专利名称：血管生成抑制多肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一类高效抑制血管生成多肽及其制备方法和用于抗肿瘤药物的应用。
背景技术：
肿瘤血管生成抑制剂是近年来在肿瘤治疗中引起重视的一类药物，这方面的研究已经取得一些进展，可望在今后成为一类新的有希望的肿瘤治疗药物。肿瘤新生血管形成的概念是Algureza在1947年提出的，他指出增长的肿瘤的一个重要特征是能够从宿主引发新的毛细血管内皮细胞形成。1971年，Folkman提出假设，认为肿瘤生长和转移依赖于新生血管生成，并认为实体瘤早期可分泌肿瘤血管生成因子，刺激宿主毛细血管增生。新生血管不仅可以提供肿瘤所需要的营养和氧气，排除代谢产物，而且是远处转移的途径(Folkman，J.，J.Natl.Cancer Inst.1990；824-6)。因此，阻断新生血管形成可能成为阻止肿瘤生长和转移的手段，从而激发了对促血管生成分子和抗血管生成分子的广泛研究。在这些血管生成抑制剂中，尤其以血管抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)最引人注目，两者均已在美国进入临床试验，尽管这些血管抑制剂呈现出非常诱人的前景，但其缺陷也非常明显迄今为止的血管生成药物，如内皮抑素、血管抑素等作用靶点不明确，它们对血管的专一性和选择性还不够好，效果有限，导致实验中用量很高，在小鼠动物模型实验时，血管抑素用量达数百毫克/公斤体重，内皮抑素达到数十毫克/公斤体重，当这些血管生成抑制剂在人体内使用时，使用剂量相应也会很高。这样大的药物使用剂量势必增加日后该类药物毒副作用发生的可能性，造成该类药物质量控制难度加大、生产规模和生产成本增大、药物价格居高。
一个好的抗血管生成药物应该有对新生血管的标记分子具有选择性，这样才能达到对新生血管的导向性作用，从整体上提高药物对血管生成的抑制作用做到只使用很低剂量的药物，就能达到高效的抑制血管生成效果。有研究报道(Cattaneo MG，et al.Exper.CellRes.，2003)，内皮抑素的活性主要是由氨基酸序列的第6-49个氨基酸产生，该研究制备了内皮抑素的第6-49个氨基酸序列的多肽，即Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe(I)
并将此多肽I与内皮抑素进行药理试验研究，结果显示，其抑制内皮细胞迁移和体外抑制血管生成活性与内皮抑素相当。临床需要活性更强的该类药物。
发明内容
本发明公开了一种多肽，通过对内皮抑素的第6-49氨基酸进行修饰，修饰后的多肽具有比内皮抑素更强的体内抗肿瘤活性及肿瘤靶向性。
本发明的多肽，其序列为X-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Y其中X的序列为缺失、Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys，Y的序列为缺失、Arg-Gly-Asp、Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys并且X或Y至少一个不缺失。
即在多肽I的羧基端连有Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys 或氨基端连接有Arg-Gly-Asp、Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys，可以X、Y都连接，也可以只连X或只连Y，但不能X和Y都不连，即不能X和Y都缺失。
部分多肽的序列为Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe；Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe；Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp；Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe；Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-PhePhe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-CysPhe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。
Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp。
优选的多肽为Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe(以下简称EDSM-1)或Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys(以下简称EDSM-2)。
本发明的多肽的制备方法如下(1)合成含有X或Y整合素结合序列肽段的血管生成抑制剂基因序列，以此序列为模板，设计上下游引物，在引物序列的5’端和3’端加上适合克隆的酶切位点，PCR扩增，获得基因，将基因克隆于载体中，筛选阳性克隆，核苷酸序列分析鉴定；(2)基因与原核表达载体重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，表达产物以包涵体形式存在；(3)进行包涵体蛋白分离、溶解和复性，并进行离子交换层析分离纯化蛋白产物，收集穿过液，冻干。
本发明通过将抑制血管生成的小肽两端加上不同的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的序列，构建了一种对整合素具有结合作用和亲和性的血管生成抑制剂。
本发明的的多肽可以合成。还可以用基因工程方法制备，应用PCR扩增得到目的基因，克隆于原核表达载体，用基因工程手段获得产物，所得产物与同类产品比较，具有高效、特异性抑制内皮细胞增殖和抗肿瘤效果，并且用量小，相应减少了药物治疗的副作用。
体内抗肿瘤试验中显示本发明的多肽能够大幅度改善和提高现有血管生成抑制剂抑制肿瘤的效果，副作用小，并且用量小，降低了成本，说明本发明设计并制备的高效血管生成抑制剂科学、合理、可行有效，能够作为血管生成抑制剂特别是实体肿瘤的治疗药物。
图1 HPLC纯化EDSM-1分析结果图2 EDSM-1体内抑制肝脏肿瘤效果图3 EDSM-1体内抑制肺癌效果具体实施方式
实施例1EDSM-1基因和EDSM-2的克隆及其原核表达载体的构建取内皮抑素基因为模板；合成上游引物和下游引物，其中上游引物加入了NdeI酶切位点；下游引物含有Arg-Gly-Asp序列和XhoI位点。进行PCR扩增，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后，进行NdeI和XhoI酶切，克隆到原核表达载体PET-23a，PCR筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实序列发生了设计的突变。
合成的引物15’GGAATTCCATATGTTC CAG CCG GTG CTC CAC CTG GTT 3’合成的引物25’CCGCTCGAG ATCACCTCG CACCACCACCACCGGCGCGGAAGGTGCCCGCCAG3’
