双特异性抗体及其制造方法

专利名称：：双特异性抗体及其制造方法
技术领域：
：本发明涉及产生双特异性抗体的新方法，并涉及可以通过这些方法获得的双特异性抗体。
背景技术：
：人免疫球蛋白G(IgG)抗体存在4种具有不同结构和功能性质的亚型。IgG包括两个重链-轻链对(半分子)，它们通过位于铰链区中的重链间二硫键连接。人IgG4分子存在多种分子形式，它们的区别在于位于铰链区中的重链间二硫键的有无。IgG4分子以两个重链间二硫键均已形成或者均未形成的形式存在(6，7)。然而，不论是否存在这些链间二硫键(6，8)，人IgG4在溶液中均以由两个Ig重链和两个轻链组成的四聚体形式存在，这是免疫球蛋白G分子的共同性质，因为在CH3结构域之间和在CHl和CH2结构域之间存在相对强的非共价相互作用(4)。只有在非还原条件下发生变性时，两个非共价关联的半分子才会解离，如大小测定分析(size-determinationanalysis)例如SDS-PAGE所表现的(6，9)。几年来人们已经知道，人IgG4分子与其它的IgG亚类不同，以单价分子形式与抗原相互作用。已经发现，血清来源的人IgG4不能沉淀纯化的抗原，因为它不能交联。虽然这种血清来源的IgG4在功能上是单价的(1，2)，但与之形成对照的是，重组产生的IgG4在与抗原相互作用中的行为表现为二价(3)。根据这些观察结果，有人提出，血清中的IgG4分子能够交换半分子(即，由一个重链和一个轻链构成的分子)，结果产生双特异性分子，这样的分子不能交联相同的抗原(3-5)。这种半分子交换过程在本文也被称作“Fab臂交换”。双特异性抗体作为治疗药物的潜力是令人感兴趣的，因为它们可以用作例如调节物，使效应物机制重新靶向于疾病相关的位点。然而，开发双特异性抗体的其中一个主要的障碍就是通过传统的技术，例如杂交瘤和化学偶联方法，难以产生足够量和品质的材料(10)。WO2005/062916介绍了用于在小鼠体内基于IgG4形成多聚分子的方法。此外，WO2005/062916还介绍，在盐缓冲液中体外共同温育两种具有不同抗原结合特异性的IgG4抗体可形成能够同时与两种抗原反应的产物。然而，WO2005/062916中没有证明，这些产物是聚集体还是双特异性的抗体，并且反应的产出在所用条件下较低。发明概要现在人们惊奇地发现，在还原条件下，两种具有不同抗原结合特异性的IgG4_或IgG4-样抗体能够进行高效的半分子交换，从而形成双特异性抗体，而不会伴随形成聚集体(aggregates)0因此，在第一个主要方面中，本发明涉及一种用于产生双特异性抗体的体外方法，所述方法包括如下步骤a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含IgG4_样CH3区，b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述第二抗体包含IgG4-样CH3区，c)在允许核心铰链区的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所述第一和第二抗体，和d)获得双特异性抗体。不受限于任何具体的理论，我们认为抗体的两个区域对其进行半分子交换的能力具有重要的影响。首先，半分子交换的能力可能受到分子的核心铰链区中的序列差异的影响，因为在核心铰链区中具有CPSC序列的抗体，例如IgG4，比具有CPPC核心铰链序列的抗体，例如IgGl，更容易交换。不受限于任何理论，提出这样的假设，即CPSC序列导致核心铰链(core-hinge)更有柔性(flexible)，并使链内二硫键的形成成为可能。值得一提的是，核心铰链的结构与蛋白质-二硫化物_异构酶(PDI)的活性结构域CXXC相似。不同同种型的PDI的这些CXXC基序催化蛋白质中二硫键的形成、还原和重排。因此，不受限于任何具体的理论，认为具有IgG4-样核心铰链序列的抗体可能具有内在的重排二硫键的活性，这种活性被本发明方法中所用的条件所激发。第二，同样不受限于任何理论，结果显示为了允许交换反应发生，CH3区的序列应当是IgG4-样，即使得不会形成强的半分子间相互作用。在另一个主要方面中，本发明涉及通过本发明的方法获得的或者可以通过本发明的方法获得的分离的双特异性抗体，并涉及包含这样的抗体的药物组合物。在进一步的方面中，本发明涉及一种包含两个IgG4_样CH3区的分离的双特异性抗体，并涉及包含这样的抗体的药物组合物。在更进一步的方面中，本发明涉及一种用于选择具有期望性质的双特异性抗体的方法，所述方法包括如下步骤a)提供一系列抗体，其中每种抗体具有不同的靶标特异性，并且其中每种抗体包含IgG4-样CH3区，b)在还原条件下将所述系列中的每种抗体与所述系列中的另一种抗体进行温育，从而产生一系列的抗体混合物，其中每种混合物包含不同的双特异性抗体(adifferentbispecificantibody),c)测定所得的一系列抗体混合物的给定的期望性质，和d)选择具有期望性质的双特异性抗体混合物。附图简述图1.经纯化的重组IgGl和IgG4的SDS-PAGE分析。纯化之后，将Betvl和Feldl，IgGl和IgG4抗体在非还原SDS-PAGE上进行分析。图2.nu/nuBalb/c小鼠体内，在不同时间点上双特异性IgG的水平。将异源交联测定确定的双特异性IgG的量对Betvl结合测定确定的Betvl特异性IgG的量进行作图。含IgGl血浆样品和含IgG4血浆样品的数据分别用空心和实心符号表示。虚线代表在IgG半分子交换是随机且完全的条件下双特异性IgG的计算量。图3.在体内产生双特异性人IgG4分子。㈧各组SCID小鼠(η=5)注射嵌合抗体混合物100μgIgGl-Betvl/100μglgGl-Feldl(正方形)，100μgIgG4_Betvl/100μgIgG4-Feldl(圆形)，或3)100μgIgG4_Betvl/100μgIgG4_Feldl+2,000μg无关重组IgG4(IgG4-EGFR；三角形)。通过评估血浆中针对Betvl和Feldl的双特异性活性来随时间追踪双特异性抗体的产生。双特异性IgG相对于总IgG-Betvl浓度的分数用百分比表示。带星号的箭头指示在过量的无关IgG4的存在下接受IgG4-BetVl/IgG4-Feldl的小鼠体内预期的双特异反应性水平(4%)，不带星号的箭头指示接受IgG4-BetVl/IgG4-Feldl混合物的小鼠体内预期的双特异反应性水平(50%)。误差棒代表SEM。(B)通过评估小鼠血浆中放射性标记的Feldl与Feldl偶联S印harose的交联来测试单特异交联活性。单特异反应性表示为通过交联结合的放射性标记Feldl的量与总IgG-Feldl的比值，以便校正IgG的清除。误差棒表示SEM。图4.小鼠血浆中双特异活性的SEC分析。将在t=24h时从给予了一种IgG4混合物的小鼠获得的血浆(10μ1)在Superdex200柱上进行分离。小鼠被给予了含有300μgBetvl结合性IgG4和300μgFeldl结合性IgG4的混合物。在级分中Feldl特异性IgG(■)的浓度在抗原结合试验中测量，双特异性IgGBetvl-FeldK·)的浓度在Betvl-Feldl交联测定中确定。用IVIg对柱进行校准，结果显示单体、双体和聚集型IgG分别在12.9，11.0和8.4ml洗脱(数据未显示)。图5.IgG在全血组分中的交换是将嵌合IgG混合物在37°C的全血、血细胞、血浆和血清中温育24h，之后在异源交联测定(Feldl-Betvl)中测量双特异活性，来评估IgG4和IgGl的交换。血液从两个供体获得A(黑色条形)和B(灰色条形)。确定在添加了嵌合IgG4(图A)、嵌合IgGl(图B)或者没有添加IgG(图C)的混合物中的双特异性活性。所有提供的数据均是在37°C温育24h后测量的。图6.人血细胞的IgG交换在37°C将嵌合IgG混合物与单个核细胞(MNC)、血小板(Thr)和红细胞(Ery)温育48h，之后在异源交联测定(Feldl-Betvl)中测量双特异活性，来评估IgG4(黑色条形)和IgGl(灰色条形)的交换。作为对照，还在无血清培养基(SFC)中温育抗体混合物。双特异性表示为被结合的125I-Betvl相对于总添加量的百分比。图7.HEK和小鼠细胞系的IgG4交换在37°C将嵌合IgG混合物与HEK细胞、小鼠B细胞(J558)或杂交瘤细胞温育，来评估IgG4半分子的交换。在异源交联测定(Feldl-Betvl)中对分别在t=Oh(灰色条形)和t=24h(黑色条形)获取的1μ1样品中的双特异活性进行测量。双特异性表示为被结合的125I-Betvl与总添加量的百分比。图8.红细胞介导的IgG4交换将IgG4-BetVl/IgG4-Feldl混合物与新鲜纯化的红细胞(ery，实心符号)温育产生了双特异性抗体，而对于IgGl同种型的混合物没有观察到双特异性。作为对照，将抗体混合物在无红细胞的PBS中温育(空心符号)。箭头指示双特异性IgG的最大预期百分比(50%)。误差棒表示重复测量结果的范围。图9.IgG4在PBS中的交换通过测量双特异活性(图A)、二价性和抗原结合来评估IgGl(白柱)，IgG4(灰色条形)和IgG4在过量的无关IgG4(黑色条形)存在下在PBS中的交换。图A中IgG半分子的交换是从双特异IgG的浓度(在异源交联测定中确定)和假设IgG半分子的交换是随机且完全的情况下双特异IgG的最大预期浓度计算而得的。交换表示为占最大交换的百分比，最大交换为100%。在图B中描绘了随时间变化的Feldl二价性，其是在同源交联测定中测得的。将t=0时的二价IgG的浓度设定为100%，将二价IgG的浓度标准化。图10.红细胞裂解物的IgG4交换在来自红细胞的裂解物中37°C温育嵌合IgG4混合物来评估IgG4半分子的交换。将IgG4与递增稀释度的裂解物一起温育。在异源交联测定中对在所示时间点获取的样品进行双特异活性(Betvl-Feldl)测量。双特异性表达为被结合的125I-Betvl相对于添加量的百分比。图11.受红细胞裂解物诱导的双特异活性的SEC分析将IgG4与新鲜制备的红细胞裂解物在37°C温育24h，随后在SuperdeX200柱上进ifi双。Superdex200HPLC(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)±以0.5ml/min运行。级分中Betvl特异性IgG(■)的浓度在抗原结合测定中进行测量，双特异性IgGFeldl-Betvl(·)的浓度在Betvl-Feldl交联测定中加以确定。对该柱进行校准，结果显示单体、双体和聚集型IgG分别在12.1,10.3和8.3ml洗脱(数据未显示)。图12.GSH介导的IgG4交换通过在PBS/叠氮化物(Azide)中递增浓度GSH的存在下温育IgG4来评估GSH介导的IgG4半分子交换。在所示的时间点采取样品，测量其中的抗原结合和双特异活性。IgG4半分子的交换是从双特异性IgG的测得浓度(在异源交联测定中确定)以及假定IgG4半分子的交换是随机且完全的情况下双特异性IgG4的最大预期浓度计算而得的。交换表示为占最大交换的百分比，最大交换设定为100%。图13.GSH介导的IgG4半分子交换的SECIgG4与GSH(0.5mM)温育，随后在Superdex200柱上进行分离。Superdex200柱在AktaHPLC单元(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)上以0.5ml/min运行。级分中Betvl特异IgG(_)的浓度在抗原结合测定中进行测量，双特异性IgGFeldl-Betvl(·)的浓度在Betvl-Feldl交联测定中加以确定。对该柱进行校准，结果显示单体、双体和聚集型IgG分别在12.1,10.3和8.3ml洗脱(数据未显示)。图14.GSH介导的IgG4交换的温度依赖性将IgG4_Betvl及IgG4_Feldl混合物在示明的温度下在PBS中与GSH温育。在t=Oh(灰色条形)和t=24h(黑色条形)，对双特异性IgG4的浓度进行评估。由这些数据计算双特异性IgG相对于IgG4Betvl浓度的分数，并表示为百分比。误差棒表示重复测量的范围。图15.由一组还原剂介导的IgG4交换将PBS中的IgG4_Betvl和IgG4_Feldl在不同作用剂(全部为还原性，GSSG除外)的存在下在37°C温育24h。Betvl特异性IgG的浓度在Betvl结合测定中进行测量，双特异性IgG的浓度在异源交联测定(Feldl-Betvl)中进行测量。计算双特异性IgG相对于IgG-Betvl浓度的百分比。标准误差棒表示从三次测量计算出的SEM。图16.使用GSH的完全人类IgG4抗体的交换(A)将IgG4-CD20/IgG4-EGFr或IgGl-CD20/IgGl-EGFr混合物在有或者没有0.5mMGSH的条件下在37°C进行温育。在示明的时间点采取样品。在夹心式ELISA中测量双特异性抗体的形成。Y轴表示405nm的光密度，作为双特异性CD20/EGFR抗体形成的量度。(B)GSH剂量依赖性的IgG4交换。将IgG4_CD20和IgG4_EGFr的混合物与所示浓度的GSH37°C温育24h。双特异性抗体的形成在夹心式ELISA中测量。在Y轴上绘制405nm的光密度，作为双特异性CD20/EGFR抗体形成的量度。(C)GSH-介导的IgG4半分子交换受到反应中所用成分的影响，并且在较低GSH浓度的培养基(Freestyle293)中发生。(D)GSH-介导的IgG4半分子交换在0.5mMGSH比在5mMGSH更高。(E/F)通过ESI-TOF质谱检测IgG4_EGFR和IgG4_CD20之间的Fab臂交换。IgG4混合物在不存在(E)或存在(F)O.5mMGSH的条件下温育24小时，之后用PNGaseF使抗体去糖基化，并通过ESI-TOF质谱确定所得抗体的分子量。图中显示的是经去卷积(deconvoluted)ESI-TOF质谱。数据代表2次实验的结果。图17.猕猴IVIg参与重组人IgG4抗体的Fab臂交换A)将两种重组人IgG4抗体(IgG4-⑶20和IgG4_EGFr)的混合物在存在或不存在纯化猕猴免疫球蛋白或人IVIg的条件下在37°C与GSH温育24h。双特异性抗体通过Fab臂交换的形成在夹心式ELISA.中进行测量。B)将两种重组人IgG4抗体(IgG4-⑶20和IgG4_EGFr)的混合物在存在或不存在过量(圆括号内所示)的来自数种动物(来源也示于圆括号中)的纯化猕猴免疫球蛋白或人IVIg的条件下在37°C与GSH温育24h。在夹心式ELISA.中测量双特异性抗体通过Fab臂交换的形成。C)将两种重组人IgG4抗体(IgG4-⑶20和IgG4_EGFr)的混合物在存在或不存在过量(圆括号内所示)的经纯化的黑猩猩、狒狒、食蟹猴(cynomolgousmonkey)、马和猪免疫球蛋白(圆括号内也指示了来源)或人IVIg的条件下在37°C与GSH温育24h。在夹心式ELISA中测量双特异性抗体通过Fab臂交换的形成。图18.恒定区序列下划线的序列代表CH3区图19.IgGl突变体的GSH介导的半分子交换(A)用0、0.1、1和IOmMGSH测试GSH浓度对不同IgGl突变体的半分子交换的影响。交换的测试使用如下的混合物-IgG4a-feldlwt禾口IgG4a-betvlwt(图中表示为IgG4wt)-IgGla-feldlwt禾口IgG4a_betvlwt(表示为IgGlwt)-IgGla-feldlCPSC和IgGla-betvlCPSC(表示为IgGl-CPSC)-IgGla-feldlCH3(IgG4)和IgGla_betvlCH3(IgG4)(表示为IgGl_CH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC-CH3(IgG4)和a-betvlIgGlCPSC_CH3(IgG4))(表示为IgGl-CPSC_CH3(IgG4))(B)用0.5和5mMGSH测试GSH浓度对不同IgGl突变体与野生型IgG4(IgG4wt)分子的半分子交换的影响。交换的测试使用如下的混合物-IgGla-feldlwt和IgG4a_betvlwt(表示为IgGl)-IgGla-feldlCPSC和IgG4a_betvlwt(表示为IgGl-CPSC)-IgGla-feldlCH3(IgG4)和IgG4a_betvlwt(表示为IgGl_CH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC-CH3(IgG4)和IgG4a_betvlwt(表示为IgGl_CPSC_CH3(G4))-IgGla-feldlR238Q和IgG4a_betvlwt(表示为IgGl_R238Q)-IgGla-feldlK292R和IgG4a_betvlwt(表示为IgGl_K292R)-IgGla-feldlQ302E和IgG4a_betvlwt(表示为IgGl_Q302E)-IgGla-feldlP328L和IgG4a_betvlwt(表示为IgGl_P328L)-IgGla-feldlCPSC-K292R和IgG4a-betvlwt(表示为IgGl_CPSC_K292R)-IgG4a-feldlwt禾口IgG4a_betvlwt(表示为IgG4)(C)用0.5和5mMGSH测试GSH浓度对不同IgGl突变体的半分子交换的影响。交换的测试使用如下的混合物-IgGla-feldlwt和IgGla-betvlwt(表示为IgGl)-IgGla-feldlCPSC和IgGla-betvlCPSC(表示为IgGl-CPSC)-IgGla-feldlCH3(IgG4)和IgGla-betvlCH3(IgG4)(表示为IgGl_CH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC-CH3(IgG4)和IgGla-betvlCPSC-CH3(IgG4)(表示为IgGl-CPSC-CH3(IgG4))-IgGla-feldlR238Q和IgGla-betvlR238Q(表示为IgGl_R238Q)-IgGla-feldlK292R和IgGla-betvlK292R(表示为IgGl_K292R)-IgGla-feldlQ302E和IgGla-betvlQ302E(表示为IgGl_Q302E)-IgGla-feldlP328L和IgGla-betvlP328L(表示为IgGl_P328L)-IgGla-feldlCPSC-K292R禾口IgGla-betvlCPSC_K292R(表示为IgGl-CPSC-K292R)-IgG4a-feldlwt禾口IgG4a_betvlwt(表示为IgG4)图20.在0.5mMGSH下，具有野生型(IgG4)核心铰链的IgG4分子参与重组人IgG4抗体的Fab臂交换，而具有IgGl核心铰链的分子不参与。(A)两种重组人IgG4抗体(IgG4-⑶20和IgG4-EGFr，如上文说明的)的混合物在存在或不存在过量(50和100微克/ml)的那他珠单抗(Tysabri)的条件下在37°C与0.5mMGSH温育24h。在夹心式ELISA中测量双特异性抗体通过Fab臂交换的形成。(B)将两种重组人IgG4抗体(IgG4-CD20和IgG4-EGFr，如上所述)的混合物在存在或不存在等摩尔量(10微克/ml)的那他珠单抗(Tysabri)或吉妥单抗(Mylotarg)的条件下在37°C与0.5mMGSH温育24h。在夹心式ELISA中测量双特异性抗体通过Fab臂交换的形成。图21.在292位点具有额外突变的IgGl-CPSC构建体的半分子交换。用0.5mMGSH测试不同IgGl突变体的半分子交换。交换的测试使用如下的混合物-IgGl-2F8wt和IgGl_7D8wt(表示为IgGl)-IgGl-2F8-CPSC和IgGl_7D8_CPSC(表示为IgGl-CPSC)-IgGl-2F8-CH3(IgG4)禾PIgGl_7D8_CH3(IgG4)(表示为IgGl_CH3(IgG4))-IgGl-2F8-CPSC-CH3(IgG4)禾口IgGl_7D8-CPSC_CH3(IgG4)(表示为IgGl-CPSC-CH3(IgG4))-IgGl-2F8-CPSC-R238Q和IgGl-7D8_CPSC-R238Q(表示为IgGl_CPSC_R238Q)-IgGl-2F8-CPSC-K292R和IgGl_7D8-CPSC_K292R(表示为IgGl_CPSC_K292R)-IgGl-2F8-CPSC-K292Y和IgGl_7D8-CPSC_K292Y(表示为IgGl_CPSC_K292Y)-IgGl-2F8-CPSC-K292F和IgGl_7D8-CPSC_K292F(表示为IgGl_CPSC_K292F)-IgGl-2F8-CPSC-K292ff和IgGl_7D8_CPSC-K292W(表示为IgGl_CPSC_K292W)-IgGl-2F8-CPSC-Q302E和IgGl-7D8_CPSC-Q302E(表示为IgGl_CPSC_Q302E)-IgGl-2F8-CPSC-P328L和IgGl-7D8-CPSC_P328L(表示为IgGl-CPSC_P328L)-IgG4-2F8wt禾口IgG4_7D8wt(表示为IgG4)在夹心式ELISA中测量双特异性抗体通过Fab臂交换的形成。图22.核心铰链的稳定化可在体内保护IgG4抗体治疗剂免于遭受Fab臂交换。(A)通过ESI-T0F质谱检测IgG4_EGFR_CPPC和IgG4_CD20之间的Fab臂交换。将IgG4-EGFR-CPPC/IgG4-CD20混合物在5mMGSH的存在下(F)温育24小时，之后用PNGaseF使抗体去糖基化，并通过ESI-T0F质谱确定所得抗体的分子量。图中显示了去卷积后的ESI-T0F谱。在使用5mMGSH时可以检测到双特异性EGFR/⑶20抗体(在没有GSH或0.5mMGSH的条件下温育未产生双特异性抗体(数据未显示))。(B)将数组(n=4)SCID小鼠用IgG4-CD20/IgG4_EGFR(空心圆)、IgG4_CD20/IgGl-EGFR和IgG4-CD20/IgG4-EGFR-CPPC等抗体混合物(每种300ug)进行注射。通过ELISA对双特异性抗体的产生进行经时追踪和定量。双特异性抗体的定量使用体外交换的抗体混合物作为对照。数据点代表4只小鼠的在不同的实验中至少测量2次的平均值士SEM。在IgG4-CD20/IgGl-EGFR和IgG4-CD20/IgG4_EGFR-CPPC混合物中未能检测到双特异性抗体。示明了测定的检测限(虚线)，代表2000ng/ml的血清水平。图23.CXXC-突变体的经时Fab臂交换将CXXC-突变抗体的混合物在37°C与0.5mMGSH温育。在示明的时间点采取样品。测量双特异性抗体的形成。