用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法

专利名称：用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法
专利说明用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法 本发明涉及用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法，以及用于制备聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法。
甲基丙烯酸是重要的中间产物，其特别地以其烷基酯形式用于制备聚合产物。已知的甲基丙烯酸衍生物为例如甲基丙烯酸甲酯。目前，甲基丙烯酸甲酯的世界年产量为大约150万吨。聚甲基丙烯酸酯是在塑料领域中在各种各样方面可使用的原材料。
通常，甲基丙烯酸的商业生产通过在作为催化剂的固体多金属氧化物物料上C4-碳化合物(例如丁烯、异丁烯、丁烷、异丁烷、叔丁醇或异丁烯醛)的多相的、两步催化的气相氧化来实现。然后，将由此获得的产物气体混合物(其除了甲基丙烯酸外，还包含许多副产物)经历完全冷凝从而获得甲基丙烯酸水溶液，或者吸收在合适的溶剂混合物中。此后，通常通过蒸馏、结晶、萃取或通过这些措施的组合来对如此获得的液相进行进一步的纯化。除了C4-碳化合物的催化气相氧化外，还可以通过催化氧化脱氢从异丁酸形成甲基丙烯酸，如例如在EP-A-0 356 315中所描述的那样。所谓的“ACH过程”提供了用于制备甲基丙烯酸的另一种可能性，其中使丙酮合氰化氢和硫酸进行反应从而形成作为中间产物的甲基丙烯酰胺，该甲基丙烯酰胺随后与水进一步进行反应以产生甲基丙烯酸。随后，对如此获得的甲基丙烯酸进行蒸馏纯化。这种方法例如在EP-A-1 359 137中作了描述。
用于制备甲基丙烯酸的这些常规方法的缺点尤其在于，不仅在甲基丙烯酸的制备本身中而且在后面的蒸馏纯化步骤中，由于通过这些热负荷性步骤引起甲基丙烯酸的高聚合倾向而形成二聚体或寡聚体，这除了额外的纯化花费外还与产量损失相联系。
本发明的任务在于，克服由现有技术所产生的缺点。
特别地，本发明的任务在于提供用于制备甲基丙烯酸的方法，其中可以以尽可能少的热负荷性步骤来获得甲基丙烯酸。
该方法还应当使得能够从再生性原料，特别是从碳水化合物和/或甘油来制备甲基丙烯酸。
一种用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法为解决上述任务作出了贡献，所述方法包括下列步骤 IA)通过包括下述步骤的方法来制备3-羟基异丁酸，即在从碳源形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸(Polyhydroxyalkanoat)的条件下，使细胞与包含碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲烷、甲醇、L-缬氨酸或L-谷氨酸作为碳源的培养基相接触，所述细胞相对于其野生型而言如此地经基因工程改造，从而与其野生型相比，它能够形成更多的3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸；任选地，从培养基中纯化出3-羟基异丁酸；以及任选地，中和3-羟基异丁酸， 其中，3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成优选地经由甲基丙二酸半醛或经由3-羟基异丁酰辅酶A(作为初产物)来实现； IB)使3-羟基异丁酸脱水从而形成甲基丙烯酸；以及任选地，使甲基丙烯酸酯化。
如果3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为初产物的甲基丙二酸半醛来实现，那么进一步优选的是，所述形成经由琥珀酰辅酶A、丙酰辅酶A、丙烯酰辅酶A，特别优选地经由琥珀酰辅酶A(作为进一步的中间产物)来实现。如果3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为初产物的3-羟基异丁酰辅酶A来实现，那么进一步优选的是，所述形成经由异丁酰辅酶A或经由3-羟基丁酰辅酶A，优选地经由3-羟基丁酰辅酶A(作为进一步的中间产物)来实现。
如此处所使用的，术语“初产物(Vorprodukt)”定义了这样的化合物，其可以在仅单个反应步骤中通过酶促方式被转化为3-羟基异丁酸；而术语“中间产物”定义了这样的化合物，其不能在仅一个反应步骤中通过酶促方式被转化为3-羟基异丁酸。
如此处所使用的，术语“3-羟基异丁酸”总是描述以这样形式的相应的C4-羧酸，所述形式为C4-羧酸在由相应的微生物形成之后依赖于pH值而呈现的形式。因此，该术语总是包括纯的酸形式(3-羟基异丁酸)、纯的碱形式(3-羟基异丁酸盐)以及由酸的质子化和脱质子化形式所组成的混合物。此外，术语“3-羟基异丁酸”原则上不仅包括(R)-立体异构体而且包括(S)-立体异构体，其中特别优选的是(S)-立体异构体。
