液对指示菌的抑 制程度柱形图。
【具体实施方式】
[0018] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0019] 一：本实施方式副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei) HD1. 7prcR基因siRNA的反义链核苷酸序列为5' -AUACCCAACAUUGUUUCGCTT-3' ；副干酪乳杆 菌 HD1. 7prcR 基因 siRNA 的正义链核苷酸序列为 5' -GCGAAACAAUGUUGGGUAUIT-3'。
[0020] 本实施方式siRNA命名为siRNA-Rl。
【具体实施方式】 [0021] 二：本实施方式副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei) HD1. 7prcR基因siRNA的反义链核苷酸序列为5' -AUGCAGAACGCGAAAUCGCTT-3' ；副干酪乳杆 菌 HD1. 7prcR 基因 siRNA 的正义链核苷酸序列为 5' -GCGAUUUCGCGUUCUGCAUIT-3'。
[0022] 本实施方式siRNA命名为siRNA-R2。
[0023] 实施例1
[0024] 一、siRNA分子电转化副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)HDl. 7感受态细 胞：
[0025] 取特异性 siRNA 分子（siRNA-Rl 和 siRNA-R2)、非特异性 siRNA 分子（siRNA-RS) 以及荧光标记siRNA分子（5' -FAM labelled siRNA)分别与L. paracasei HD1. 7感受态细 胞混合，在电压值2. 5kv、电阻值200 D、电容值25 y F的条件下电击时间5ms ;其中，siRNA 分子的浓度为〇. 3 y g/ y L，感受态细胞浓度为5X 107CFU/ y L，电转化反应体系总体积为 50 yL。另外，设空白对照组不加siRNA分子，直接取L. paracasei HD1. 7感受态细胞置于 电转化杯中，在电压值2. 5kv、电阻值200 Q、电容值25 y F的条件下电击时间5ms。
[0026] 表1 siRNA分子反义链序列
[0027]
【主权项】
1. 副干酪乳杆菌HDL 7prcR基因siRNA，其特征在于副干酪乳杆菌HDL 7prcR基因 siRNA 的核苷酸序列为 5' -AUACCCAACAUU⑶UUCGCTT-3'。
2. 副干酪乳杆菌HDL 7prcR基因siRNA，其特征在于副干酪乳杆菌HDL 7prcR基因 siRNA 的核苷酸序列为 5' -AUGCAGAACGCGAAAUCGCTT-3'。
【专利摘要】副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因siRNA，它涉及副干酪乳杆菌基因的siRNA分子。它解决构建自杀质粒难度大，同源臂的长短依赖目的基因的长短，不利于同源重组的发生等问题。siRNA-R1核苷酸序列为5'-AUACCCAACAUUGUUUCGCTT-3'。siRNA-R2核苷酸序列为5'-AUGCAGAACGCGAAAUCGCTT-3'。本发明的两种siRNA分子都能够高效的阻断副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因的表达，从而降低副干酪乳杆菌HD1.7细菌素的产量。
【IPC分类】C12N15-113
【公开号】CN104845971
【申请号】CN201510259659
【发明人】葛菁萍, 孙艳阳, 王洋, 高冬妮, 平文祥
【申请人】黑龙江大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月20日