交换的测试使用如下的混合物-IgGla-feldlwt和IgGla-betvlwt(表示为IgGl)-IgG4a-feldlwt和IgG4a_betvlwt(表示为IgG4)-IgG4a-feldlCGHC和IgG4a_betvlCGHC(表示为CGHC)-IgG4a-feldlCGC和IgG4a_betvlCGC(表示为CGC)-IgG4a-feldlCPRC和IgG4a_betvlCPRC(表示为CPRC)-IgG4a-feldlCPHC和IgG4a_betvlCPHC(表示为CPHC)图24:CXXC突变体的GSH介导的Fab臂交换用1-20，000uMGSH测试GSH浓度对CXXC突变体的Fab臂交换的影响。交换的测试使用如下的混合物-IgGla-feldlwt和IgGla-betvlwt(表示为IgGl)-IgG4a-feldlwt和IgG4a_betvlwt(表示为IgG4)-IgG4a-feldlCGHC和IgG4a_betvlCGHC(表示为CGHC)-IgG4a-feldlCGC和IgG4a_betvlCGC(表示为CGC)-IgG4a-feldlCPRC和IgG4a_betvlCPRC(表示为CPRC)-IgG4a-feldlCPHC和IgG4a_betvlCPHC(表示为CPHC)发明详细说明定义术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链，一对低分子量轻链(L)和一对重链(H)所构成，所有4条链均通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已经得到了详尽的表征。见例如《FundamentalImmunology》第七章(Paul，W.，ed.，2nded.RavenPress,N.Y.(1989))(11)。简而言之，每条重链典型地由一个重链可变区(本文缩写为乂11或VH)和一个重链恒定区构成。重链恒定区通常由三个结构域构成CH1、CH2和CH3。每条轻链典型地由一个轻链可变区(本文缩写为\或VL)和一个轻链恒定区构成。轻链恒定区通常由一个结构域Q构成。Vj^nt区可以进一步分为高可变性区(或高变区，其在序列和/或结构限定的环的形式上具有高度可变性)，也称作补体决定区(CDR)，它们之间散布着更加保守的区，称作框架区(FRs)。每个Vj^Pt通常由三个CDR和4个FR构成，从氨基端向羧基端的排列顺序是FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(另见(12))。典型地，该区中氨基酸残基用Kabat(13)所述的方法进行编号。使用该编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可以包含更少或更多的氨基酸，相应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可以在VfDR2的52位残基之后包含单氨基酸插入(依照Kabat的残基52a)，和在重链FR的82位残基之后插入残基(例如依照Kabat的残基82a，82b和82c等)。对于给定的抗体，可以通过将该抗体序列与一条“标准的”Kabat编号序列在同源区域处进行比对，来确定其残基的Kabat编号。在本发明语境中，术语“抗体(Ab)”是指这样的免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子的片段，或两者之任一的衍生物，其能够在典型的生理条件下以相当长时间的半衰期特异性结合抗原，例如至少大约30分钟，至少大约45分钟，至少大约1小时，至少大约2小时，至少大约4小时，至少大约8小时，至少大约12小时，大约24小时或者更长，大约48小时或者更长，大约3、4、5、6或更多天等，或者其它任何相关的功能上定义的时间段(例如足以诱导、促进、提高和/或调节与抗体结合抗原相关联的生理响应的时间，和/或足以供抗体招募Fc介导的效应物活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链可变区包含可以和抗原相互作用的结合结构域。抗体(Abs)的恒定区可以介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)，和补体系统的成分，例如Clq，经典补体激活途径的第一个成分。如上文指出的，除非在另外指出或明显与上下文矛盾，本文中的术语“抗体“包括含有突变的或野生型的核心铰链区并保留特异性结合抗原的能力的抗体片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实施。术语“抗体”中涵盖的结合性片段的实例包括例如F(ab‘)2片段，它们是二价片段，包括两条Fab片段，这两条片段通过位于铰链区的一个二硫键相连。尽管这些片段一般包含在抗体的含义之内，但是它们作为总体以及各个独立的个体都是本发明的独特特征，展示不同的生物性质和效用。还应当理解，除非另外具体指出，术语“抗体”还包括通过任何已知的技术，例如酶切、肽合成和重组技术，所提供的多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、类抗体多肽例如嵌合抗体和人源化抗体，以及保留特异性结合抗原能力的抗体片段(抗体结合片段)。所产生的抗体可以具有任何同种型。如本文所使用的，术语“人抗体”或“人类抗体”意图包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由于体外随机或定点突变或由于体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”或“人类抗体”不意图包括如下的抗体，其中来自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类框架序列上。如本文所使用的，“分离的抗体，，意图指示如下的抗体，其基本上不含其它具有不同抗原特异性的抗体。然而，特异性结合某种特定人靶抗原的表位、同种型或变异体的分离抗体可能具有与其它相关抗原(例如来源于其它物种的抗原(例如物种同源物))的交叉反应性。而且，分离的抗体可以基本不含其它的细胞材料和/或化学品。在本发明的一个实施方案中，将一组具有不同特异性的“分离”单克隆抗体组合在明确限定的组合物中。如本文所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指抗体分子单一分子组合物的制备物。单克隆抗体组合物显示针对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性、且具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，杂交瘤包括相互融合的B细胞和永生化细胞，其中B细胞是从基因组中包含人重链转基因和轻链转基因的转基因或转染色体非人动物(例如转基因小鼠)获得的。如本文使用的，术语“结合”在某一抗体结合预定抗原的语境中通常是亲和力相当于KD为大约1(TM或者更低，例如大约10_8M或者更低，例如大约10_9M或者更低，大约或者更低，或者大约10-"M或者更低的结合，所述KD例如使用BIAcore3000设备，以抗原作为配体，并以抗体作为分析物，通过表面等离子体共振(SPR)技术来加以确定；其结合预定抗原的亲和力，相当于比其针对除该预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异抗原(例如BSA、酪蛋白)的结合亲和力的Kd至少低10倍，例如至少低100倍，例如至少低1000倍，例如至少低10，000倍，例如至少低100，000倍的Kd。亲和力相差的量取决于抗体的KD，从而当抗体KD非常低(即抗体特异性很高)时，针对抗原的亲和力较针对非特异抗原的亲和力相差的量可以是至少10，000倍。如本文所使用的，术语“kd”(sec"1)是指特定抗体_抗原相互作用的解离速度常数。该值又称为k。ff值。如本文所使用的，术语“ka”(M_iXsec"1)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速度常数。如本文所使用的，术语“Kd”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。如本文所使用的，术语“Ka”(M-1)是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数，是通过ka除以kd获得的。如本文所使用的，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类型(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。术语“表位”是指能够特异结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由表面分子集团(surfacegroupingsofmolecules)构成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特异的三维结构特征，以及特异的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合会丧失，而后者不会。表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基(也称作表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效封闭的氨基酸残基(换言之，该氨基酸残基位于特异抗原结合肽的足迹(footprint)内)。如本文所使用的，人抗体如果满足下述条件，则是“来源于”或“衍生自”(derivefrom)特定的种系序列的该抗体是从使用人免疫球蛋白序列的系统获得的，例如通过免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因库，且其中所选择的人抗体的氨基酸序列与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，或者例如至少99%的同一性。典型地，在重链CD3之外，来源于特定人种系序列的人抗体将显示与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过20个氨基酸的差异，例如不超过10个氨基酸的差异，例如不超过5个，例如不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。术语“双特异性抗体”意图包括任何具有两种不同的结合特异性的抗体，即该抗体结合两种不同的表位，这两种表位可以位于相同的靶抗原上，或者更一般地，位于不同的靶抗原上。如本文所使用的，术语“效应细胞”是指免疫响应效应期中，而不是免疫响应的识别期和激活期中所涉及的免疫细胞。免疫细胞的实例包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(例如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞，例如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱细胞。一些效应细胞表达特异的Fc受体，并执行特异的免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)，例如自然杀伤细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞参与特异杀伤靶细胞、将抗原呈递给免疫系统的其它成分、或结合呈递抗原的细胞等作用。在一些实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原或靶细胞。特定FcR在效应细胞上的表达可以被体液因子例如细胞因子所调节。例如，已经发现，FcyRI的表达被干扰素、(IFN-Y)和/或G-CSF上调。这种提高的表达可增加带有FcyRI的细胞对靶标的细胞毒活性。效应细胞可以吞噬或裂解靶抗原或靶细胞。“治疗”是指以缓解、减轻、阻止或根除(治愈)症状或疾病状态为目的施用有效量的本发明治疗活性化合物。“有效量”是指在必要的给药剂量(dosage)或时程下，可有效获得期望的治疗结果的量。抗体的治疗有效量可随多种因素变化，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，和抗体在个体内引发期望的响应的能力。治疗有效量同时还指抗体或抗体部分的治疗有益效应超过任何毒性或有害效应。术语“IgG4-样核心铰链区”是指如下的核心铰链区，其中半胱氨酸残基与抗体分子中其它半胱氨酸/二硫桥相比显著地更容易被还原和/或二硫键异构体化。因此，对于具有IgG4-样核心铰链区的抗体，可以找到这样的还原性条件，在该条件下核心区的半胱氨酸残基/二硫桥可以被还原，继而与另一个半分子中的核心铰链半胱氨酸形成二硫桥，而同时抗体内的其它二硫桥以及抗体的整体结构仍保持完整。例如，IgG4-样核心铰链区可以是IgG4核心铰链区，或者是另一种同种型抗体的核心铰链序列，其中核心区CPPC序列的其中一个脯氨酸被突变，例如突变成丝氨酸，如CPPC突变成CPSC。在本专利申请的语境中，术语“IgG4_样CH3区”是指与IgG4(例如人IgG4)的CH3相同的CH3区，或者在功能上与IgG4CH3区等价的CH3区。在此语境中，“功能上等价”的意思是所述CH3区与IgG4的CH3区相似，不形成稳定的半分子间相互作用。给定的CH3区的稳定的半分子间相互作用的形成，可以通过用该CH3区替换IgG4的CH3，然后在实施例31或32给定的条件下进行交换测试来加以检验。如果观察到交换，则没有形成稳定的半分子间相互作用。例如，IgG4-样CH3区可以是这样的CH3区，其容许半分子交换的效率与来自IgG4的CH3区相当。由此，IgG4-样CH3区可以在结构上与IgG4的CH3区相似，例如与IgG4的CH3区的序列有超过75%，例如超过90%的相似性。然而，作为附加条件或者替代条件，在此语境下IgG4-样CH3区可以是这样的CH3区，它在结构上与IgG4的CH3区不相近，但具有相似的功能特征，即它不含任何参与和其它包含相同的CH3区氨基酸序列的肽形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键(例如盐桥)的氨基酸残基。例如，IgG4_样CH3区可以是突变的IgGlCH3区，其中可参与半分子间CH3-CH3相互作用的一个或多个氨基酸残基已被改变或删除。术语“还原性条件”或“还原性环境”是指如下的条件或环境，其中底物，在这里是抗体核心区中的半胱氨酸残基，更可能被还原而不是被氧化。术语“还原剂”是指这样的化合物，它还原它的环境中的分子，即改变其环境中的分子，使之更加被还原(morereduced)或者更具有还原性(morereducing)。还原剂通过提供电子发挥作用，这样其自身在还原了底物之后被氧化。因此，还原剂是提供电子的作用剂。还原剂的实例包括二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、半胱氨酸、巯基乙醇酸盐(或酯)、半胱胺(cysteamine)、谷胱甘肽和硼氢化钠。在一个实施方案中，还原剂不包括酶。“二硫键形成”是指在一个或两个多肽内存在的两个半胱氨酸之间形成共价键的过程，其可图示为〃-S--S-"。“二硫键还原”是指断裂二硫键，从而形成两个巯基(-SH基团)的过程。术语“二硫键异构化”是指不同半胱氨酸之间二硫键的交换，即二硫键改组(shuffling)o“蛋白质二硫键异构酶”是指催化蛋白质中二硫键的异构化的酶。在二硫桥还原的语境中使用的“无显著还原”一般是指，在溶液中发生还原的所述二硫桥少于10%，例如少于5%，例如少于2%，或者少于1%。发明的各方面和实施方案如上文所述，在第一个主要方面中，本发明涉及一种用于产生双特异性抗体的体外方法，所述方法包括如下步骤a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含IgG4_样CH3区，b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述第二抗体包含IgG4-样CH3区，c)在允许核心铰链区的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所述第一和第二抗体，和d)获得双特异性抗体。在优选实施方案中，本发明方法中使用的第一和第二抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可以，例如，通过首先由Kohleretal.(14)描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组DNA方法产生。单克隆抗体还可以用例如Clackson等(15)和Marks等(16)介绍的技术从噬菌体抗体文库中分离。单克隆抗体可以从任何合适的来源获得。因此，例如，可以用感兴趣的抗原，例如以在表面上表达该抗原的细胞或者编码感兴趣的抗原的核酸的形式，免疫小鼠，从该小鼠获得脾B细胞，从该小鼠脾B细胞制备杂交瘤，从该杂交瘤获得单克隆抗体。还可以从来自经过免疫的人或非人哺乳动物(例如大鼠、狗、灵长动物等)的抗体表达性细胞衍生的杂交瘤获得单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体是人抗体。指定的人单克隆抗体可用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并在本文中统称为“转基因小鼠”。HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因迷你座位(miniloci)，其编码未重排的人重链(P和Y)和k轻链免疫球蛋白序列，以及使内源P和k链座位失活的靶定突变(targetedmutations)(17)0因此，所述小鼠表现出小鼠IgM或k表达降低，在应答于免疫时，被引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变而产生高亲和性的人IgG，k单克隆抗体(17-20)。HuMAb小鼠的制备在参考文献21-25中有详细介绍。另见US5,545,806,US5,569,825,US5,625,126,US5,633,425,US5,789,650,US5,877,397,US5，661，016、US5，814，318、US5，874，299、US5，770，429、US5，545，807、WO98/24884、WO94/25585、WO93/1227、WO92/22645、W092/03918和W001/09187。HCo7小鼠在它们的内源轻链(kappa)基因中有一个JKD中断(disruption)(如Chen等(26)所述)，在它们的内源重链基因中有一个CMD中断(如W001/14424的实施例1所述)，一个KCo5人kappa轻链转基因(如Fishwild等(25)所述)，和一个HCo7人重链转基因(如US5，770，429所述)。HCol2小鼠在其内源轻链(kappa)基因中有一个JKD中断(如Chen等(26)所述)，在其内源重链基因中有一个CMD中断(如W001/14424的实施例1所述)，一个KCo5人kappa轻链转基因(如Fishwild等(25)所述)，和一个HCol2人重链转基因(如W01/14424的实施例2所述)。在KM小鼠品系中，内源小鼠kappa轻链基因如Chen等(26)所述的那样被纯合地中断，并且内源小鼠重链基因如W001/09187的实施例1所述那样被纯合地中断。这种小鼠品系携带一个人kappa轻链转基因，KCo5，如Fishwild等(25)所述。该小鼠种系还携带一个人重链转染色体，其包括染色体14的片段hCF(SC20)，如W002/43478所述。来自这些转基因小鼠的脾细胞可用于根据众所周知的技术产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。这些转基因非人类动物、包含编码表达本发明所用抗体的可操作核酸序列的非人类动物、用一个或多个编码靶标的核酸序列稳定转染的非人类动物等，是本发明的额外特征。本发明使用的人单克隆或多克隆抗体或者本发明使用的来源于其它物种的抗体，还可以用转基因方式来产生，其是通过产生另一种用目的免疫球蛋白重链和轻链序列转基因的非人类哺乳动物或植物，并由所述动物或植物生产可回收的形式的抗体。就哺乳动物中的转基因生产而言，抗体可以在山羊、牛或其他哺乳动物的奶中产生并回收。见例如us5，827，690、US5，756，687、US5，750，172和US5，741，957。进一步，本发明使用的人类或其它抗体可以通过展示型(display-type)技术产生，这类技术包括但不限于噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示和其它技术，使用本领域众所周知的技术，并且可以对所得的分子进行额外的突变，例如亲和性突变，因为这些技术是本领域熟知的(见例如参考文献27，28和30(噬菌体展示)，29(核糖体展示)，31-35和US5，733，743)。如果使用展示技术产生非人类抗体，则这些抗体可以被人源化。如上文解释的，在一些实施方案中，本发明方法中使用的第一和/或第二抗体是IgG4抗体。然而，本发明使用的抗体理论上可以是任何同种型，只要CH3区中的序列允许半分子交换即可。例如，本发明方法中使用或获得的抗体可以包括在SEQIDN0:19-22中显示的任何恒定区序列(在任何指明的突变位置之外)。因此，在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二抗体在核心铰链区中包含CPPC序列。在另一个实施方案中，第一和/或第二抗体包含IgG4-样核心铰链区。例如，在一些实施方案中，所述第一和/或第二抗体是在核心铰链区中包含CX^C序列的抗体，其中\和X2可以是任何氨基酸，但\和X2不能都是脯氨酸。在另一个实施方案中，所述第一和/或第二抗体是在核心铰链区中包含CX3PC或CPX3C序列的抗体，其中x3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。在进一步的实施方案中，所述第一和/或第二抗体是在核心铰链区中包含CSPC、CPSC、CRPC、CPRC、CGHC或CPHC序列的抗体。上述突变可以通过例如本领域众所周知的定点突变来引入。