合成的引物35’CCGCTCGAGGCAGAAGCAGTCACCACGGCAGTCGCATGCACCACCACCACCGGCGCGGAAGGTGCCCGCCAG3’其中，引物1编码了NdeI位点和Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe的部分序列，引物2、3编码XhoI位点和含有Arg-Gly-Asp序列的基因，引物1和2编码EDSM-1，1和3编码EDSM-2。
为了比较本发明所设计的血管生成抑制剂EDSM-1和EDSM-2的实际效果，本实例中我们同时克隆表达了内皮抑素基因。
重组菌的诱导表达将表达质粒转化大肠杆菌，重组菌经过1mMIPTG诱导表达3小时后，收获细胞并超声破菌，离心分离上清和沉淀，15％SDS-PAGE电泳分析，将考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE扫描(UVP White/Ultraviolet transilluminator)，分析表达结果。EDSM包涵体的分离、溶解与复性超声破菌，离心分离，将包涵体沉淀用8M尿素溶解，10000rpm离心5min，上清液4℃透析，透析液为bufferA(10mM Tris-HCl，pH7.4)，6-8h换液一次，共换液3次，最后透析一次，透析液为buffer B(1mM氧化型谷胱甘肽和1mM还原型谷胱甘肽，10mM Tris-HCl，pH7.4)，样品直接进行SP-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)层析。柱床平衡洗涤均用buffer A，用0.6M NaCl，Tris-HCl，pH7.4和1M NaCl，Tris-HCl，pH7.4分步洗脱，将洗脱液混合，buffer A透析后冻干浓缩。此方法适用于本发明的多肽的分子层析，HPLC纯化EDSM-1分析结果，如图1所示。
实施例2动物体内抗肺癌实验将培养的鼠Lewis肺癌细胞用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，重悬于PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠体侧皮下接种5×105细胞0.1ml。当肿瘤平均体积达到200mm3-300mm3，随机将小鼠分组，每组7只，其中一组接受EDSM-1治疗，一组用内皮抑素治疗，以上两组剂量均为10mg/kg/d，对照注射PBS。治疗采用在接种肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，采用公式肿瘤体积＝长×宽2×0.52，治疗效果用给定时间内的肿瘤抑制率表示(1-T/C)×100％，T＝治疗组肿瘤体积，C＝对照组肿瘤体积。
结果表明，在第9天时，EDSM-1的肿瘤抑制率为79％，而内皮抑素的肿瘤抑制率为53％(两两比较P＜0.05)，如图2所示。同样方法测得的另外一个突变体EDSM-2的肿瘤抑制率为65％。
以上实验说明本发明的高效血管生成抑制剂能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长。
实施例3小鼠HAC肝癌模型抑瘤效应将培养的鼠HAC肝癌细胞株用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm离心5min，重悬于PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠体侧皮下接种5×105细胞0.1ml。当肿瘤平均体积达到200mm3-300mm3，随机将小鼠分组，每组7只，治疗采用在接种肿瘤对侧皮下注射方法。每天用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积，采用公式肿瘤体积＝长×宽2×0.52，治疗效果用给定时间内的肿瘤抑制率表示(1-T/C)×100％，T＝治疗组肿瘤体积，C＝对照组肿瘤体积。
分阴性对照组(蒸馏水)、阳性对照组(内皮抑素)与EDSM-1、EDSM-2治疗组进行研究，皮下注射给药，结果表明，在第9天时，EDSM-1治疗组抑瘤率为65％，阳性对照内皮抑素组53％，如图3所示。同样方法试验的另外一个突变体EDSM-2的肿瘤抑制率为60％。(两两比较P＜0.05)。
多肽序列表<110>申请人姓名中国药科大学<120>发明名称高效血管生成抑制多肽及其制备方法和应用<160>序列表中序列的个数8<210>序列相对应的序列标识符1<211>序列长度51个氨基酸<212>序列的类型PRT<213>生物体人工序列<400>序列标识符Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-3 6 9 12 15Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-18 21 24 27 30 33Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45 48 51<210>序列相对应的序列标识符2<211>序列长度47个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-3 6 9 12 15Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-18 21 24 27 30 33Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45<210>序列相对应的序列标识符3<211>序列长度51个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列
<400>序列标识符Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-3 6 9 12 15Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-18 21 24 27 30 33Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp36 39 42 45 48 51<210>序列相对应的序列标识符4<211>序列长度47个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-3 6 9 12 15Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-18 21 24 27 30 33Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp36 39 42 45<210>序列相对应的序列标识符5<211>序列长度58个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-3 6 9 12 15Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-18 21 24 27 30 33Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-36 39 42 45 48 51Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe54 57