表述“与其野生型相比，它能够形成更多的3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸”还涉及这样的情况经基因工程改造的细胞的野生型完全不能形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸，或者至少不能形成可检测量的这些化合物；并且在经过基因工程改造之后才能形成可检测量的这些组分。
细胞的“野生型”优选地是指这样的细胞，其基因组以如同它自然地通过进化而形成的那种状态存在。该术语不仅用于整个细胞，而且用于单个基因。因此，术语“野生型”特别地不包括这样的细胞或这样的基因，其基因序列已由人借助于重组方法至少部分地进行了改变。
随后，通过小心的脱水反应从3-羟基异丁酸获得甲基丙烯酸。在基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的情况下，可以分离出细胞中所包含的充满这些聚羟基链烷酸的囊泡，随后裂解所述聚合物从而获得3-羟基异丁酸，其然后可以进行脱水从而获得甲基丙烯酸。
在此，根据本发明优选的是，在根据本发明的方法中所使用的、经基因工程改造的细胞是如此地经基因工程改造的，从而所述细胞在确定的时段内，优选地在2小时内，更优选地在8小时内和最优选地在24小时内，所形成的3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的量为所述细胞的野生型的至少2倍，特别优选地至少10倍，更优选地至少100倍，更加优选地至少1000倍和最优选地至少10000倍。在此，产物形成的增加可以例如通过下列方式来测定将在根据本发明的方法中所使用的细胞和野生型细胞各自分开地在相同的条件(相同的细胞密度、相同的培养基、相同的培养条件)下，在合适的培养基中培养经过确定的时段；随后测定培养基中目标产物(3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸)的量。
在根据本发明的方法中所使用的细胞可以是原核生物细胞或真核生物细胞。在此，可以涉及哺乳动物细胞(例如来自人的细胞)，植物细胞，或者微生物例如酵母、真菌或细菌，其中特别优选的是微生物，最优选的是细菌和酵母。
作为细菌、酵母或真菌，以细菌、酵母或真菌菌株形式保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)，Braunschweig，Deutschland)中的那些细菌、酵母或真菌是特别合适的。根据本发明合适的细菌属于在http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm中所列出的那些类别，根据本发明合适的酵母属于在http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm中所列出的那些类别，和根据本发明合适的真菌属于在http://www.dsmz.de/species/fungi.htm中所列出的那些类别。
根据本发明特别优选的是，使用下列属的细胞棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、糖酵母属(Saccharomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、耶氏酵母属(Yarrowia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)和梭菌属(Clostridium)，其中黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)、布兰克假丝酵母(Candidablankii)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)、运动发酵假单胞菌(Zymomonas mobilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(特别是富养罗尔斯通氏菌H16)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、善变副球菌(Paracoccusversutus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)是特别优选的。
依照根据本发明的方法的第一种变化形式，使用这样的细胞，在所述细胞中，3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为初产物的甲基丙二酸半醛来实现。