同种型的选择通常由期望的效应功能(例如⑶C诱导作用或ADCC中的活性)来指导。同种型的实例包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(见例如SEQIDNO19-22)。可以使用人轻链恒定区kappa或lambda中的任何一种。如果希望的话，本发明使用的抗体类型可以通过已知的方法加以转换。例如，本发明使用的原本为IgM、IgGl或IgG2的抗体可以被类型转换为本发明的IgG4抗体。因此，本发明抗体的效应物功能可以通过同种型转换而变为例如IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgD，IgA，IgE或IgM抗体，用于各种治疗用途。在一个实施方案中，本发明使用的第一和/或第二抗体是全长抗体。在另一个实施方案中，本发明使用的第一和/或第二抗体是抗体片段。在本发明的方法的一个实施方案中，第一和/或第二抗体包含IgG4CH3区，例如具有图18所示序列(SEQIDNO22)的IgG4CH3区。然而，在本发明的方法的另一个实施方案中，第一和/或第二抗体包含非IgG4同种型的CH3区，其中该CH3区不包含，或者经过了修饰而不包含任何这样的氨基酸残基所述氨基酸残基可以参与和包含相同的CH3区氨基酸序列的其它肽形成二硫键或者共价的或稳定非共价的重链间键。例如，在此处的一个进一步的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有图18所示序列(SEQIDNO19)的CH3区，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换238位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gin(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在一个优选实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列(SEQIDNO19)的CH3区，其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。在另一个实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列(SEQIDNO19)的CH3区，但是其中292位的Lys(K)已被Tyr(ff)或Phe(F)取代。在另一个进一步的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列(SEQIDNO20)的CH3区，其中CH3区已被修饰从而发生了下列氨基酸替换中的一种或多种或者全部5种234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Lys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gin(Q)已被Glu(E)取代；和324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在一个优选的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列(SEQIDNO20)的CH3区，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。在一个进一步优选的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列(SEQIDNO:20)的CH3区，其中234位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；且324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在另一个进一步的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列(SEQIDNO:21)的CH3区，其中CH3区已被修饰从而发生了下列氨基酸替换中的一种或多种或全部10种:285位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys⑷取代；327位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gin(Q)已被Glu(E)取代；352位的Ile(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；和375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在一个优选实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列(SEQIDNO:21)的CH3区，其中285位的Arg(R)已被Gin(Q)取代。在一个优选的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列(SEQIDNO21)的CH3区，其中285位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；且375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在本发明方法的一个进一步的实施方案中，所述第一抗体在核心铰链区中包含CPPC并包含IgG4-样CH3区，且其中所述第二抗体在核心铰链区中包含CPPC并包含IgG4-样CH3区。如上文解释的，在一个主要方面中，本发明涉及一种用于产生双特异性抗体的体外方法，所述方法包括如下步骤a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含IgG4_样CH3区，b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述第二抗体包含IgG4-样CH3区，c)在允许核心铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所述第一和第二抗体，和d)获得双特异性抗体。在本发明方法的一个实施方案中，选择步骤c)中的条件，使得核心铰链区之外不发生显著的二硫桥还原或异构化。在另一个实施方案中，步骤c)中的还原条件是这样的条件所述条件刺激核心铰链区的进行二硫键交换的内在活性。在本发明进一步的实施方案中，步骤c)包括还原剂的添加。在进一步的实施方案中，步骤c)包括添加一种从下组选出的作用剂谷胱甘肽、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、0-巯基乙醇和半胱胺(cysteamine)。在本发明的方法的一个实施方案中，所述作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液的氧化还原势等于(equalto)或者还原性更高于(morereducingthan)在实施例31所述的条件下由1PM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于在实施例31所述的条件下由10yM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由50yM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由0.ImM谷胱甘肽产生的氧化还原势。在进一步的实施方案中，所述作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液的氧化还原势-等于或者还原性更高于在实施例31所述的条件下由1PM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于在实施例31所述的条件下由10PM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由50yM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由O.lmM谷胱甘肽产生的氧化还原势。且-等于或者还原性低于(lessreducingthan)在实施例31所述的条件下由1M谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性低于由lOOmM谷胱甘肽产生的氧化还原势，等于或者还原性低于由15mM谷胱甘肽产生的氧化还原势。在一个实施方案中，其中第一抗体在核心铰链区中具有CPPC序列且/或第二抗体在核心铰链区中具有CPPC序列，优选的是，在步骤c)中产生的溶液的氧化还原势等于或者还原性更高于在实施例35所述的条件下由ImM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由2mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由4mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由6mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由8mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由10mM谷胱甘肽产生的氧化还原势。在进一步的实施方案中，所述还原剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液的氧化还原势-等于或者还原性更高于在实施例35所述的条件下由ImM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由2mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由4mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由6mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由8mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由10mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，且_等于或者还原性更低于于由1M谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性低于由lOOmM谷胱甘肽产生的氧化还原势，等于或者还原性低于由15mM谷胱甘肽产生的氧化还原势。在本发明方法的一个实施方案中，步骤c)包括将所述抗体在还原型谷胱甘肽的存在下在20°C或更高的温度下，例如在37°C下，温育至少一个小时，例如至少2个小时，例如至少5个小时，例如至少10个小时。在本发明方法的进一步的实施方案中，选择步骤c)中的条件，使得用本文所述的大小排阻色谱进行确定时(其中先于起始材料的抗体洗脱的峰表示聚集物的形成)，在所得的组合物中有少于10%，例如少于5%，例如少于2%，例如少于1%的抗体分子处于聚集状态。在本发明的体外方法的一个实施方案中，该方法包括添加具有蛋白质二硫键异构酶活性的蛋白质，例如PDI。在本发明的体外方法的另一个实施方案中，该方法不包括添加具有蛋白质二硫键异构酶活性的蛋白质，例如PDI。在本发明的体外方法的一个实施方案中，该方法不包括添加活细胞或细胞提取物。如上文解释的，本发明方法中使用的第一和第二抗体在结合特异性方面有不同，即结合不同的表位。原则上，任何特异性的组合(anycombinationsofspecificities)均可用作本发明方法的起始材料。另外，本发明的方法并不限于仅以两种不同的抗体作为起始材料。因此，本发明的方法还可以用三种或更多种抗体作为起始材料来实施。在这样的22实施方案中，本发明方法的步骤d)中获得的组合物可以含有多种双特异性抗体。在本发明方法的一个实施方案中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4、CD38或CXCR5，或者针对B细胞受体信号成分CD79a或CD79b，的结合特异性。在另一个实施方案中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4、CD38或CXCR5，的结合特异性；而第二抗体具有针对肿瘤细胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-l、CD19、CD20、CD4或CXCR5，的结合特异性。在一个进一步的实施方案中，第一抗体具有针对erbBl的结合特异性，而第二抗体具有针对erbB2的结合特异性。在另一个实施方案中，第一抗体具有针对CD19的结合特异性，而第二抗体具有针对⑶20的结合特异性。在一个进一步的实施方案中，第一抗体具有针对CD38的结合特异性，而第二抗体具有针对CD34的结合特异性。在一个更进一步的实施方案中，第一抗体具有针对CD4的结合特异性，而第二抗体具有针对CXCR5的结合特异性。在本发明方法的另一个实施方案中，第一抗体具有针对病原微生物的结合特异性。在一个进一步的实施方案中，第一抗体具有针对病原微生物的结合特异性，而第二抗体具有针对效应细胞蛋白，例如⑶3、⑶25、⑶28、⑶16、⑶89、⑶32或⑶1，的结合特异性。双特异性抗体还可以用于将化疗剂更特异性地靶定到该药剂要作用的细胞。因此，在本发明方法的进一步实施方案中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1,CD19、CD20、CD4或CXCR5，的结合特异性，而第二抗体具有针对化疗剂的结合特异性。此外，通过使双特异性抗体包含针对血清蛋白质的结合特异性，可以改变抗体的血清半衰期。例如，可以通过使双特异性抗体包含针对血清白蛋白的结合特异性而延长血清半衰期。因此，在本发明方法的一个进一步的实施方案中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4或CXCR5，的结合特异性，而第二抗体具有针对血液蛋白，例如血清白蛋白，的结合特异性。第二结合特异性还可用于将抗体靶定到特定的组织，例如脑或肝脏。因此，在本发明方法的一个进一步的实施方案中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1,CD19、CD20、CD4或CXCR5，的结合特异性，而第二抗体具有针对脑蛋白如铁传递蛋白，或肝蛋白的结合特异性。而且，第二结合特异性可用于将凝血因子靶定到特定的期望作用位点。例如，具有针对肿瘤细胞的第一结合特异性和针对凝血因子的第二结合特异性的双特异性抗体能够将凝血作用导向肿瘤，从而制止肿瘤生长。因此，在本发明方法的一个进一步实施方案中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、⑶19、⑶20、⑶4或CXCR5，的结合特异性，第二抗体具有针对参与凝血作用的蛋白，例如组织因子，的结合特异性。在本发明进一步的实施方案中，第一和/或第二抗体与从下组选出的化合物相连细胞毒剂；放射性同位素；前药或药物，例如紫杉烷；细胞因子；趋化因子和补体，例如Clq。这些化合物可以使针对靶细胞的杀伤更有效，例如在癌症治疗中。或者，可以将化合物与所得的双特异性抗体偶联，即在发生了半分子交换之后偶联。在本发明方法的进一步的实施方案中，该方法还包括使步骤c)中获得的化合物处于非还原或还原性较低的条件下，以便终止进一步的半分子交换。这可以通过本领域已知的各种方法实现，例如对所得组合物进行透析或者基于大小的色谱，以除去小分子还原剂。在本发明方法的更进一步的实施方案中，通过进行两个半分子的化学交联使所得的双特异性抗体稳定化，从而阻止任何进一步的交换的发生，即便该双特异性抗体随后被用于本会使抗体发生半分子交换的条件，例如体内条件。因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括进一步的步骤a)使铰链区中的半胱氨酸化学交联，例如通过使用含有马来酰亚胺的化合物，例如双马来酰亚胺己烷(bis-maleimidohexane)，b)使半分子上的碳水化合物侧链化学交联，例如通过高碘酸盐(periodate)氧化，随后使醛基与合适的交联剂如己二酸二酰胼(adipinedihydrazide)反应，或c)使CH3区中不对称引入的半胱氨酸交联，例如以Merchant等(36)—文(本文通过提述纳入该文)中描述的方式，例如使用一种或多种如下的组合(援引SEQIDNO19)-第--抗体中的D282C与第二二抗体中的K275C，-第--抗体中的D282S与第二二抗体中的K275S，-第--抗体中的Y232C与第二二抗体中的S237C，-第--抗体中的Y232C与第二二抗体中的D239C，-第--抗体中的Y232C与第二二抗体中的E240C，-第--抗体中的L234C与第二二抗体中的S237C，-第--抗体中的T277C与第二二抗体中的V280C，-第--抗体中的V280C与第二二抗体中的K275C，在进--步的方面中，本发明涉及使通过交联方法，例如上述何一种，获得的或者可以获得的稳定化的双特异性抗体。不论所得的双特异性抗体是否已通过交联被稳定化，本发明的方法，在一些实施方案中，可以进一步包含纯化双特异性抗体的步骤。含有双特异性抗体的混合物可以用标准色谱技术加以纯化，例如(但不限于)标准蛋白A色谱，蛋白G，蛋白L，阳离子/阴离子交换色谱，大小排阻色谱，疏水相互作用色谱，嗜硫(thiophilic)色谱，或使用旨在用于捕获IgG分子的配体(蛋白A模拟物，LlamaVhh配体等)。或者，可以用标准技术沉淀IgG混合物，例如盐促沉淀(硫酸铵)，添加有机溶剂(DMS0，乙醇)，改变pH或非离子聚合物(聚乙二醇)。在另一种情境下，可以使用能浓集IgG分子的膜用过滤技术处理混合物。为了将双特异性抗体纯化到完全同质，可能需要将所有这些技术组合使用，因为某些混合物可能仍然含有非常接近于(nextto)双特异性抗体的亲本IgG分子。然后可能需要额外的纯化步骤以将双特异性抗体与亲本单特异性IgG分子分离开来。这可以通过，例如，先使用针对第一结合亲和特异性的亲和柱进行结合和洗脱，然后使用针对第二结合特异性的亲和柱进行结合和洗脱的纯化方法来实现。在一个优选的实施方案中，特别是在没有实施化学交联的情况下，纯化在可防止进一步半分子交换的条件，例如非还原条件下进行。(纯化的)双特异性抗体的数量、质量和纯度可以用常规的生物化学技术加以分析，这些技术例如吸附测量、HP-SEC、SDS-PAGE、非变性PAGE和RP-HPLC。能够区分双特异性抗体与亲本IgG分子的技术是特别感兴趣的。这些技术的实例包括(但不限于)IEF、cIEF、CIEX和质谱(ESI、MALDI)，它们可以基于电荷和/或质量高精度地分离和检测分子。双特异性抗体的双重结合特异性可以用多种不同的结合测定模式进行估计，例如使用ELISA、RIA、表面等离子体共振(SPR)、生物膜层干扰测定(Boi-layerInterferometry)技术、DELFIA、FRET、ECL、Gyros禾口AlfaScreen。在一个实施方案中，半分子交换可以在有利于形成针对两种目的抗原之一的双特异性抗体的条件下实施。例如，考虑针对抗原X和Y的抗体。如果用过量的针对抗原X的抗体实施交换，例如5倍过量或10倍过量，那么大多数或者全部针对抗体Y的抗体将变成双特异性(即识别抗原X和Y)。在这个步骤之后，可以在基质固定的抗原Y和亲和柱色谱上对双特异性抗体进行纯化。被结合的抗体中高度富集了期望的双特异性抗体。未结合的针对抗原X的抗体可用于重复上述循环。在需要稳定化以防止体内交换的情况下，可以如上所述地对双特异性抗体进行交联。在化学交联之后，可以通过用过量的针对抗原Z的抗体进行额外的交换反应，随后用固定在基质上的抗原Z吸附含有抗Z的抗体(例如通过亲和柱色谱)，将未稳定化的抗体从稳定化的抗体中纯化出来。这样，未结合的组分将含有期望的稳定化双特异性抗体。在本发明方法的一个更进一步的实施方案中，该方法还包括将所得的双特异性抗体配制供治疗应用的步骤。这包括将治疗有效量的双特异性抗体配制在适于人体使用，特别是适合于肠胃外给药，例如静脉内注射的水溶液中。在进一步的方面中，本发明涉及一种产生双特异性抗体的体外方法，所述方法包括如下步骤a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含核心铰链区中的CPPC序列，以及IgG4-样CH3区，b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述第二抗体包含核心铰链区中的CPPC序列，以及IgG4-样CH3区，和c)在允许核心铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所述第一和第二抗体，和d)获得双特异性抗体。优选地，在步骤c)中已经添加了还原剂，其中该作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液的氧化还原势等于或者还原性更高于在实施例35所述的条件下由ImM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由2mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由4mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由6mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由8mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由10mM谷胱甘肽产生的氧化还原势。在一个进一步的方面中，本发明涉及一种组合物，其包含通过本文所述任何一种本发明方法获得或可以获得的双特异性抗体。25在另一个的主要方面中，本发明涉及一种分离的双特异性抗体，其包含两个IgG4-样CH3区。在一个实施方案中，所述抗体在核心铰链区中包含一个或两个CPPC序列。在另一个实施方案中，所述抗体在核心铰链区中包含一个或两个CX1X2C序列，其中X1和X2可以是任何氨基酸，但X1和X2不能都是脯氨酸。