<210>序列相对应的序列标识符6<211>序列长度54个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-3 6 9 12 15Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-18 21 24 27 30 33Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-36 39 42 45 48 51Arg-Ala-Phe54<210>序列相对应的序列标识符7<211>序列长度58个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-3 6 9 12 15Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-18 21 24 27 30 33Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-36 39 42 45 48 51Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57<210>序列相对应的序列标识符8<211>序列长度54个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符
Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-3 6 9 12 15Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-18 21 24 27 30 33Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-36 39 42 45 48 51Cys-Phe-Cys54<210>序列相对应的序列标识符9<211>序列长度58个氨基酸<212>序列的类型PRT<213>生物体人工序列<400>序列标识符Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-3 6 9 12 15Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-18 21 24 27 30 33Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45 48 51-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp54 57<210>序列相对应的序列标识符10<211>序列长度54个氨基酸<212>序列的类型PRT<213>生物体人工序列<400>序列标识符Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-3 6 9 12 15Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-18 21 24 27 30 33
Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45 48 51-Arg-Gly-Asp54<210>序列相对应的序列标识符11<211>序列长度65个氨基酸<212>序列的类型PRT<213>生物体人工序列<400>序列标识符Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-3 6 9 12 15Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-18 21 24 27 30 33Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45 48 51-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60 63<210>序列相对应的序列标识符12<211>序列长度61个氨基酸<212>序列的类型PRT<213>生物体人工序列<400>序列标识符Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-3 6 9 12 15Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-18 21 24 27 30 33Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45 48 51-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60<210>序列相对应的序列标识符13<211>序列长度54个氨基酸
<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-3 6 9 12 15Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-18 21 24 27 30 33Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp36 39 42 45 48 51 54<210>序列相对应的序列标识符14<211>序列长度50个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-3 6 9 12 15Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-18 21 24 27 30 33Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp36 39 42 45 48<210>序列相对应的序列标识符15<211>序列长度61个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-3 6 9 12 15Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-18 21 24 27 30 33Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly36 39 42 45 48 51
-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60<210>序列相对应的序列标识符16<211>序列长度57个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-3 6 9 12 15Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-18 21 24 27 30 33Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Ala-Cys-Asp-Cys-36 39 42 45 48 51Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57<210>序列相对应的序列标识符17<211>序列长度65个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-3 6 9 12 15Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-18 21 24 27 30 33Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-36 39 42 45 48 51Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp54 57 60 63<210>序列相对应的序列标识符18<211>序列长度61个氨基酸<212>序列的类型蛋白质
