一种利用多聚化合物提高rca扩增效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用多聚化合物提高RCA扩增效率的方法。
【背景技术】
[0002] 核酸扩增技术是一项基本的现代生物技术，广泛应用于生命科学、医疗、农业、环 境监测、法医取证等方面。其应用常常基于核酸的检测、鉴定、定量和序列分析，这就要求核 酸扩增技术具有高的敏感性、特异性和准确性。由于从生物体内获得的样品DNA往往是极 少量的，因此，开发高效率的核酸扩增技术十分关键。
[0003] 1983 年，Mullis 等发明了聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR)技 术，该技术通过若干基本反应的不断循环实现了 DNA扩增，使得DNA的产量以指数形式不断 增加。但是PCR方法仍然有不足之处如：PCR过程需要反复热循环无法摆脱依赖精良仪器 设备的局限；易产生非特异性扩增而导致产生假阳性或假阴性结果；不适用于全基因组扩 增等。
[0004] 与PCR技术相比，目前开发的许多恒温扩增技术具有快速高效，且避免对热循 环仪的需要等优点。这些技术包括依赖核酸序列扩增（nucleic acid sequence based amplification，NASBA)、车专录介导扩增（transcription-mediated amplification，TMA)、 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA)、角军链酶扩增（helicase-dependent amplification, HDA)和滚环扩增（rolling circle amplification，RCA)等。其中，滚环扩增技术作为一 种简单高效的核酸扩增手段，具有反应条件温和、引物设计简单、引物末端易固定和产物分 析手段多样等优点，目前在核酸测序、全基因组扩增、基因诊断、单核苷酸多态性、蛋白质芯 片分析等方面应用广泛。
[0005] 近年来，基于细菌噬菌体Phi29DNA聚合酶和六碱基随机引物的多引物RCA技术生 产的TempliPhi?DNA测序模板扩增试剂盒，可从l-100pgDNA的起始材料，经4-6小时反应 获得3-4 y g高纯度的DNA。该试剂盒可扩增质粒、噬菌体DNA、人工细菌染色体（Bacteria artificial chromosome, BAC)、粘粒等大的环状DNA，对于无法克隆的环状模板，也可用此 法进行体外增殖。而且得到的高质量DNA产物是加入的扩增模板的串联重复拷贝，是高分 子量的线性双链，可直接用于测序、酶切或其他克隆、标记和检测等方面。
[0006] 然而，在实际应用中，现有的RCA技术仍存在一定的不足，如反应速度慢、灵敏度 低等问题。尤其体现在病毒的早期诊断中，由于反应体系中DNA模板复杂或含量很低，大量 引物不能与模板有效配对，使得引物之间易形成二聚体结构，导致错配的产生，从而降低了 RCA的扩增效率。目前，有一种使用单链结合蛋白TthSSB来提高RCA扩增效率方法。但是， 该方法需要先纯化出有活性的TthSSB蛋白，步骤繁琐、费时费力。因此，在本领域中，需要 开发一种简单、快速、高效的提高RCA扩增效率的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题，在于提供一种利用多聚化合物提高RCA扩增效率的方 法。
[0008] 本发明是这样实现的：一种利用多聚化合物提高RCA扩增效率的方法，包括以下 步骤：
[0009] (1)分别配置浓度为0? lg/ml的PEG 3350、0. 2mg/l的mPEG-SC 2000和0? lmg/1 的mPEG-SC 5000三种溶液，备用；
[0010] ⑵使用TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒：
[0011]A.变性：以pUC 19质粒DNA作为模板，在5 y 1样品缓冲液中加入lng pUC 19质 粒DNA，混匀后，95°C加热3min，然后冷却至室温或4°C，获得变性样品液；
[0012] B.培育：在5 y 1反应缓冲液中加入0. 2 y 1 Phi29DNA聚合酶，混匀，置于冰上， 得到预混合酶液；将5 y 1预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到RCA反应液；在各 RCA反应液中分别加入预设体积的PEG 3350溶液、mPEG-SC 2000溶液、mPEG-SC 5000溶液； 各RCA反应液分别于30°C下水浴4-18h ;65°C加热lOmin，冷却至4°C ;分别3 y 1 RCA产物 以1 %琼脂糖凝胶取3 y 1反应混合液于1 %琼脂糖凝胶中进行电泳。
[0013] 进一步地，所述步骤B中，PEG 3350溶液加入量为0.5yl、2yl或4yl。
[0014] 进一步地，所述步骤B中，mPEG-SC 2000溶液加入量为0. 5 y 1、1 y 1或1. 5 y 1。
[0015] 进一步地，所述步骤B中，mPEG-SC 5000溶液加入量为0.5yl、1.5yl或3yl。
[0016] 本发明的优点在于：通过在RCA反应过程中加入一定浓度的PEG或其衍生物，可以 显著地提高滚环扩增的效率，增强滚环扩增的灵敏度，实现了对市售RCA试剂盒的进一步 优化。
【附图说明】
[0017] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0018] 图1是本发明中以pUC 19质粒DNA为模板，PEG 3350对RCA扩增效率影响情况 的电泳示意图。
[0019] 图2是本发明中以pUC 19质粒DNA为模板，mPEG-SC 2000对RCA扩增效率影响 情况的电泳示意图。
[0020] 图3是本发明中以pUC 19质粒DNA为模板，mPEG-SC 5000对RCA扩增效率影响 情况的电泳示意图。
[0021] 图4是本发明中以pUC 19质粒DNA为模板的反应体系添加PEG 3350获得的RCA 扩增产物酶切后的电泳示意图。
[0022] 图5是本发明中以pUC 19质粒DNA为模板的反应体系添加mPEG-SC2000获得的 RCA扩增产物酶切后的电泳示意图。
[0023] 图6是本发明中以pUC 19质粒DNA为模板的反应体系添加mPEG-SC5000获得的 RCA扩增产物酶切后的电泳示意图。
[0024] 图7是本发明中以单克隆（含有重组质粒pUC19-hip)为模板，PEG 3350对RCA扩 增效率影响情况的电泳示意图。
[0025]图8是本发明中以单克隆（含有重组质粒pUC19-hip)为模板，mPEG-SC2000对RCA 扩增效率影响情况的电泳示意图。
[0026] 图9是本发明中以单克隆（含有重组质粒pUC19-hip)为模板，mPEG-SC5000