在一个进一步的实施方案中，所述抗体在核心铰链区包含一个或两个CX3PC或CPX3C序列，其中X3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。在一个更进一步的实施方案中，所述抗体在核心铰链区包含一个或两个CSPC、CPSC、CRPC或(PRC序列。在所述分离的双特异性抗体的一些实施方案中，第一和/或第二CH3区属于非IgG4同种型，其中该CH3序列不包含，或经过修饰而不包含，任何这样的氨基酸残基所述氨基酸残基可以参与和包含相同CH3区氨基酸序列的其它肽形成二硫键或共价或稳定的非共价重链间键。在其一个进一步的实施方案中，第一和/或第二CH3区具有如图18中所示的序列(SEQIDNO:19)，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换238位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在另一个进一步的实施方案中，所述第一和/或第二CH3区具有如图18中所示的序列(SEQIDNO:20)，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Iys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在一个更进一步的实施方案中，所述第一和/或第二CH3区具有如图18中所示的序列(SEQIDNO:21)，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys(K)取代；327位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；352位的lie(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。在一个更进一步的实施方案中，本发明抗体的第一和/或第二CH3区是IgG4CH3区。在一个更进一步的方面中，本发明涉及一种组合物，例如包含本发明的双特异性抗体或者通过如上所述的任何一种本发明的方法获得或者可以获得的双特异性抗体的药物组合物，其用于作为药物，例如用作治疗癌症或感染性疾病的药物。在一个更进一步的方面中，本发明涉及包含本发明的双特异性抗体或者通过如上所述的任何一种本发明的方法获得或者可以获得的双特异性抗体的组合物用于制备治疗癌症或感染性疾病的药剂的用途。本发明的方法还可用于选择特别令人感兴趣的或有效的靶结合特异性组合(combinationoftargetbindingspecificities)。例如使用本发明的方法,可以由一系列具有不同结合特异性的抗体制备一系列或“阵列”(matrix)不同的双特异性抗体。然后可以测试所得的双特异性抗体系列或阵列的期望的生物学性质，从而选择出最佳的组合。因此，在一个更进一步的方面中，本发明涉及一种用于选择具有期望性质的双特异性抗体的方法，所述方法包括如下步骤a)提供一系列抗体，其中每种抗体均具有不同的靶点特异性(eachantibodyhasadifferenttargetspecificity)，并且其中每种抗体均包含IgG4_样CH3区，b)将所述系列中的每种抗体与所述系列中的另一种抗体在还原条件下一起进行温育，从而产生一系列的抗体混合物，其中每种混合物均包含不同的双特异性抗体(eachmixturecontainsadifferentbispecificantibody),c)测定所得系列抗体混合物的给定的期望性质，和d)选择具有所述期望性质的双特异性抗体混合物。上述方法中的步骤b)可以按照上文关于步骤C)的描述加以实施。在一个实施方案中，所测试的期望性质是肿瘤细胞杀伤。参考文献1.Aalberse,R.C.,R.vanderGaag,andJ.vanLeeuwen.1983.SerologicaspectsofIgG4antibodies.I.ProlongedimmunizationresultsinanIgG4_restrictedresponse.JImmunol130:722.2.vanderZee，J.S.，P.vanSwieten，andR.C.Aalberse.1986.SerologicaspectsofIgG4antibodies.11.IgG4antibodiesformsmall，nonprecipitatingimmunecomplexesduetofunctionalmonovalency.JImmunol1373566.3.Schuurman,J.，R.VanRee，G.J.Perdok，H.R.VanDoom,K.Y.Tan，andR.C.Aalberse.1999.NormalhumanimmunoglobulinG4isbispecific:ithastwodifferentantigen-combiningsites.Immunology97:693.4.Aalberse，R.C.，andJ.Schuurman.2002.IgG4breakingtherules.Immunology105:9.5.Aalberse,R.C.,J.Schuurman,andR·vanRee.1999.TheapparentmonovalencyofhumanIgG4isduetobispecificity.IntArchAllergyImmunol118:187.6.Schuurman，J.，G.J.Perdok,A.D.Gorter,andR.C.Aalberse.2001.Theinter-heavychaindisulfidebondsofIgG4areinequilibriumwithintra-chaindisulfidebonds.MolImmunol38:1·7.Bloom，J.W.，Μ.S.Madanat,D.Marriott，Τ.Wong,andS.Y.Chan.1997.IntrachaindisulfidebondinthecorehingeregionofhumanIgG4.ProteinSci6407.8.Gregory,L.，K.G.Davis,B.Sheth，J.Boyd,R.Jefferis，C.Nave,andD.R.Burton.1987.ThesolutionconformationsofthesubclassesofhumanIgGdeducedfromsedimentationandsmallangleX-rayscatteringstudies.MolImmunol24:821.9.Deng,L.，D.Wylie,Y.S.Tsao,B.Larkin,M.Voloch，andW.L.Ling.2004.DetectionandquantificationofthehumanIgG4half—molecule，HL，fromunpurifiedcell-culturesupernatants.BiotechnolApplBiochem40:261·10.MarcinandZhu(2005)ActaPharmacolSin.2664911.FundamentalImmunologyCh.7(Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,N.Y.(1989))12.ChothiaandLeskT.Mol.Biol.196,901-917(1987)13.Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)14.Kohleretal.,Nature256,495(1975)15.Clacksonetal.,Nature352,624-628(1991)16.Marksetal.，J.Mol.Biol.222,581-597(1991)17.Lonberg,N.etal.，Nature368,856—859(1994)18.Lonberg,N.HandbookofExperimentalPharmacologyl13,49-101(1994)19.Lonberg,N.andHuszar,D.，Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93(1995)20.Harding,F.andLonberg,N.Ann.N.Y.Acad.Sci764536~546(1995)).21.Taylor,L.etal.，NucleicAcidsResearch20,6287-6295(1992)22.Chen,J.etal.，InternationalImmunology旦，647—656(1993)23.Tuaillonetal.，J.Immunol.152,2912—2920(1994)24.Taylor,L.etal.,InternationalImmunology^,579—591(1994)25.Fishwild,D.etal.，NatureBiotechnologyU,845-851(1996)26.Chenetal.，EMBOJ.12,821-830(1993)27.Hoogenboometal.，J.Mol.Biol.227,381(1991)28.Vaughanetal.,NatureBiotechl4,309(1996)29.HanesandPlucthau,PNASUSAM，4937-4942(1997)30.ParmleyandSmith,Gene73,305-318(1988)31.ScottTIBS17,241-245(1992)32.Cwirlaetal.，PNASUSA87,6378-6382(1990)33.Russeletal.,Nucl.AcidsResearch21,1081-1085(1993),34.Hoogenboometal.，Immunol.Reviews週，43-68(1992)35.ChiswellandMcCaffertyTIBTECH10,80-84(1992)36.Merchantetal.(1998)NatureBiotech16:677-68137.Sambrook,Russelletal.2000Molecularcloning.Alaboratorymanual(thirdedition)，ColdSpringHarborLaboratoryPress38.Akkerdaas,vanReeetal.1995Allergy50(3)，215—22039.deGrootetal.1988J.AllergyClin.Immunol.82,778进一步通过如下的实施例进行举例说明本发明，这些实施例不应理解为对本发明的进一步限制。实施例实施例1寡核苷酸引物和PCR扩增寡核苷酸引物由IsogenBioscience(Maarssen，荷兰)合成并定量。引物在H2O中溶解为lOOpmol/μ1，并保存于-20°C。下面给出了全部PCR引物和测序引物的汇总。PCR根据制造商的说明使用PfoTurboHotstartDNA聚合酶(Stratagene，Amsterdam,荷兰)。每个反应混合物含有200μM混合dNTP(RocheDiagnostics，Almere，荷兰)，正向和反向引物各6.7pmol，IOOng基因组DNA或Ing质粒DNAjP1单位PftiTurboHotstartDNA聚合酶，溶于总体积20μ1的PCR反应缓冲液(与聚合酶一起提供)中。PCR反应使用TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra,Goettingen,ΙΗ),it^T32^ififWfM序95°C变性2min、95°C30sec、60-7(TC梯度(或另一特定退火温度)30sec、和72°C3min共30个循环；最后在72°C延伸lOmin。如果合适，将PCR混合物保存于4°C直至进一步的分析或处理。实施例2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳根据Sambrook(37)使用50ml凝胶在IxTris乙酸EDTA缓冲液中进行。通过在凝胶中掺入溴化乙锭，并在UV光下进行观察来使DNA可视化。使用C⑶相机和图像分析系统(GeneGnome；Syngene,viaffestburgB.V.，Leusden，荷兰)记录凝胶图像。实施例3=PCR产物的分析、纯化及酶解使用MinElutePCR提纯试剂盒(Qiagen，viaffestburg,Leusden，荷兰；产品号28006)根据制造商的使用说明提纯期望PCR片段。用UV分光光度计定量分离的DNA，通过琼脂糖凝胶电泳估计品质。或者，使用Tris乙酸EDTA琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳来分离PCR或消化产物(例如当存在多种片段时)，。将期望的片段从凝胶中切下，用QIAEXII凝胶提取试剂盒(Qiagen；产品编号20051)根据制造商的使用说明进行回收。实施例4通过UV分光光度计对DNA进行定量用NanoDropND-1000分光光度计(IsogenLifeScience，Maarssen，荷兰)根据制造商的使用说明测定核酸的光密度。通过分析260nm的光密度(OD)(IOD26tlnm单位=50μg/ml)来测量DNA的浓度。对于所有样品，使用溶解核酸的缓冲液作为参考。实施例5:限制性酶消化限制酶和补充材料系从NewEnglandBiolabs(Beverly,MA,USA)或Fermetas(Vilnius，立陶宛)获得，并根据制造商的使用说明来使用。在最终体积为10μ1(反应体积视需要比例放大)的合适缓冲液中用5单位的酶消化DNA(IOOng)。将消化体系在推荐的温度下温育至少60min。对于需要使用不相容的缓冲液或不同温度要求的限制酶进行双重消化的片段，顺次进行消化。如果需要，通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶提取对消化产物进行纯化。实施例6=DNA片段的连接用QuickLigationKit(NewEnglandBiolabs)根据制造商的使用说明进行DNA片段的连接。对于每个连接体系，将载体DNA与大约3倍摩尔过量的插入DNA进行混合。实施例7大肠杆菌(E.coli)的转化根据制造商的说明使用热激法将质粒DNA(1-5μ1DNA溶液，通常为2μ1DNA连接混合物)转化到OneShotDH5α-TIe或MACH-ITIk感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen，Breda，荷兰；产品编号12297-016)中。接着，将细胞涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上。平板在37°C温育16_18h，直到细菌菌落变得明显。实施例8通过PCR筛选细菌菌落使用HotStarTaqMasterMix试剂盒(Qiagen；产品编号203445)和合适的正向和反向引物(附录1)，通过菌落PCR筛选细菌菌落中含有期望序列的载体的存在。用20μ1吸液管尖端轻轻碰触所选克隆，并2mlLB中短暂碰触以进行小量培养，然后重新悬浮在PCR混合物中。PCR使用TGradientThermocycler96，使用35个循环的程序95°C变性15min；35个循环的94°C30sec、55°C30sec、和72°C2min；然后在72°C进行IOmin的最终延伸步骤。如果合适，将PCR混合物保存于4°C直至通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。实施例9从大肠杆菌培养物分离质粒DNA使用下列的Qiagen产试剂盒(购自Westburg，Leusden,荷兰)根据制造商的说明从大肠杆菌培养物分离质粒DNA。对于大量质粒制备(50-150ml培养物)，使用HiSpeedPlasmidMaxi试剂盒(产品编号12663)或HiSpeedPlasmidMidi试剂盒(产品编号12643)。对于小量质粒制备(士2ml培养物)，使用QiaprepSpinMiniprep试剂盒(产品编号27106)，将DNA洗脱于50μ1洗脱缓冲液(与试剂盒一起提供)中。实施例10=DNA测序质粒DNA用本领域已知的标准程序进行测序。使用VectorNTI软件(Informax，Oxford,UK)进行序列分析。实施例11在HEK-293F细胞中瞬时表达从Invitrogen获得Freestyle293-F(—种适于悬浮生长和化学限定Freestyle培养基的HEK-293亚克隆，例如HEK-293F)细胞，并用293fectin(Invitrogen)根据制造商的规程进行转染。实施例12:PTomG4,一种用于表达可变重链区和人IGG4恒定区的载体，的构建从一名志愿者血液样品中分离基因组DNA，用其作为模板，使用引物IGG4gene2f和IGG4gene2r(见下表)PCR扩增IgG4重链的完整基因组恒定区，同时引入合适的用于克隆进入哺乳动物表达载体PEE6.4(L0nzaBi0l0giCS)的限制位点。对PCR片段进行纯化并克隆到pEE6.4中。为此，用Hindi11和EcoRI消化PCR产物，随后将限制酶热失活。用Hindi11和EcoRI消化pEE6.4载体，随后将该限制酶热失活，并用虾碱性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase)使载体片段去磷酸化，随后将该磷酸酶热失活。连接IgG4片段和pEE6.4Hindlll/EcoRI去磷酸化载体，并转化进入感受态MACHI-TIk细胞(Invitrogen)。使3个克隆在LB中生长，并从小培养物(1.5mL)分离质粒DNA。限制性消化显示出与将IgG4片段克隆到PEE6.4载体中一致的模式。将来自2个克隆的质粒DNA转化进入DH5α-TIk大肠杆菌，分离质粒DNA，并通过分析插入物的序列对构建体进行检查，发现一个克隆与一种来自Genbank数据库的基因组IgG4克隆相同，只是在内含子中有一些微小差异。这些差异可能是由于多态性或者Genbank序列的序列错误导致的。将该质粒命名为pTomG4。表1:引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>实施例13小鼠抗Betvl抗体和抗Feldl抗体可变区的克隆用RNeasy试剂盒(Qiagen，ffestburg,Leusden，荷兰)根据制造商的方案从0.3xl05(Betvl)或0.9xl05(Feldl)小鼠杂交瘤细胞(对于Betvl来自参考文献38的克隆2H8，对于Feldl来自参考文献39的克隆4F7)制备总RNA。使用SMARTRACEcDNAAmplification试剂盒(BDBiosciencesClontech,MountainView，CA，USA)，根据制造商的方案从大约IOOng总RNA制备RNA的5，-RACE-互补DNA(cDNA)。通过PCR扩增Betvl和Feldl抗体的VL和VH区。为此，根据制造商的说明使用PiliTurboHotStartDNA聚合酶(Stratagene)。每个反应混合物含有200μM混合dNTP(RocheDiagnostics)，12pmol反向引物(用于VH区的RACEGlmml，用于VL区的RACEKmml)，7.2pmolUPM-Mix(UPM-Mix:2μMShortUPMH3禾口0·4μMLongUPMH3寡核苷酸)，0.6μ1如上所述的5，RACEcDNA模板，和1.5单位PfbTurboHotstartDNA聚合酶，溶于总体积为30μ1的PCR反应缓冲液(与聚合酶一起提供)中。PCRSiS^ffiTGradientThermocycler96(WhatmanBiometra)it^T^tffl35循环的程序95°C变性2min；35个循环的95°C30sec，55°C30sec，和72°C1.5min；最后在72°C延伸lOmin。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳在TAE琼脂糖凝胶上进行分离，并用溴化乙锭染色。从凝胶上切下大小正确的条带，用QiaexII凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖中分离DNA。将凝胶分离的PCR片段与200μMdATP和2.5单位Amplitaq(PerkinElmer)在72°C温育IOmin以添加A尾巴，并用微型洗脱柱(Qiagen)进行纯化。使用pGEMTeasy载体系统II试剂盒(Promega)按照制造商的方案将添加了A尾巴的PCR片段克隆到pGEMTeasy载体(Promega)中。将2μ1连接混合物转化到OneShotDH5αTlR感受态大肠杆菌(Invitrogen)中，并涂布在LB/Amp/IPTG/Xgal平板上。为每个VH和VL序列挑取4个含有插入序列的白色克隆，并对插入序列进行测序。SEQIDNO:15和16给出了BetvlVH和VL的推导氨基酸序列，SEQIDNO17和18给出了Feldl的推导氨基酸序列。VH序列Betvl(SEQIDNO15)mkcswviffImavvtgvnsevqlqqsgaelvkpgasvklsctasgfnikdtyihffvkqrpeqglewvgridpatgntrydpkfqgkatitadtssntayIqlssItsedtavyycasfrpgyaldywgqgtsvtvssVL序列Betvl(SEQIDNO16)mesqiqafvfvflwlsgvdgdivmtqshkfmstsvgdrvsftckasqdvftavawyqqkpgqspklliywastrrtgvpdrftgsgsgtdytltissvqaedlalyycqqhfstpptfgggtkleikVH序列Feldl(SEQIDNO17)mgwsyiiIflvatatdvhsqvqlqqpgaelvkpgasvklsckasgysftsywmhwlkqrpgqglewigeinpnngrtyynekfktkatltvdkssstaymqlnsltsedsavyycarrltmvesfaywgqgtlvtfsaVL序列Feldl(SEQIDNO18)mesqtqvlmsllfwvsgtcgdivmtqspssltvtagekvtmsckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppklliywastresgvpdrftgsgsgtdfsltissvqaedlaiyycqndysypftfgsgtkleik实施例14=PConGlfBetVl用于产生Betvl-IgGl重链的载体的构建使用引物VHexbetvlfor和VHexbetvlrev从含有小鼠抗BetVl抗体的乂11编码区的质粒(实施例13)中PCR扩增该区，同时引入用于克隆到pConGlfO.4中的合适的限制性位点和理想的Kozak序列。