<213>生物体人工序列<400>序列标识符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-3 6 9 12 15Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-18 21 24 27 30 33Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-36 39 42 45 48 51Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp54 57 60<210>序列相对应的序列标识符19<211>序列长度72个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-3 6 9 12 15Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-18 21 24 27 30 33Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-36 39 42 45 48 51Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-54 57 60 63 66Asp-Cys-Phe-Cys69 72<210>序列相对应的序列标识符20<211>序列长度68个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-
3 6 9 12 15Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-18 21 24 27 30 33Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-36 39 42 45 48 51Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60 63 66<210>序列相对应的序列标识符21<211>序列长度61个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-3 6 9 12 15Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-18 21 24 27 30 33Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-36 39 42 45 48 51Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp54 57 60<210>序列相对应的序列标识符22<211>序列长度57个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-3 6 9 12 15Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-18 21 24 27 30 33Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-36 39 42 45 48 51
Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp54 57<210>序列相对应的序列标识符23<211>序列长度68个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-3 6 9 12 15Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-18 21 24 27 30 33Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-36 39 42 45 48 51Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60 63 66<210>序列相对应的序列标识符24<211>序列长度64个氨基酸<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人工序列<400>序列标识符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-3 6 9 12 15Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-18 21 24 27 30 33Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-36 39 42 45 48 51Arg-Ala-Phe-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60 6权利要求
1.一种多肽，其序列为X-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Y其中X的序列为缺失、Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys；Y的序列为缺失、Arg-Gly-Asp、Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys；并且X或Y至少一个不缺失。
2.权利要求1的多肽，其序列为Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe或Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。
3.权利要求1或2的多肽的制备方法，包括下列步骤(1)合成含有X或Y整合素结合序列肽段的血管生成抑制剂基因序列，以此序列为模板，设计上下游引物，在引物序列的5’端和3’端加上适合克隆的酶切位点，PCR扩增，获得基因，将基因克隆于载体中，筛选阳性克隆，核苷酸序列分析鉴定；(2)基因与原核表达载体重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，表达产物以包涵体形式存在；(3)进行包涵体蛋白分离、溶解和复性，并进行离子交换层析分离纯化蛋白产物，收集穿过液，冻干。
4.权利要求1或2的多肽用于制备治疗与血管生成相关疾病的药物的用途。
5.权利要求4的用途，其中血管生成相关疾病是肝癌。
6.权利要求4的用途，其中血管生成相关疾病是肺癌。
全文摘要
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一类高效抑制血管生成多肽及其制备方法和用于抗肿瘤药物的应用。本发明通过对内皮抑素的第6－49氨基酸进行修饰，修饰后的多肽具有比内皮抑素更强的体内抗肿瘤活性及肿瘤靶向性。
文档编号A61K38/16GK1827640SQ200610039298
公开日2006年9月6日 申请日期2006年4月5日 优先权日2006年4月5日
发明者徐寒梅, 沈子龙, 文良柱 申请人:中国药科大学