凝胶纯化VH片段并克隆到pConGlf0.4中。为此，用Hindi11和ApaI消化PCR产物和pConKappaO.4载体并加以纯化。将VH片段和pConGlfO.4HindIII-ApaI消化载体加以连接，并转化到感受态DH5α-TIe细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并确认正确的序列。将该质粒命名为pConGlfBetvl。实施例15:pConKBetvl用于产生Betvl轻链的载体的构建使用引物VLexbetvlfor和VLexbetvlrev从含有小鼠抗BetVl抗体的\编码区的质粒(实施例13)中扩增该区，同时引入用于克隆到pConKO.4中的合适的限制性位点和理想的Kozak序列。用HindIII和BsiWI对PCR产物和pConKappaO.4载体进行消化，并加以纯化。将Vl片段和pConKappaO.4HindIII-BsiffI消化的载体加以连接，并转化到感受态DH5α-TIk大肠杆菌中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并对序列进行确认。将该质粒命名为pConKBetvl。实施例16:pTomG4Betvl用于产生Betvl_IgG4重链的载体的构建为了构建用于表达Betvl_IgG4的载体，将BetVl的VH区克隆到pTomG4中。为此，用HindIII和ApaI消化pTomG4和pConGlfBetvl，并分离相关片段。将BetvlV11片段和PTomG4HindIII-ApaI消化的载体加以连接，并转化到感受态DH5α-TIe细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并确认序列。将该质粒命名为pT0mG4BetVl。实施例17=PConGlfFeldl用于产生Feldl-IgGl重链的载体的构建使用引物VHexfeldlfor和VHexfeldlrev从含有小鼠抗Feldl抗体的Vh编码区的质粒(实施例13)中PCR扩增该区，同时引入用于克隆到pConGlfO.4中的合适的限制性位点和理想的Kozak序列。将VH片段进行凝胶纯化并克隆到pConGlfO.4中。为此，用HindIII和ApaI对PCR产物和pConKappaO.4载体进行消化，并进行纯化。将Vh片段和pConGlfO.4HindIII-ApaI消化的载体进行连接，并转化到感受态DH5α-TIe细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并确认序列。将该质粒命名为pConGlfFeldl。实施例18=PConKFeldl用于产生Feldl轻链的载体的构建使用引物VLexfeldlfor和VLexfeldlrev从含有小鼠抗Feldl抗体的\编码区的质粒(实施例13)中通过PCR扩增该区，同时引入用于克隆到pConKO.4中的合适的限制性位点和理想的Kozak序列。用HindIII和BsiWI对PCR产物和pConKappaO.4载体进行消化，并加以纯化。将\片段和pConKappaO.4HindIII-BsiffI消化的载体加以连接，并转化到感受态DH5α-TIk大肠杆菌中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并确认序列。将该质粒命名为pConKFeldl。实施例19:pTomG4Feldl用于产生Feldl_IgG4重链的载体的构建为了构建用于表达Feldl-IgG4的载体，将Feldl的VH区克隆到pTomG4中。为此，用HindIII和ApaI对pTomG4和pConGlfFeldl进行消化，并分离相关片段。连接FeldlV11片段和pT0mG4HindIII-ApaI消化的载体，并转化到感受态DH5α-TIe细胞中。选择含有正确插入序列大小的克隆，并确认序列。将该质粒命名为pTomG4Feldl。实施例20用于表达2F8_IgG4和7D8_IgG4的抗体表达载体的构建构建了用于表达HuMab2F8(IgGl-EGFR)和HuMab7D8(IgGl_CD20)的表达载体。将HuMab2F8(W002/100348)和HuMab7D8(W004/035607)的VH和VL编码区克隆到用于产生IgGl重链的表达载体pConGlf(LonzaBiologics)和用于产生kappa轻链的pConKappa中，产生载体PConG1f2F8、pConG1f7D8、pConKappa2F8和pConKappa7D8。通过HindIII/ApaI消化从pConGlf2F8和pConGlf7D8中移出这些载体的VH区，并插入到Hindlll/Apal消化的pTomG4载体中，分别产生pTomG42F8和pTomG47D8。实施例21通过在HEK-293F细胞中进行瞬时表达产生Betvl-IgGl、Betvl_IgG4、Feldl-IgGl和Feldl_IgG4根据制造商的使用说明，使用293feCtin在HEK-293F细胞中共转染相关的重链和轻链载体，以从所有构建体产生抗体。对于Betvl-IgGl，共表达pConGlBetvl和pConKBetvl。对于Betvl_IgG4，共表达pTomG4Betvl和pConKBetvl。对于Feldl-IgGl，共表达pConGlFeldl和pConKFeldl。对于Feldl_IgG4，共表达pTomG4Feldl和pConKFeldl。对于IgGl-EGFr，共表达pConGlf2F8和pConKappa2F8。对于IgG4_EGFr，共表达pTomG42F8和pConKappa2F8。对于IgGl_CD20，共表达pConGlf7D8和pConKappa7D8。对于IgG4_CD20，共表达pTomG47D8禾口pConkappa7D8。实施例22=IgGl和IgG4抗体的纯化通过蛋白A亲和色谱纯化IgGl和IgG4抗体。用0.20μM盲端滤膜(dead-endfilter)过滤细胞培养上清，随后上样到5ml蛋白A柱(rProteinAFF,GEHealthvcare)上，并用0.IM柠檬酸-NaOH，pH3对IgG进行洗脱。洗脱物立即用2MTris-HCl,pH9中和，并对12.6mM磷酸钠，140mMNaCl，ρΗ7·4(B.Braun，Oss，荷兰)中过夜透析。透析后，用0.20μM盲端滤膜进行无菌过滤。经纯化的IgG的浓度通过浊度测定法和280nm吸光度加以测定。纯化的蛋白通过SDS_PAGE、IEF、质谱和糖分析(Glycoanalysis)进行分析。实施例23经纯化的IgG的SDS-PAGE分析提纯之后，对Betvl和Feldl，IgGl和IgG4抗体进行非还原性SDS-PAGE分析。所用的Bis-Tris电泳方法是Laemmli方法的修改形式(Laemmli1970Nature227(5259)680-5)，其中样品在中性pH下运行。SDS-PAGE凝胶用考马斯染色，并用GeneGenius(Synoptics,Cambridge,UK)进行数字成像。如图1所示，Betvl和FeldlIgGl显示1条主带，代表全长四聚体型(2条重链和2条轻链)Feldl和BetvlIgGl分子。Betvl和FeldlIgG4除了代表四聚体IgG4分子的主带之外，还显示有相当量的半分子(即一条重链和一条轻链)。实施例24小鼠中IgG4半分子交换的估计使用5只6-8周龄nu/nuBalb/c小鼠来追踪IgG4半分子交换。将小鼠圈养在中央实验动物设施(CentralLaboratoryAnimalFacility)(Utrecht，荷兰)的屏障单位(barrierunit)中，置于滤盖笼(filter-topcages)内，水和食物自由摄取。所有的实验均得到Utrecht大学动物伦理委员会的批准。腹膜内施用嵌合抗体。在施用后4.25小时、24小时、48小时和72小时采取血液样品(75-100μ1)。将血液收集在含有肝素的小瓶中，并在10.OOOg离心5分钟以分离血浆和细胞。将血浆保存在_20°C，用于确定抗原特异性抗体和双特异性抗体水平。在本实验中，将嵌合IgG4半分子(η=2)的交换与IgGl半分子(η=3)的交换相比较。将Betvl和Feldl特异性抗体(IgGl或IgG4)的混合物以每只小鼠200μ1计600μg(每种抗原特异性抗体300μg)的剂量施用给小鼠。在抗原结合试验中测量Betvl或Feldl结合性抗体的血浆浓度。为此，将血浆样品与0.75mg蛋白GSepharose(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)温育在750μ1PBS-IAT(PBS添加lyg/mlIVIg，0·3%牛血清白蛋白，0·1%Tween-20和0·05%(w/v)NaN3)中，在125I标记的Betvl或125I标记的Feldl存在条件下温育24h。接着，用PBS-T(PBS添加0.1%Tween-20和0.05%(w/v)NaN3)清洗S印harose，测量结合的放射性的量相对于添加的放射性的量的比。用纯化的Betvl特异性抗体或Feldl特异性抗体作为标准(每个试验的范围0-200ng，由浊度测量法确定)计算Betvl或Feldl特异性IgG的浓度。双特异性IgG的浓度在异源交联测定的两种变型中加以测量。在第一种测定中，在总体积300μ1的PBS-IAT中将血浆与S印harose偶联的Betvl(0.5mg)温育24h。随后，用PBS-T清洗S印harose，并与125I标记的Feldl温育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，测量结合的放射性的量相对于所添加放射性的量。用Feldl结合试验的校正曲线计算双特异性IgG(Betvl-Feldl)的浓度，该校正曲线是由纯化的Feldl结合性rlgG获得的。在第二种测定中，使用S印harose偶联的rFeldl(0.5mg)和125I标记的Betvl通过相似的程序测量Feldl-Betvl交联活性。用纯化的Betvl特异性rlgG作为标准(与Betvl结合试验中的曲线相同)计算双特异性IgG(Feldl-Betvl)的浓度。在图2中，双特异性IgG(Feldl-Betvl)的浓度相对于不同时间点上的Betvl结合性IgG的浓度作图。与给予IgG4的小鼠形成对照的是，给予IgGl混合物的小鼠体内没有观察到双特异性IgG。24h后，双特异性IgG4的产生达到最大，对应于100%交换。在图3A中，随时间追踪双特异性人IgG4的形成。在注射了IgG4而非IgGl的混合物的小鼠血浆中经过一段时间出现了双特异性抗体，双特异性反应力在温育1-2天后达到最大值即大约50%(注意如果等量的IgG4-Betvl和IgG4-Feldl被交换，在半抗体的随机和完全交换之后最多会有50%的IgG4-Betvl半抗体被掺入到双特异性部分中)。等量的IgG4-Betvl和IgG4_Feldl之间的随机Fab臂交换可相当于大约一半的IgG4分子获得双特异性。作为对照，将20倍过量的针对无关抗原的IgG4(从抗EGFr抗体2F8产生的IgG4)与IgG4_Betvl和IgG4_Feldl—起注射到小鼠体内。过量的无关IgG4与Betvl-Feldl双特异性IgG4的产生相竞争。在另一个实验中(图3B)，对相同的小鼠血浆样品测试其将放射性标记的可溶性Feldl交联到S印harose固定的Feldl上的能力。结果发现，在给予等量IgG4而非IgGl混合物的小鼠体内单特异性交联活性被降低，表明单特异性交联活性的损失。在大约1天后，达到最大减少即50%。在给予额外的过量无关IgG4的小鼠体内，单特异性交联活性以相似的动力学几乎完全消失。进行大小排阻色谱以排除在给予IgG4的小鼠体内观察到的双特异活性是IgG聚集的结果的可能性(见图4)。为此，将血浆样品(在t=24h获取)在Superdex200柱上分级，之后测量级分中的Feldl结合性IgG和Betvl-Feldl交联性IgG。Feldl结合性抗体洗脱出一个峰，保留体积为12.9ml，其对应于单体IgG的保留体积。在相同的级分中检测到了异源Betvl-Feldl交联活性，表明双特异活性与单体IgG有关。在含有rlgGl的血浆中，在分级之前不存在Betvl-Feldl交联活性。同样，在洗脱的级分中，没有测量出异源交联活性(数据未显示)。实施例25评估全血(成分)中的交换活性将嵌合抗体混合，随后与全血、血细胞、血浆或血清温育，以研究全血(成分)的交换活性。在本实验中，对来自两个健康血液供体A和B的全血中的IgG4半分子的交换进行评估，所述全血中IgG4的内源血浆水平通过浊度测量加以确定(分别为346和554μg/ml)。将全血采取在添加有终浓度为40μg/ml的TFPI(组织因子通道抑制剂，来自ChironCorporation,Emeryville,California)的采血管中。通过全血离心获得血细胞和血浆。将细胞级分用Optimem(Invitrogen，Breda，荷兰)清洗3次，随后重悬在Optimem中。将全血在含有促凝剂的玻璃采血管中37°C温育30min，之后将凝血离心下来，获得血清。评估IgG4半分子的交换，并与IgGl半分子的交换进行比较。作为对照，还将血液样品在没有嵌合抗体的条件下进行温育。在PBS中制备如下的抗体混合物1.Betvl特异性IgG4(10μg)和Feldl特异性IgG4(10μg)2.Betvl特异性IgGl(10μg)和Feldl特异性IgGl(10μg)将这些抗体混合物与血液、血细胞、血浆或血清一起在水平回转振荡器(125rpm)上37°C温育，总体积为100μ1(每种抗体的终浓度为0.1μg/ml)。与全血或血细胞的温育混合物中的最终血细胞比容为大约40%。24h后，将温育混合物在Eppendorf离心机中以2800rpm离心lmin，之后吸取10μ1样品至500μ1PBS-AT(PBS添加0.3%牛血清白蛋白，0.Tween-20和0.05%(w/v)NaN3)中。如果需要，将样品存储在4°C。在异源交联测定中测量双特异活性(即Feldl-Betvl交联活性)。在此测定中，将样品与0.5mgSepharose偶联的重组Feldl在总体积为300μ1的PBS-IAT(PBS-AT添加1μg/mlIVIg)中温育24h。随后，用PBS-T清洗Sepharose,并与125I标记的Betvl温育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，并测量结合的放射性的量相对于所添加放射性的量。在图5中，双特异活性用结合的125I标记Betvl的百分比表示，其是在异源交联测定中加以确定的。双特异活性是IgG4半分子交换的量度。IgG4半分子交换主要在全血和全血的细胞级分中观察到(图5a)。细胞级分中的双特异性水平甚至高于全血。对于这一点最有可能的解释是，在细胞级分中，内源IgG4-其也能够与所添加的嵌合IgG4抗体发生交换-不再存在了。在血浆和血清中也能够观察到一些双特异活性，但是这个活性远远低于在血浆中观察的水平，仅略高背景水平1.7%，后者是通过在Optimem中温育IgG4混合物获得的。在任何含IgGl的温育物中均没有观察到双特异活性(图5b)。同样在没有嵌合抗体的对照温育物中，也没有观察到双特异活性(图5c)。进行了大小排阻色谱以排除在IgG4混合物中观察到的双特异活性是IgG聚集的结果的可能性。为此，将样品(在t=24h获取)在Superdex200柱上分级，然后测量级分中的Feldl结合性IgG和Betvl-Feldl交联性IgG。Feldl结合抗体洗脱出一个峰，保留体积为12.9ml，其对应于单体IgG的保留体积。在相同的级分中检测到了异源的Betvl-Feldl交联性活性，表明双特异活性与单体IgG有关(数据未显示)。实施例26评估血细胞介导的IgG4交换活性将嵌合抗体混合，随后与三个不同类型的人血细胞(即单个核细胞(MNC)、红细胞和血小板)温育，以研究IgG4的交换活性。将来自一个匿名供体的全血抽入含有肝素的采血管中，随后在Percoll(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden)巾MNC。白勺MNC重悬在Optimem无血清培养基(Invitrogen，Breda，荷兰)中备用。新鲜纯化的血细胞和血小板(由BloodCellResearchDepartmentofSanquin提供)获自两个不同的匿名供体。这些细胞在清洗3次之后也重悬在Optimem中。此外，向血小板中补充IOmM葡萄糖。评估IgG4半分子的交换，并与IgGl半分子的交换进行比较。在PBS中制备了如下的抗体混合物-Betvl特异性IgG4(10yg)和Feldl特异性IgG4(10yg)-Betvl特异性IgGl(10μg)和Feldl特异性IgGl(10μg)在水平回转振荡器(125rpm)上将这些抗体混合物下与1.8xl04的MNC，4.OxlO8的红细胞或3.5xl04的血小板(每种抗体的终浓度均为0.1μg/ml)在100μ1总体积中于37°C温育。48h后，将温育混合物在Eppendorf离心机中以2800rpm离心lmin，之后吸取10μ1样品至500μ1PBS-AT(PBS添加0.3%牛血清白蛋白，0.1%Tween-20和0.05%(w/ν)NaN3)中。如果需要，将样品保存在4°C。在异源交联测定中测量双特异活性(即Feldl-Betvl交联活性)。在此测定中，将样品与0.5mgSepharose偶联的重组Feldl在PBS-IAT(PBS-AT添加1μg/mlIVIg)中(总体积为300μ1)温育24h。随后，用PBS-T清洗Sepharose,并与125I标记的Betvl温育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，并测量结合的放射性的量相对于所添加放射性的量。在图6中，双特异活性用结合的125I标记Betvl的百分比显示，其是在异源交联测定中测得的。所有三种细胞类型均能够诱导双特异活性。在Optimem无血清培养基中也可观察到一些双特异活性，但是这个活性远远低于有血细胞存在时观察到的水平。所有测试细胞均不能交换IgGl半分子。实施例27通过人和小鼠细胞系评估IgG4交换将嵌合IgG4抗体混合，然后与三个不同的细胞系(即人胚胎肾(HEK)细胞、小鼠B细胞或杂交瘤)温育，以研究IgG4的交换活性。J558(SAntigenPresentationResearchGroupofSanquin作为小鼠B细胞来源。产生抗Cl酯酶抑制剂的杂交瘤获自AutoimmuneResearchGroupofSanquin。悬浮HEK(293F)细胞从Invitrogen，Breda，荷兰获得。所有细胞用PBS清洗3次，之后将细胞重悬在PBS中。通过将含有Betvl特异性IgG4(2μg)和Feldl特异性IgG4(2μg)的抗体混合物与前述细胞一起温育评估IgG4半分子的交换。将抗体混合物在水平回转振荡器(125rpm)上与24xl05HEK细胞、25x10s小鼠B细胞或21xl05杂交瘤在50μ1总体积中(每种抗体的终浓度为80μg/ml)37°C温育。Oh和24h后，将温育混合物在Eppendorf离心机中以2800rpm离心lmin，之后吸取样品至PBS-AT(PBS添加0.3%牛血清白蛋白，0.1%Tween-20和0.05%(w/v)NaN3)中。如果需要，将样品保存在4°C。在异源交联测定中测量双特异活性(即Feldl-Betvl交联活性)。在此测定中，将样品的稀释物与0.5mgSepharose偶联的重组Feldl在PBS-IAT(PBS-AT添加1μg/mlIVIg)中(总体积为300μ1)温育24h。然后，用PBS-T清洗Sepharose,并与125I标记的Betvl温育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，并测量结合的放射性的量相对于所添加放射性的量。在图7中，双特异活性用结合的125I标记Betvl的百分比显示，其是在所述异源交联测定中确定的。所有三种细胞类型均能够交换IgG4半分子。实施例28红细胞介导的IgG4半分子交换的评估将嵌合抗体混合，然后与人红细胞温育，以研究IgG4半分子的交换。从单个供体纯化红细胞，并在SAGM(盐水、腺苷、葡萄糖、甘露醇)缓冲液中于4°C保存。使用之前，用PBS清洗细胞3次。在本实验中，将IgG4半分子的交换与IgGl的交换进行比较。另外，对在过量无关IgG4存在下的IgG4交换进行评估。在PBS中制备如下的抗体混合物-Betvl特异性IgG4(4μg)和Feldl特异性IgG4(4μg)-Betvl特异性IgGl(4μg)和Feldl特异性IgGl(4μg)-Betvl特异性IgG4(4yg),Feldl特异性IgG4(4yg)和对抗原X特异的无关IgG4(80μg)将这些混合物与红细胞在总体积100μ1的添加有0.05%(w/v)NaN3的PBS中(最终的血细胞比容为大约40%)温育，然后在水平回转振荡器(125rpm)上37°C温育。在示明的时间点，在Eppendorf离心机中以2800rpm对红细胞离心lmin，之后吸取10μ1样品到500μ1PBS-AT(添加70.3%牛血清白蛋白，0.1%Tween-20和0.05%(w/v)NaN3的PBS)中。在测量双特异活性、二价性和抗原结合之前将样品保存于4°C。作为对照，还将相同的混合物温育在没有红细胞的PBS中。在抗原结合试验中测量Betvl结合性抗体的水平。为此目的，在125I标记Betvl的存在下，将样品在750μ1PBS-IATn^WT1μg/mlIVIg的PBS-AT)中与0.75mg蛋白GSepharose(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)一起温育24h。接着，用PBS-T(添加了0.Tween-20和0.05%(w/v)NaN3的PBS)清洗S印harose，并测量结合的放射性的量相对于所添加放射性的量。用纯化的Betvl特异性抗体(每个试验的范围是0-200ng，用浊度计确定)作为标准品计算Betvl特异性IgG的浓度。对于使用Feldl和Betvl双特异性抗体的实验中的双特异活性，在Feldl-Betvl交联测定中加以测量。在该测定中，将含有IgG的样品与S印harose偶联的cat提取物(0.5mg)在总体积300μ1的PBS-AT中温育24h。然后，用PBS-T清洗S印harose，并与125I标记的Betvl温育24h，然后用PBS-T清洗S印harose，并测量结合的放射性的量相对于所添加的放射性的量。用纯化的IgGl-Betvl(在Betvl结合试验中利用蛋白GSepharose获得的)作为标准计算双特异性IgG(Feldl-Betvl)的浓度。在图8中，提供了从红细胞介导的交换获得的数据。在红细胞存在下，没有观察到IgGl半分子的交换，而在72h后观察到大约最大的IgG4半分子交换(图A)(注意如果等量的IgG4-Betvl和IgG4-Feldl被交换，则在随机和完全的半分子交换之后，最多有50%的IgG4-Betvl半抗体会被掺入到双特异性级分中)。在过量的无关IgG4的存在下，基本上没有测量到IgG4半分子的交换，这与预期的Betvl与Feldl特异性IgG4与无关IgG4的交换相符。进行了大小排阻色谱以排除在IgG4混合物中观察到的双特异活性是IgG聚集的结果的可能性。为此，将样品(在t=72h获取)在SuperdeX200柱上进行分级，然后测量级分中的Feldl结合性IgG和Betvl-Feldl交联性IgG。Feldl结合抗体洗脱为一个峰，保留体积为12.9ml，其对应于单体IgG的保留体积。在相同的级分中检测到了异源Betvl-Feldl交联活性，表明双特异活性与单体IgG有关(数据未显示)。理论上，IgG4半分子的交换也伴随着二价性的降低。为了检验这一点，对温育混合物中的二价性进行测量。在IgGl混合物中基本上没有观察到Feldl二价性降低，而在IgG4混合物中观察到了50%的降低。这种降低与按照11比例混合的两个不同IgG4分子的最大交换是相符的。与预期的一样，在存在过量的无关IgG4时IgG4混合物中的二价性降低得更多(80%)，这是由于存在过量的无关IgG4半分子时，两个同源半分子(Betvl或Feldl特异)发生重新杂交的可能性降低。二价性的强烈降低不是由于温育期间抗原结合丧失的结果，因为抗原结合在温育72h之后只有微弱的降低(10%)(数据未显示)。同时评估了IgG在PBS(添加了0.05%(w/v)NaN3)中的交换，以研究IgG4半分子是否能够自发交换。该实验的条件与有红细胞存在时的交换相似，只是没有添加红细胞。在PBS中37°C温育期间没有观察到IgGl或IgG4半分子的自发交换，如图9A所示。然而，在IgG4混合物中观察到一些背景，该背景在与红细胞温育的期间也存在。在PBS中温育期间没有观察到二价性降低(图9B)。实施例29红细胞裂解物介导的IgG4交换的评估将嵌合IgG4抗体混合，然后与稀释度递增的红细胞裂解物温育。从健康供体分离红细胞，并在SAGM(盐水、腺苷酸、葡萄糖、甘露醇)缓冲液中保存于4°C，血细胞比容为60.7%。为了获得裂解物，用PBS-叠氮化物(PBS中添加0.05%(w/v)NaN3)清洗细胞3次，并重悬在体积二倍于存储缓冲液的体积的水中。结果，未稀释的红细胞裂解物相当于血细胞比容为30%。通过将由Betvl特异性IgGA(Iyg)和Feldl特异性IgG4(1μg)的IgG4组成的抗体混合物与50μ1新鲜制备的裂解物(添加PBS/叠氮化物到总体积为100μ1)在37°C—起温育进行IgG4半分子交换的评估。每种抗体的最终浓度为10μg/ml。在示明的时间点，从温育混合物采取样品至PBS-AT(PBS添加0.3%牛血清白蛋白，0.1%Tween-20和0.05%(WZV)NaN3)中以测量双特异活性。如果需要，将样品保存于4°C。双特异活性(即Betvl-Feldl交联性活性)的测量在异源交联测定中进行。在该测定中，样品稀释物与0.5mgS印harose偶联的桦木提取物(birchextract)在总体积为300μ1的PBS-IAT(PBS-AT中添加μg/mlIVIg)中温育24h。然后，用PBS-T清洗Sepharose,并与125I标记的Feldl温育24h，然后用PBS-T清洗S印harose，并测量结合的放射性的量相对于所添加的放射性的量。双特异性IgG(Betvl-Feldl)的浓度用Feldl结合试验的校正曲线加以计算，该标准曲线是用纯化的Feldl结合性rlgG获得的。在图10中，经时(intime)的双特异活性产生用结合的125I标记Feldl的百分比来表示，后者是在异源交联测试中确定的。从这些数据显然可见红细胞的裂解物含有交换活性。在未稀释的裂解物中观察到最高的交换速度，而稀释度越高，交换速度越低。在PBS中进行的对照温育中几乎没有观察到双特异活性。实施大小排阻色谱以排除红细胞裂解物所诱导的双特异活性是IgG聚集的结果的可能性(图11)。为此目的，制备温育混合物，其由IOygBetvl结合性IgG4、10μgFeldl结合性IgG4和50μ1红细胞裂解物组成，并添加PBS/叠氮化物到最终体积为100μ1。将该混合物在37°C温育24h，然后将70μ1在Superdex200柱上进行分级。在级分中，测量Betvl结合性IgG和Feldl-Betvl交联性IgG。在抗原结合试验中测量Betvl结合性抗体的水平。将样品与0.75mg蛋白GSepharose(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)一起在125I标记的Betvl的存在下，在750μ1PBS-IAT(PBS添加1μg/mlIVIg、0.3%牛血清白蛋白、0.Tween-20和0.05%(w/v)NaN3)中温育24h。接着，用PBS-T(PBS添加0·1%Tween-20和0.05%(w/v)NaN3)清洗S印harose，并测量已结合的放射性的量相对于所添加放射性的量。使用纯化的Betvl特异抗体作为标准(每个试验的范围是0-200ng，用浊度计确定)计算Betvl特异IgG的浓度。在异源交联测定中测量双特异IgG的浓度(即Feldl-Betvl交联活性)。在该测定中，将样品在总体积300μ1的PBS-IAT中与0.5mg的S印harose偶联cat提取物(其中存在Feldl抗原)温育24h。然后，用PBS-T清洗S印harose，并与125I标记的Betvl温育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，并测量已结合的放射性的量相对于所添加的放射性的量。双特异性IgG(Feldl-Betvl)的浓度的计算使用与Betvl结合试验中所用相同的校正曲线，其是由纯化的Betvl结合性rlgG获得的。Betvl结合抗体在一个峰内洗脱，保留体积为12.6ml，对应于单体IgG的保留体积(图11)。在相同的级分中检测到了异源Feldl-Betvl交联活性，表明双特异活性与单体IgG有关。实施例30经过透析的红细胞裂解物中IgG4交换的评估从健康供体分离红细胞，并以60.7%的血细胞比容在SAGM(盐水、腺苷酸、葡萄糖、甘露醇)缓冲液中保存于4°C。为了获得裂解物，用PBS-叠氮化物(PBS中添加0.05%(w/v)NaN3)清洗细胞3次，并重悬在体积2倍于存储缓冲液的体积的水中。因此，未稀释的红细胞裂解物相当于血细胞比容为30%。将一部分裂解物用Pierce产的透析膜盒(3.5kD截留)对PBS-叠氮化物进行透析。将未透析的裂解物在Amicon过滤器(3.5kD截留)中进行离心，获得超滤液。通过将IgG4抗体混合物(Betvl特异性IgG4(0.5μg)和Feldl特异性IgG4(0.5yg))与新鲜制备的红细胞裂解物(25μ1)或经透析的裂解物(25μ1)在37°C一起温育来评估IgG4半分子的交换。每个温育体系的总体积为50μ1，这样每种抗体的终浓度为10yg/ml。使用如下的添加物Sigma产的还原型谷胱甘肽(GSH)，葡萄糖-6磷酸(G-6-P)和NADPH(均由Roche产)。这些化合物在使用之前溶解于水中。温育24h后，从温育混合物采取样品到PBS-AT(PBS添加0.3%牛血清白蛋白、0.1%Tween-20和0.05%(w/ν)NaN3)中，以测量双特异活性。如果需要，将样品保存于4°C。在异源交联测定中测量双特异活性(即Betvl-Feldl交联活性)。在该测定中，将样品稀释物与0.5mg的S印harose偶联cat提取物在总体积为300μ1的PBS-IAT(PBS-AT添加μg/mlIVIg)中温育24h。然后，将Sepharose用PBS-T清洗，与125I标记的Feldl温育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，并测量结合的放射性的量相对于所添加的放射性的量。将交换水平与新鲜制备的裂解物产生的双特异活性进行比较(表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表2.透析红细胞裂解物中恢复双特异活性的因子的概览将经透析的红细胞裂解物的交换活性与新鲜制备的裂解物进行比较。透析裂解物添加5□1超滤液。G-6-P、NADPH和GSH的终浓度分别为5mM、0.ImM和0.5mM。从这些数据显然可见，红细胞裂解物的活性在透析之后损失掉了。添加超滤液恢复了大部分的交换。这一结果提示，在透析期间某种组分(<3.5kD)损失了，而该组分对于交换反应是至关重要的。这一组分很可能参与氧化还原循环，因为二硫桥还原和氧化是IgG4半分子交换必需的。因此，向透析裂解物添加氧化还原循环中的三种“辅因子”(G-6-P、NADPH和GSH)，以研究这些化合物是否能够恢复交换活性。如果同时补充G_6_P、NADPH和GSH，则交换活性可以被恢复。在各别的因子存在下温育经透析的裂解物显示，GSH可恢复交换活性，G-6-P或NADPH则不能。实施例31还原型谷胱甘肽介导的IgG4半分子交换的评估将嵌合抗体混合，然后与还原型谷胱甘肽(GSH)温育，以研究IgG4的交换。将GSH(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)溶解于水中备用。在本实验中，IgG4半分子的交换是通过将由Betvl特异性IgG4(lμg)和Feldl特异性IgG4(lμg)的IgG4组成的抗体混合物在含有GSH的PBS/叠氮化物中37°C温育来评估的。总温育体积为ΙΟΟμΙ，这样每种抗体的终浓度为10yg/ml。在示明的时间点，从温育混合物采取样品到PBS-ATG^WT0.3%牛血清白蛋白、0.1%Tween-20和0.05%(w/v)NaN3WPBS)中。将样品保存在4°C，用于测量抗体结合和双特异活性。在抗原结合试验中测量Betvl结合性抗体的水平。在125I-标记的Betvl的存在下，将样品与0·75mg蛋白GSepharose(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)在750μ1的PBS-IAT(PBS-AT添加μg/mlIVIg)中温育24h。接着，用PBS-T(PBS添加0.l%Tween_20和0.05%(w/v)NaN3)清洗S印harose，并测量结合的放射性的量相对于所添加的放射性的量。使用纯化的Betvl结合性抗体作为标准(每个试验的范围是0-200ng，由浊度计确定)计算Betvl特异性IgG的浓度。在异源交联测定中测量双特异性IgG的浓度(即Feldl-Betvl交联活性)。在该测定中，将样品与0.5mg的S印harose偶联cat提取物(其中存在Feldl抗原)在总体积300μ1的PBS-IAT中温育24h。然后，将S印harose用PBS-T清洗，并与125I-标记的Betvl温育24h，之后用PBS-T清洗S印harose，测量已结合的放射性的量相对于所添加的放射性的量。双特异IgG(Feldl-Betvl)的浓度的计算使用在Betvl结合试验中所用相同的校正曲线，其是由纯化的Betvl结合性IgG获得的。在图12中，提供了GSH介导的IgG4半分子交换的时间过程。从这些数据显然可见，IgG4半分子在GSH的存在下被交换了。在本实验中，在0.I-ImMGSH之间观察到了最佳的交换，使用0.5mMGSH，在24h后达到了最高的交换(90%)。实施大小排阻色谱，以排除在GSH介导的IgG4交换之后观察到的双特异活性是IgG聚集的结果的可能性(图13)。为此，将Betvl结合性IgG4与Feldl结合性IgG4(每种抗体IOyg)的混合物在PBS/叠氮化物中与0.5mMGSH温育。将该混合物(最终体积100μ1)在37°C温育24h，之后将70μ1在Superdex200柱上进行分级。在级分中，测量Betvl结合性IgG和Feldl-Betvl交联性IgG。Betvl结合性抗体在一个峰中洗脱，保留体积为12.6ml，对应于单体IgG的保留体积。在相同的级分中检测到了异源Feldl-Betvl交联活性，提示双特异活性与单体IgG有关。发现GSH存在下的双特异IgG4分子的产生是温度依赖性的，因为在37°C下比在4°C下交换发生效率更高(图14)。实施例32.其他作用剂存在下双特异IgG的产生混合IgGl-Betvl与IgGl-Feldl或IgG4_Betvl与IgG4_Feldl，使每种抗体的终浓度为10μg/ml，并在总体积50μ1中与还原剂一起温育。除了GSH之外，对如下的作用剂进行测试(温育混合物中的终浓度)=Sigma产的L-半胱氨酸(100μΜ)，Biorad产的二硫苏糖醇(50μΜ)，Biorad产的β-巯基-乙醇(BME)(100μΜ)，和Sigma产的氧化型谷胱甘肽(GSSG，注意在该组作用剂中这种作用剂是非还原性的，而其它的则是还原性的)(100μM)。将混合物在37°C温育24h，并采取样品到PBS/AT中，在其中对(双)特异IgG的浓度进行测量。图15显示，向纯化的IgG4-Betvl和IgG4-Feldl的混合物中添加GSH或其它还原剂(但非GSSG)足以诱导Fab臂交换和双特异IgG4的产生。相比之下，在对照IgGl混合物中没有诱导出双特异反应性。实施例33.使用GSH的全人IGG4抗体的交换混合IgGl-CD20、IgG4_CD20、IgGl-EGFr和IgG4_EGFr，并与GSH在Iml总体积中温育。每种抗体的终浓度为50μg/ml；GSH的终浓度为0.5mM。将混合物在37°C温育24h，采取样品在PBS-AT中，对其中的(双)特异IgG的浓度进行测量。双特异活性用夹心式ELISA测定。该测定用含lyg/mlEGFR重组胞外域的PBSdOOμ1/孔)在4°C下对ELISA板(Greinerbio-one,Frickenhausen,Germany)包被过夜。用PBS/0.05%Tween20(PBT)清洗板3次。将样品稀释在ΡΒΤ/0.2%BSA(PBTB)中，并转移到ELISA板(100μ1/孔)。在平板振荡器(300rpm)上室温(RT)下温育90分钟之后，弃去样品，用PBT清洗板3次。接着，添加100μ1溶于PBTB中的2μg/ml小鼠抗独特型单克隆抗体2F2SAB1.1(针对抗-⑶20抗体7D8；Genmab)，RT下在平板振荡器(300rpm)上温育90分钟。弃去抗独特型抗体，用PBT清洗板3次，然后添加100μ1/孔的在PBTB中稀释IOOOx的HRP偶联山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,Westgrove,PA,USA)，并在RT下在平板振荡器(300rpm)上温育90分钟。弃去检测抗体，用PBT清洗丰13&。50mgABTS(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)MM^ABTS缓冲液(Roche)中，添加到ELISA板上(100μ1/孔)。将ELISA板用铝箔覆盖，在RT下平板振荡器(300rpm)上温育30分钟(或者更长时间，如果需要的话)，用100μ1每孔的草酸(RiedeldeHaenSeelze,Germany)终止反应。将ELISA板置于RT下10分钟，然后在ELISA酶标仪内阅读405nm吸光度。图16A显示，在GSH存在下温育IgG4_EGFr和IgG4_⑶20混合物时，经过一段时间形成双特异性的抗EGFR/CD20抗体，而在不存在GSH时则不会形成。而在IgGl抗体的混合物中，无论是否存在GSH均没有发生Fab臂交换。为了探索GSH介导的IgG4半分子交换的动态范围，使用GSH的完全浓度曲线(0.5-1，000μΜ)对交换进行分析。混合IgG4-CD20和IgG4_EGFr，并在总体积Iml中与GSH温育。每种抗体的终浓度为50μg/ml；GSH的终浓度如图16B所示。将混合物在37°C温育24h，并将样品采取到PBS-AT中，测量其中的(双)特异IgG的浓度。图16B显示出IgG4半分子交换的明显的GSH剂量依赖性。为了探索反应组分对GSH介导的IgG4半分子交换有何影响，在PBS和无血清和蛋白的化学限定培养基(FreeStyle293表达培养基，GIBCO/InvitrogenCorporation)中对交换进行了测试。结果发现，在该组织培养基中，GSH介导的交换在更低的GSH浓度下发生(图16C)。还发现，在GSH介导的IgG4半分子交换中存在一个最优值，因为与5mMGSH温育的交换明显导致低于与0.5mM温育的交换(图16D)。在有或无GSH的条件下将一个IgG4-EGFr和IgG4_CD20的混合物温育24h，并通过质谱(ESI-T0FMS)进行评估。含有200yg/ml每种抗体的50μ1样品用ΙμN-糖苷酶F(RocheDiagnosticsNLBV，Almere，荷兰)过夜去糖基化。样品在AcquityUPLC(ffaters,Milford,USA)上用BEHC8，1.7μm，2.1x50mm柱在60°C进行脱盐。注射50μ1，用5%-95%的洗脱液B梯度进行洗脱。洗脱液A是MilliQ水(MilliporeSynthesisAlO装置)，洗脱液B是LC-MS级乙腈(Biosolve，Valkenswaard,荷兰)。两种洗脱液均含0.05%甲酸作为有机修饰剂(FlukaRiedel-deHaen,Buchs,Germany)。飞行时间电喷雾电离质谱在线(on-line)地记录在以阳离子模式工作的micrOTOF质谱仪(Bruker，Bremen,Germany)±。中，ffiESijHtgg·(AgilentTechnologies,SantaClara,USA)对500_5000m/z的范围(scale)进行内部校准。使用极大熵(MaximumEntropy)算法将质谱去卷积，该算法由DataAnalysis软件v.3.3(Bruker)提供。图16E显示，在没有GSH存在的条件下，IgG4_⑶20的分子量(145.5kD)和IgG4-EGFR的分子量(145.9kD)均保持不变。然而，在GSH存在下(图16F)，出现了一个新峰，其质量相应于一个经Fab臂交换的分子(145.7kD)。这个新质量对应于双特异性抗EGFR/CD20抗体的预期质量。然而，从MS谱的峰高度可以估计，双特异抗体占了混合物中总抗体质量的50%，表明发生了随机交换，其在24h内达到平衡。实施例34.来自猕猴(和其它物种)的多克隆免疫球蛋白参与重组人IGG4抗体的Fab臂交换将两种重组人IgG4抗体(IgG4_⑶20和IgG4_EGFr，如上所述)的混合物在存在或不存在来自猕猴(6x)、黑猩猩(2x)、食蟹猴、狒狒、马和猪的纯化免疫球蛋白或人IVIg的条件下与GSH在37°C温育24h。在如上所述的夹心式ELISA中测量通过Fab臂交换的双特异性抗体形成。此外，此测定中也测试了山羊、家兔和绵羊免疫球蛋白。图17a显示，，猕猴多克隆免疫球蛋白与人多克隆免疫球蛋白(IVIg)在体外抑制重组抗体在还原型谷胱甘肽的存在下的Fab臂交换的能力相当。这意味着猕猴免疫球蛋白的某个组分参与了Fab臂交换。猕猴免疫球蛋白，可能是猕猴IgG4，能够与重组人IgG4交换Fab臂。图17b显示，来自其它数只猕猴的多克隆免疫球蛋白在体外以不同的效力抑制重组抗体在还原型谷胱甘肽存在下的Fab臂交换。这意味着，所述参与Fab臂交换的猕猴免疫球蛋白组分以不同的浓度存在，或者该组分并不存在于所有的猕猴体内。图17c显示，来自数种其它猴类(狒狒、黑猩猩、食蟹猴)的多克隆免疫球蛋白，以及来自马和猪的免疫球蛋白，在体外以不同的效力抑制重组抗体在还原型谷胱甘肽存在下的Fab臂交换。这意味着，所述参与Fab臂交换的成分以不同的浓度存在于这些物种中。山羊、家兔和绵羊免疫球蛋白对重组免疫球蛋白在还原型谷胱甘肽存在下的体外Fab臂交换无影响(数据未显示)。实施例35.铰链区或CH3结构域突变体的半分子交换制备了三种IgGl突变体具有IgG4核心铰链的IgGl(IgGl-CPSC)和两个CH3结构域互换突变体(swapmutants)S卩(IgGl_CH3(IgG4)和IgGl_CPSC_CH3(IgG4))。使用pEE-Gl-wtaBetvl作为模板(228表示抗体氨基酸残基的EU编号。相同的位置在Kabat编号法中为241号，在SEQIDNO:19中为111号(CPPC核心铰链序列中的第三个位置))，利用定点诱变在IgGl的铰链中引入一个P228S突变。突变引物，正向和反向，用VectorNTIAdvance10设计P228S正向突变引物(Mutprimer-F):SEQIDNO22P228S反向突变引物(Mutprimer-R):SEQIDNO23<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>使用Quickchange定点诱变试剂盒(Stratagene)产生pEE-Gl-CPSC突变体。聚合酶链式反应(PCR)混合物由5μ1pEE-GlaBetvlDNA模板(35ng)，1，5μ1正向突变引物(150ng)，l，5y1反向突变引物(150ng)，1μ1(1^混合物，5“1反应缓冲液(IOx),36μ1H2O以及最后ΙμPfuTurboDNA聚合酶组成。然后将混合物应用于PCR30"95°C,30"950C(变性)，1，55°C(退火)和Hmin68°C(延伸)。该循环重复2O次。利用DNA消化和连接产生CH3结构域互换突变构建体IgGl_CH3(IgG4)和IgGl-CPSC-CH3(IgG4)。用于获得CH3结构域和无CH3结构域的载体的消化反应体系如下1500ngDNA(pEE-Gl-betvl、pEE-Gl-CPS(^npEE-G4-betvl)、2ylBSA、2ylNeb3缓冲液、ΙμSallJnH2O至体积20μ1。在37°C温育30，。纯化DNA并用30μ1H2O洗脱，之后添加1μ1SanDI和3μ1通用缓冲液，在37°C温育30’。将片段在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。在紫外光下将片段从凝胶上切下，并用DNA纯化试剂盒(Amersham)溶解。用如下的程序将pEE-G4_wtSall/SanDI(其含有IgG4CH3结构域)片段连接到pEE-Gl-wt和pEE-Gl-CPSC中1μ1模板DNA(Sall/SanDI消化的pEE-Gl-wt禾口pEE-Gl-CPSC)，5μ1Sall/SanDI插入序列，4μ1Ligate-it缓冲液，9μ1H2O和1μ1连接酶，总体积为20μ1。5’后终止连接反应。采用与上面相似的程序，利用DNA消化(使用ApaI和HindIII)和连接，将betvl突变抗体的VH结构域替换为pEE-G4-a-feldlwt的VH结构域。另外，制备一种lgG4突变体IgG4-S228Pnew。在该突变体中，通过将228位丝氨酸(SEQIDNO19中的位置111)替换为脯氨酸(IgGl核心铰链)来使铰链稳定化。定点诱变使用QuickChangeIIXL定点诱变试剂盒(Stratagene，Amsterdam，荷兰)，根据制造商的使用说明操作。该方法包括引入一个沉默的额外XmaI位点，用于筛选成功的诱变。简而言之，将5μ1IOx反应缓冲液，1μ1寡核苷酸S228Pfcorrect(1OOpmo1/μ1)，1μ1寡核苷酸S228Prcorrect(100pmol/y1)，1μ1dNTP混合物，3μ1Quicksolution,1μ1质粒pTomG42F8HG(50ng/μ1)(2006年11月28日提交的(RO/DK(Genmab)、题为"Recombinantmonovalentantibodiesandmethodsforproductionthereof，，白勺PCT专禾串i青中有描述)以及ΙμPfuUltraHFDNA聚合酶混合成总体积为50μ1，并用TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra,Goettingen,Germany；产品编号050-801)使用18个循环的程序进行扩增95°C变性Imin；18个循环的95°C50sec，60°C50sec和68°CIOmin。将PCR混合物保存于4°C直至进一步处理。接着，将PCR混合物与1μ1DpnI在37°C温育60min以消化pTomG42F8HGV载体，然后保存于4°C直到进一步处理。将反应混合物用5μ13MNaAc和125μ1乙醇沉淀，在_20°C温育20min，然后以14000xg在4°C离心沉降20分钟。将DNA离心沉淀用70%乙醇清洗，干燥并溶解于4μ1水中。按照制造商的使用说明(Invitrogen)将总共4μ1反应体积转化到OneShotDNH5αTIk感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen，Breda，荷兰)中。接着，将细胞涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上。将平板在37°C温育16-18小时，直到细菌菌落变得明显。通过菌落PCR和XmaI(突变将导致XmaI位点丢失)消化进行筛选之后，从细菌分离质粒，并通过DNA测序对突变进行确认。为了检查是否引入了非期望的额外突变，对整个HC编码区进行测序，发现没有包含任何额外突变。将最终的构建体命名为pTomG42F8S228PNew0寡核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>将来自这些构建体的重组抗体在3ml，6孔板(NUNC)内或者在125ml锥形瓶(erlenmeyers)(Corning)内于HEK293细胞中瞬时表达，以293Fectin(Invitrogen)作为转染试剂。将下述非纯化抗体的混合物(FreeStyle293表达培养基，GIBCO/InvitrogenCorporation)与0.ImMGSH在37°C温育24h，将样品吸取在PBS-AT中，按照先前实施例所述测量其中的(双)特异性IgG的浓度-IgG4a-feldlwt与IgG4a_betvlwt-IgGla-feldlwt与IgG4a_betvlwt-IgGla-feldlCPSC与IgGla-betvlCPSC(下面表示为IgGlCPSC-IgGlCPSC)-IgGla-feldlCPSC与IgGla-betvlCH3(IgG4)(IgGlCPSC_IgGlCH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC与IgGla-betvlCPSC/CH3(IgG4)(IgGlCPSC-IgGlCPSC/CH3(IgG4))-IgGla-feldlCH3(IgG4)与IgGla-betvlCH3(IgG4)(IgGlCH3(IgG4)-IgGlCH3(IgG4))-IgGla-feldlCH3(IgG4)与IgGla-betvlCPSC/CH3(IgG4)(IgGlCH3(IgG4)_IgGlCPSC/CH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC/CH3(IgG4)与a-betvlIgGlCPSC/CH3(IgG4)(IgGlCPSC/CH3(IgG4)-IgGlCPSC/CH3(IgG4))-IgGla-feldlCPSC/CH3(IgG4)与IgG4a_betvlwt(IgGlCPSC/CH3(IgG4)-IgG4wt-IgG4a-betlS228Pnew%IgG4wt结果显示，在这些体外条件下(0.ImMGSH)，当其中一种抗体含有CPSC铰链且两种抗体均含有IgG4-样CH3时，会发生半分子交换。另外，在含有IgGl铰链的IgG4分子与IgG4wt分子之间也发生半分子交换IgGlwtIgG4wtIgGlIgGlIgGlCH3(IgG4)CPSCCPSC/CH3(IgG4)IgGlwt--IgG4wt-+++IgGlCH3(IgG4)+-士IgGlCPSC----IgGl+士-+CPSC/CH3(IgG4)IgG4S228Pnew-+-=无交换+=发生交换士=有限的交换(5%)空白框=未测试用0、0.1、1和IOmMGSH测试了GSH浓度对来自不同突变体的半分子交换的影响。交换的测试使用如下的混合物-IgG4a-feldlwt与IgG4a_betvlwt-IgGla-feldlwt与IgG4a_betvlwt-IgGla-feldlCPSC与IgGla-betvlCPSC-IgGla-feldlCH3(IgG4)与IgGla-betvlCH3(IgG4)-IgGla-feldlCPSC/CH3(IgG4)与a-betvlIgGlCPSC/CH3(IgG4))对于浓度不大于ImM的GSH，结果(图19A)证实了上文的描述。在IOmMGSH下，在含有IgGla-feldlCH3(IgG4)和IgGla-betvlCH3(IgG4)的反应中也见到了半分子交换。如前面实施例中所述实施大小排阻色谱，以排除在GSH介导的合适的IgGl突变体的交换之后所观察到的双特异活性是IgG聚集的结果的可能性。在相应于单体IgG的保留体积的级分中检测到了异源Feldl-Betvl交联活性。为了鉴定CH3结构域中负责半分子交换能力的氨基酸残基，将IgG4_样残基引入到IgGl的CH3中的在IgGl和IgG4之间不同的位置上。这样，使用pEE_Gl_wtaBetvl或pEE-Gl-wtaFeldl作为模板，基本上按照如上所述将R238Q、K292R、Q302E或P328L突变(编号参照SEQIDNO19)引入到IgGl的CH3结构域中。而且，还使用pEE_Gl_CPSCbetvl或pEE-Gl-CPSCfeldl作为模板将一个K292R突变引入到IgGlCPSC的CH3结构域内。简而言之，用VectorNTIAdvance10设计正向和反向诱变引物。使用Quickchange定点诱变试剂盒(Stratagene)产生构建体。将来自这些构建体的重组抗体在3ml6孔板(NUNC)内或者在125ml锥形瓶(Corning)内在HEK293细胞中瞬时表达，以293Fectin(Invitrogen)作为转染试剂。将下述非纯化抗体的混合物(FreeStyle293表达培养基，GIBCO/InvitrogenCorporation)与0.5或5mMGSH在37°C温育24h，将样品吸取在PBS-AT中，按照先前的实施例所述测量其中(双)特异性IgG的浓度-IgGla-feldlwt与IgG4a_betvlwt(图19B中表示为IgGl)-IgGla-feldlCPSC与IgG4a_betvlwt(图19B中表示为IgGl-CPSC)-IgGla-feldlCH3(IgG4)与IgG4a_betvlwt(图19B中表示为IgGl_CH3(G4))-IgGla-feldlCPSC/CH3(IgG4)与IgG4a_betvlwt(图19B中表示为IgGl-CPSC/CH3(G4))-IgGla-feldlR238Q与IgG4a_betvlwt(图19B中表示为IgGl_R238Q)-IgGla-feldlK292R与IgG4a_betvlwt(图19B中表示为IgGl_K292R)-IgGla-feldlQ302E与IgG4a_betvlwt(图19B中表示为IgGl_Q302E)-IgGla-feldlP328L与IgG4a_betvlwt(图19B中表示为IgGl_P328L)-IgGla-feldlCPSC/K292R与IgG4a_betvlwt(图19B中表示为IgGl-CPSC/K292R)-IgG4a-feldlwt与IgG4a_betvlwt(图19B中表示为IgG4)-IgGla-feldlwt与IgGla-betvlwt(图19C中表示为IgGl)-IgGla-feldlCPSC与IgGla-betvlCPSC(图19C中表示为IgGl-CPSC)-IgGla-feldlCH3(IgG4)与IgGla-betvlCH3(IgG4)(图19C中表示为IgGl-CH3(G4))-IgGla-feldlCPSC/CH3(IgG4)与IgGla-betvlCPSC/CH3(IgG4)(图19C中表示为IgGl-CPSC/CH3(G4))-IgGla-feldlR238Q与IgGla-betvlR238Q(图19C中表示为IgGl_R238Q)-IgGla-feldlK292R与IgGla-betvlK292R(图19C中表示为IgGl_K292R)-IgGla-feldlQ302E与IgGla-betvlQ302E(图19C中表示为IgGl_Q302E)-IgGla-feldlP328L与IgGla-betvlP328L(图19C中表示为IgGl_P328L)-IgGla-feldlCPSC/K292R与IgGla-betvlCPSC/K292R(图19C中表示为IgGl-CPSC/K292R)-IgG4a-feldlwt与IgG4a_betvlwt(图19C中表示为IgG4)结果显示，在被测试的体外条件下(0.5mM和5mMGSH)，当两种抗体均在292位含有一个R时，可发生半分子交换(图19B+C)。在该实验条件下，238位的R或Q，302位的Q或E，以及328位的P或L对于IgGl不能交换半分子均无影响。实施例36.在0.5mMGSH下，具有稳定化的IgGl-样核心铰链的IgG4分子不参与重组人IgG4抗体的Fab臂交换反应将两种重组人IgG4抗体(IgG4-⑶20和IgG4_EGFr，如上所述)的混合物在存在或不存在过量(10，50和100微克/ml)的那他珠单抗(Tysabri)或吉妥单抗(Mylotarg)(10微克/ml)的条件下与0.5mMGSH在37°C温育24h。那他珠单抗是一种可商购的含有野生型IgG4核心铰链的人源化IgG4抗体，而吉妥单抗是一种可商购的、含有一个稳定的IgGl-样核心铰链的人源化IgG4抗体。在如上文所述的夹心式ELISA中测量双特异性抗体通过Fab臂交换的形成。图20A显示，在过量的那他珠单抗的存在下，重组⑶20和EGFr抗体的Fab臂交换被抑制。图20B显示，在过量的那他珠单抗而非吉妥单抗的存在下，重组⑶20和EGFr抗体的Fab臂交换被抑制。这表明，在使用0.5mMGSH的体外条件下，那他珠单抗而非吉妥单抗参与Fab臂交换反应，而且稳定化的IgGl-样核心铰链不参与Fab臂交换。实施例37.在292位具有额外突变的IgGl-CPSC构建体的半分子交换与实施例35类似，在pConGlf2F8(对EGFR特异)和pConGlf7D8(对CD20特异)中制备了三种IgGl突变体一个具有IgG4核心铰链的IgGl(IgGl-CPSC)和两个CH3结构域互换突变体(IgGl-CH3(IgG4)和IgGl_CPSC_CH3(IgG4)(即其中IgGl的CH3区被IgG4的CH3区替换的构建体))。这产生了如下的构建体pGlf-2F8CPSC、pGlf_7D8CPSC、pGlf-2F8-CH3(G4)、pGlf_7D8_CH3(G4)、pGlf_2F8CPSC_CH3(G4)和pGlf_7D8CPSC_CH3(G4)。然后，以基本上与上文所述相同的方式，在pGlf-2F8CPSC和pGlf-7D8CPSC构建体的CH3结构域中引入R238Q、K292R、K292Y、K292F、K292W、Q302E或P328L突变(见SEQIDN0:19)，。简而言之，用VectorNTIAdvance10设计正向和反向突变引物。使用Quickchange定点诱变试剂盒(Stratagene)产生构建体。将来自这些构建体的重组抗体于3ml的6孔板(NUNC)内或者在125ml锥形瓶(Corning)内在HEK293细胞中瞬时表达，以293Fectin(Invitrogen)作为转染试剂。然后将培养物上清对PBS透析，并通过浊度计量法测量浓度(见上文)。将非纯化的、交换了缓冲液的抗体的下述混合物(FreeStyle293表达培养基，GIBCO/InvitrogenCorporation)与0.5GSH在37°C温育24h，将样品吸取在PBS-AT中，按照先前实施例所述测量其中(双)特异性IgG的浓度-IgGl-2F8wt与IgGl_7D8wt(表示为IgGl)-IgGl-2F8-CPSC与IgGl_7D8_CPSC(表示为IgGl-CPSC)-IgGl-2F8-CH3(IgG4)与IgGl-7D8_CH3(IgG4)(表示为IgGl-CH3(IgG4))-IgGl-2F8-CPSC-CH3(IgG4)与IgGl-7D8-CPSC_CH3(IgG4)(表示为IgGl-CPSC-CH3(IgG4))-IgGl-2F8-CPSC-R238Q与IgGl-7D8_CPSC-R238Q(表示为IgGl_CPSC_R238Q)-IgGl-2F8-CPSC-K292R与IgGl_7D8_CPSC-K292R(表示为IgGl_CPSC_K292R)-IgGl-2F8-CPSC-K292Y与IgGl_7D8-CPSC_K292Y(表示为IgGl_CPSC_K292Y)-IgGl-2F8-CPSC-K292F与IgGl_7D8-CPSC_K292F(表示为IgGl_CPSC_K292F)-IgGl-2F8-CPSC-K292ff与IgGl_7D8_CPSC-K292W(表示为IgGl_CPSC_K292W)-IgGl-2F8-CPSC-Q302E与IgGl-7D8_CPSC-Q302E(表示为IgGl_CPSC_Q302E)-IgGl-2F8-CPSC-P328L与IgGl-7D8-CPSC_P328L(表示为IgGl_CPSC_P328L)-IgG4-2F8wt与IgG4_7D8wt(表示为IgG4)图21显示，在被测试的体外条件下(0.5mMGSH)，当存在CPSC铰链并且在292位为R时，可发生半分子交换。此外，结果显示，292位上为Y或F，但非W，也有助于半分子交换，尽管程度低一些。238位上的R或Q，302位上的Q或E，以及328位上的P或L对IgGl-CPSC不能交换半分子没有影响。实施例38.具有稳定化的CPPC铰链的IgG4分子能够在体外(存在5mMGSH时)进行Fab臂交换，但在体内不能在5mMGSH的存在下，将IgG4_EGFR_CPPC和IgG4_CD20的混合物温育24h，并通过质谱(ESI-TOFMS)进行评估。将含有每种抗体200μg/ml的50μ1样品用1μ1N-糖苷酶F(RocheDiagnosticsNLBV,Almere，荷兰)去糖基化处理过夜。将样品在AcquityUPLC(Waters,Milford,USA)上用BEHC8、1.7μm，2.1x50mm柱60"C脱盐。注射5μ1，用5%-95%的洗脱液B的梯度洗脱。洗脱液A是MilliQ水(MilliporeSynthesisAlO装置)，洗脱液B是LC-MS级乙腈(Biosolve，Valkenswaard,荷兰)。两种洗脱液均含有0.05%甲酸作为有机改性剂(FlukaRiedel-deHaSn，Buchs，Germany)。飞行时间电喷雾电离质谱在线地记录在以阳离子模式工作的micrOTOF质谱仪(Bruker，Bremen，Germany)上。每次分析中利用ES调节混合物(AgilentTechnologies,SantaClara,USA)内部校准500-5000m/z的范围。质谱使用MaximumEntropy算法去卷积，后者是由DataAnalysis软件v.3.3(Bruker)提供的。图22A显示，在5mMGSH的存在下出现了一个具有对应于Fab臂交换分子(145.7kDa)的中间质量的新峰。该新质量对应于双特异抗EGFR/CD20抗体的预期质量。当没有使用GSH或使用0.5mMGSH时，没有双特异抗体峰出现(数据未显示)。这表明，在体外较高的GSH浓度下，可使得含有IgGl-样、CPPC铰链和IgG4-样CH3区的突变体交换半分子(在实施例35、36、37中也有说明)。为了研究含有IgGl-样、CPPC铰链和IgG4_样CH3区的稳定化铰链突变体在体内是否发生Fab臂交换，我们向免疫缺陷小鼠体内注射了IgG4-⑶20和IgGl-EGFR、IgG4-EGFR、IgG4-EGFR-CPPC的等量混合物。在不同时间点采取血液样品，在ELISA中定量双特异性抗体(如上文所述)，使用体外交换的混合物(IgG4-EGFR/IgG4-CD20)作为参考标准。图22B显示，在注射了含有野生型IgG4分子(IgG4_EGFR)的混合物的小鼠的血液中出现了双特异性抗体。在包含铰链稳定化的IgG4(IgG4-EGFR-CPPC)或IgGl分子(IgGl-EGFR)的混合物中没有检测到双特异性抗体(符号在图中未显示)。这表明，核心铰链的稳定化会在体内阻止IgG4Fab臂交换，但是不能在体内交换半分子(尽管我们不能排除铰链稳定化的IgG4确实可能发生低于检测水平(72小时内<8%)的低水平交换)。这提示含有稳定化CPPC铰链的双特异性抗体能够通过体外Fab臂交换获得。经过后续的针对这些双特异性抗体的特异性纯化之后，这些抗体在体内注射时将保持稳定(即不会发生Fab臂交换)。实施例39.CXXC突变体的Fab臂交换对核心铰链中含有不同CXXC基序的抗体的交换Fab臂的能力进行了测试。使用上文所述的定点诱变技术将如下的CXXC基序引入到IgG4betvl和IgG4feldl中-CGHC(就蛋白质-二硫化物-异构酶，PDI描述过的活性位点序列)-CGC(据称具有潜在的二硫化物还原能力的肽)-CPRC(GorillaIgG4的核心铰链序列)-CPHC(关于人硫氧还蛋白描述的活性位点序列)将如下的纯化抗体的混合物与0.5mMGSH在37°C温育，在0_24h之间的不同时间点吸取样品到PBS-AT中，按照前面实施例中的描述对其中的(双)特异IgG浓度进行测量-IgGla-feldlwt与IgGla-betvlwt(在图23禾口24中表示为IgGl)-IgG4a-feldlwt与IgG4a_betvlwt(在图23禾口24中表示为IgG4)-IgG4a-feldlCGHC与IgG4a_betvlCGHC(在图23和24中表示为CGHC)-IgG4a-feldlCGC与IgG4a_betvlCGC(在图23和24中表示为CGC)-IgG4a-feldlCPRC与IgG4a_betvlCPRC(在图23和24中表示为CPRC)-IgG4a-feldlCPHC与IgG4a_betvlCPHC(在图23和24中表示为CPHC)结果(图23)显示，在一段时间内，含有CGC基序或IgGl核心铰链的抗体没有发生Fab臂交换。含有CGHC基序的抗体的Fab臂交换的效力与IgG4wt抗体相同。在含有CPRC基序的抗体中也发生了Fab臂交换，尽管稍微慢一些，而且含有CPHC基序的抗体中也有程度低一些的Fab臂交换。另外，测试了GSH浓度(1-20，000μΜ)对于这些混合物在37°C温育24h之后进行Fab臂交换的能力的影响。发现含有CPHC-，CPRC-和CGHC-基序的抗体以及IgG4wt抗体的Fab臂交换依赖于GSH浓度(图24)，在100-1，000μMGSH之间存在一个最佳值。权利要求一种用于产生双特异性抗体的体外方法，所述方法包括如下步骤a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含IgG4-样CH3区，b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述第二抗体包含IgG4-样CH3区，c)在允许核心铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所述第一和第二抗体，和d)获得双特异性抗体。2.权利要求1的体外方法，其中所述第一抗体在核心铰链区中包含CPPC序列。3.前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一抗体包含IgG4-样核心铰链区。4.权利要求1或3中任一项的体外方法，其中所述第一抗体是在核心铰链区中包含CX1X2C序列的抗体，其中X1和X2可以是任何氨基酸，但X1和X2不能都是脯氨酸。5.权利要求4的体外方法，其中所述第一抗体是在核心铰链区中包含CX3PC或CPX3C序列的抗体，其中X3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。6.权利要求5的体外方法，其中所述第一抗体是在核心铰链区中包含CSPC、CPSC、CRPC,CPRC,CGHC或CPHC序列的抗体。7.前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一抗体包括IgG4CH3区。8.权利要求1-6中任一项的体外方法，其中所述第一抗体包含非IgG4同种型的CH3区，其中该CH3序列不包含或者已被修饰而不包含任何如下所述的氨基酸残基所述氨基酸残基可参与和包含相同的CH3区氨基酸序列的其它肽形成二硫键或者共价或稳定非共价重链间键。9.权利要求8的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQIDNO:19所示的序列，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换238位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。10.权利要求9的体外方法，其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。11.权利要求1-6或8中任一项的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQIDNO19所示的序列，但是其中292位的Lys(K)已被Tyr(W)或Phe(F)取代。12.权利要求8的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQIDNO:20所示的序列，其中该Ch3已区被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Lys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。13.权利要求12的体外方法，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。14.权利要求12的体外方法，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；且324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。15.权利要求12的体外方法，其中发生了全部5种取代。16.权利要求8的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQIDNO:21所示的序列，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys(K)取代；327位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；352位的Ile(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；和375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。17.权利要求16的体外方法，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。18.权利要求16的体外方法，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；和375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。19.权利要求16的体外方法，其中发生了全部10种取代。20.权利要求1、3-7中任一项的体外方法，其中所述第一抗体是IgG4抗体。21.前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第二抗体在核心铰链区中包含CPPC序列。22.权利要求1-20中任一项的体外方法，其中所述第二抗体包含IgG4-样核心铰链区。23.权利要求1-20或22中任一项的体外方法，其中所述第二抗体是在核心铰链区中包含CX1X2C序列的抗体，其中X1和X2可以是任何氨基酸，但X1和X2不能都是脯氨酸。24.权利要求23的体外方法，其中所述第二抗体是在核心铰链区中包含CX3PC或CPX3C序列的抗体，其中X3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。25.权利要求23的体外方法，其中所述第二抗体是在核心铰链区中包含CSPC、CPSC、CRPC或CPRC序列的抗体。26.前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第二抗体包含IgG4CH3区。27.权利要求1-25中任一项的体外方法，其中所述第二抗体包含非IgG4同种型的CH3区，其中该CH3序列不包含或者已被修饰而不包含任何如下所述的氨基酸残基所述氨基酸残基可参与和包含相同的CH3区氨基酸序列的其它肽形成二硫键或者共价或稳定非共价重链间键。28.权利要求27的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQIDNO19所示的序列，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换238位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。29.权利要求28的体外方法，其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。30.权利要求21-27中任一项的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQIDNO19所示的序列，但是其中292位的Lys(K)已被Tyr(W)或Phe(F)取代。31.权利要求27的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQIDNO:20所示的序列，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Lys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。32.权利要求31的体外方法，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。33.权利要求31的体外方法，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；且324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。34.权利要求31的体外方法，其中发生了全部5种取代。35.权利要求27的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQIDNO21所示的序列，其中该CH3区已被修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys(K)取代；327位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；352位的Ile(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；和375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。36.权利要求35的体外方法，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。37.权利要求35的体外方法，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；和375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。38.权利要求35的体外方法，其中发生了全部10种取代。39.权利要求1-20或22-26中任一项的体外方法，其中所述第二抗体是IgG4抗体。40.权利要求1或2的体外方法，其中所述第一抗体在核心铰链区中包含CPPC，并包含IgG4-样CH3区；且其中所述第二抗体在核心铰链区中包含CPPC，并包含IgG4_样CH3区。41.前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一抗体和/或所述第二抗体是人类抗体。42.前述权利要求中任一项的体外方法，其中对步骤c)中的条件进行选择，使核心铰链区之外不发生显著的二硫桥还原或异构化。43.前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤c)包括添加还原剂。44.前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤c)包括添加从下组选出的作用剂谷胱甘肽、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇和半胱胺。45.权利要求43或44的体外方法，其中所述作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液的氧化还原势等于或者还原性更高于在实施例31所述的条件下1μM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由10μM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由50μM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由0.ImM谷胱甘肽产生的氧化还原势。46.权利要求43或44的体外方法，其中所述作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液的氧化还原势等于或者还原性更高于在实施例35所述的条件下由ImM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由2mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由4mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由6mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由8mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由IOmM谷胱甘肽产生的氧化还原势。47.权利要求45或46的体外方法，其中所述作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液的氧化还原势等于或者还原性低于于由IM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性低于由IOOmM谷胱甘肽产生的氧化还原势，等于或者还原性低于由15mM谷胱甘肽产生的氧化还原势。48.前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤c)包括在还原型谷胱甘肽的存在下在20°C或更高的温度下，例如在37°C下，温育所述抗体至少1小时，例如至少2小时，例如至少5小时，例如至少10小时。49.前述权利要求中任一项的体外方法，其中在所得的组合物中少于10%，例如少于5%，例如少于2%，例如少于的抗体分子处于聚集状态。50.前述权利要求中任一项的体外方法，还包括使步骤c)中获得的组合物处于非还原性条件下，以便停止进一步的半分子交换的步骤。51.前述权利要求中任一项的体外方法，还包括使双特异性抗体稳定化的步骤，优选地采用选自下组的方法a)铰链区中半胱氨酸的化学交联，b)半分子上碳水化合物侧链的化学交联，和c)CH3区中不对称地引入的半胱氨酸的交联。52.前述权利要求中任一项的体外方法，还包括纯化双特异性抗体的步骤，优选地在非还原性条件下实施。53.前述权利要求中任一项的体外方法，还包括将所得的双特异性抗体配制成用于治疗应用的药物组合物的步骤。54.前述权利要求中任一项的体外方法，其中第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白的结合特异性，例如针对erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD38、CD4或CXCR5或针对⑶79a或⑶79b的结合特异性。55.权利要求54的体外方法，其中第二抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白的结合特异性，例如针对erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-UCD19、CD20、CD4或CXCR5的结合特异性。56.权利要求54的体外方法，其中第一抗体具有针对erbBl的结合特异性，且第二抗体具有针对erbB2的结合特异性。57.权利要求54的体外方法，其中第一抗体具有针对CD19的结合特异性，且第二抗体具有针对CD20的结合特异性。58.权利要求54的体外方法，其中第一抗体具有针对CD4的结合特异性，且第二抗体具有针对CXCR5的结合特异性。59.权利要求54的体外方法，其中第一抗体具有针对CD38的结合特异性，且第二抗体具有针对CD34的结合特异性。60.权利要求1-53中任一项的体外方法，其中第一抗体具有针对病原微生物的结合特异性。61.权利要求54或60的体外方法，其中第二抗体具有针对效应细胞蛋白质的结合特异性，例如针对⑶3、⑶25、⑶28、⑶16、⑶89、⑶32或OTl的结合特异性。62.权利要求54的体外方法，其中第二抗体具有针对化疗剂的结合特异性。63.权利要求54的体外方法，其中第二抗体具有针对血液蛋白例如血清白蛋白，或针对脑蛋白例如铁传递蛋白，或针对肝蛋白的结合特异性。64.权利要求54的体外方法，其中第二抗体具有针对参与凝血的蛋白质例如组织因子的结合特异性。65.前述权利要求中任一项的体外方法，其中第一和/或第二抗体连接于从下组选出的化合物细胞毒剂；放射性同位素；前体药物或药物，例如紫杉烷；细胞因子；趋化因子和补体，例如Clq。66.一种用于产生双特异性抗体的体外方法，所述方法包括如下步骤a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含核心铰链区中的CPPC序列以及IgG4CH3区，b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述第二抗体包含核心铰链区中的CPPC序列以及IgG4CH3区，c)在允许核心铰链区中的半胱氨酸进行二硫键异构化的还原条件下共同温育所述第一和第二抗体，和d)获得双特异性抗体。67.权利要求66的体外方法，其中在步骤c)中已添加还原剂，其中该还原剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液的氧化还原势等于或者还原性更高于在实施例35所述的条件下由ImM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由2mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由4mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由6mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如例如等于或者还原性更高于由SmM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由IOmM谷胱甘肽产生的氧化还原势。68.一种分离的双特异性抗体，其是通过前述任一项权利要求的方法获得的，或者可以通过前述任一项权利要求的方法获得。69.一种分离的双特异性抗体，其包括两个IgG4-样CH3区。70.权利要求69的双特异性抗体，其中该抗体在核心铰链区中包含一个或两个CPPC序列。71.权利要求69的双特异性抗体，其中该抗体在核心铰链区中包含一个或两个CX1X2C序列，其中X1和X2可以是任何氨基酸，但X1和X2不能都是脯氨酸。72.权利要求69的双特异性抗体，其中该抗体在核心铰链区中包含一个或两个CX3PC或CPX3C序列，其中X3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。73.权利要求69的双特异性抗体，其中该抗体在核心铰链区中包含一个或两个CSPC、CPSC、CRPC或(PRC序列。74.权利要求69-73中任一项的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区是非IgG4同种型的，其中该CH3序列不包含或者已被修饰而不包含任何如下所述的氨基酸残基所述氨基酸残基可参与和包含相同的CH3区氨基酸序列的其它肽形成二硫键或者共价或稳定非共价重链间键。75.权利要求74的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区具有如SEQIDNO19所示的序列，其中该CH3区已被修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换238位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。76.权利要求75的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区具有如SEQIDNO19所示的序列，但是其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。77.权利要求74的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区具有如SEQIDNO19所示的序列，但是其中292位的Lys(K)已被Tyr(W)或Phe(F)取代。78.权利要求74的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区具有如SEQIDNO20所示的序列，其中该(^3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Lys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。79.权利要求74的双特异性抗体，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。80.权利要求74的双特异性抗体，其中234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；且324位的Pro(P)已被Leu(L)取代。81.权利要求74的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区具有如SEQIDNO21所示的序列，其中该Ch3区已被修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys(K)取代；327位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；352位的lie(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；且375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。82.权利要求81的双特异性抗体，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代。83.权利要求81的双特异性抗体，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；且375位的Pro(P)已被Leu(L)取代。84.权利要求69-73中任一项的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区是IgG4CH3区。85.权利要求68-84中任一项的双特异性抗体，其中核心铰链区和CH3区外部的序列属于选自下组的同种型:IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。86.一种药物组合物，其包括权利要求69-85中任一项的双特异性抗体。87.权利要求86的组合物，其用作药物。88.权利要求86的组合物，其用作用于治疗癌症的药物。89.通过权利要求1-67中任一项的方法获得的或者可以通过权利要求1-67中任一项的方法获得的双特异性抗体或者权利要求68-85中任一项的双特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。90.一种用于选择具有期望性质的双特异性抗体的方法，所述方法包括如下步骤a)提供一系列抗体，其中每种抗体具有不同的靶标特异性，并且其中每种抗体包含IgG4-样CH3区，b)在还原条件下将所述系列中的每种抗体与所述系列中的另一种抗体进行温育，从而产生一系列的抗体混合物，其中每种混合物包含不同的双特异性抗体，c)测定所得的一系列抗体混合物的给定的期望性质，和d)选择具有所述期望性质的双特异性抗体混合物。91.权利要求90的方法，其中步骤b)具有权利要求2-67中对步骤c)所进一步限定的一种或多种性质。92.权利要求90或91的方法，其中所述期望性质是肿瘤细胞杀伤。全文摘要本发明涉及产生双特异性抗体的体外方法，包括如下步骤a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含IgG4-样CH3区，b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述第二抗体包含IgG4-样CH3区，c)在允许核心铰链区的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所述第一和第二抗体，和d)获得双特异性抗体。本发明进一步涉及通过本发明的方法获得的双特异性抗体。文档编号C07K16/46GK101802015SQ200880018280公开日2010年8月11日申请日期2008年3月28日优先权日2007年3月29日发明者保罗·帕伦,汤姆·文克,简·V·D·温克尔,罗布·阿伯斯,贾尼·舒尔曼,阿兰·F·拉布里金,马里金·V·D·N·科尔夫肖滕申请人:根马布股份公司