依照根据本发明的方法的该第一种变化形式的第一个特别的实施方案，优选的是，3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成优选地经由作为中间产物的琥珀酰辅酶A来实现，其中在根据本发明的方法的该实施方案中所使用的、经基因工程改造的细胞优选地能够利用碳水化合物、甘油或谷氨酸作为碳源。
在此，在根据本发明的方法的第一种变化形式的第一个特别的实施方案方面，可以是有利的是，在根据本发明的方法的该实施方案中所使用的、经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的酶E1的活性，所述酶E1催化琥珀酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A(见

图1)。
术语“增加的酶的活性”，如其在上文中在酶E1方面和在下面的关于酶E2等方面的论述中所使用的，优选地理解为增加的细胞内活性。
现在接下来的关于提高细胞中的酶活性的论述不仅适用于提高酶E1的活性，而且适用于下文提及的其活性任选地可以被提高的所有酶。
原则上，可以如此来获得酶活性的增加，即通过增加编码所述酶的基因序列的拷贝数，使用强启动子，或者利用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因，以及任选地将这些措施相组合。根据本发明经基因工程改造的细胞例如通过用载体进行转化、转导、接合或这些方法的组合来产生，所述载体包含所期望的基因、该基因的等位基因或其部分和使该基因能够表达的载体。特别地，异源表达通过将所述基因或等位基因整合到细胞的染色体中或染色体外复制型载体中来获得。
DE-A-100 31 999给出了关于用于提高细胞中的酶活性(例如丙酮酸羧化酶的酶活性)的可能性的综述，该文献在此引入作为参考，并且其关于用于提高细胞中的酶活性的可能性的公开内容构成本发明公开内容的一部分。
上文所提及的以及所有下文所提及的酶或基因的表达可借助于下列方式来检测1-和2-维蛋白质凝胶分离，和随后用相应的评价软件来光学鉴定凝胶中的蛋白质浓度。如果酶活性的提高仅基于相应基因的表达的提高，那么可以简单地通过在野生型细胞和经基因工程改造的细胞之间比较1-或2-维蛋白质分离来定量酶活性的提高。用于制备蛋白质凝胶(在棒状杆菌的情况下)和用于鉴定蛋白质的常用方法为Hermann等人(Electrophoresis，221712.23(2001))所描述的程序。也可以通过下列方式来分析蛋白质浓度用对于待检测的蛋白质特异的抗体来进行Western-印迹杂交(Sambrook等人，MolecularCloninga laboratory manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.USA，1989)，随后用相应的用于浓度测定的软件来进行光学评价(Lohaus和Meyer(1989)Biospektrum，532-39；Lottspeich(1999)，Angewandte Chemie 1112630-2647)。DNA结合蛋白的活性可以借助于DNA条带移位分析(也称为凝胶阻滞)来测量(Wilson等人，(2001)Journal ofBacteriology，1832151-2155)。DNA结合蛋白对于其他基因的表达的影响可以通过各种经充分描述的报道基因分析方法来检测(Sambrook等人，Molecular Cloninga laboratory manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.USA，1989)。细胞内的酶活性可以通过各种经描述的方法来测定(Donahue等人，(2000)Journal of Bacteriology 182(19)5624-5627；Ray等人，(2000)Journal of Bacteriology 182(8)2277-2284；Freedberg等人，(1973)Journal of Bacteriology 115(3)816-823)。如果在后面的论述中，没有说明用于测定特定酶的活性的具体方法，那么优选地借助于下列文献中所描述的方法来测定酶活性的增加以及酶活性的降低Hermann等人，Electophoresis，221712-23(2001)；Lohaus等人，Biospektrum 5 32-39(1998)；Lottspeich，Angewandte Chemie 1112630-2647(1999)；和Wilson等人，Journal of Bacteriology 1832151-2155(2001)。
如果酶活性的提高是通过内源基因的突变而实现的，那么这样的突变可以或者根据传统方法随机产生，例如通过UV辐射或通过诱发突变的化学药品；或者借助于基因工程方法例如删除、插入和/或核苷酸交换来达到。通过这些突变获得经基因工程改造的细胞。特别地，特别优选的酶突变体还是这样的酶，其不再是反馈可抑制的或者至少与野生型酶相比较而言其反馈可抑制性降低了。
如果酶活性的提高是通过提高酶的表达而实现的，那么就例如增加相应基因的拷贝数，或者使启动子和调控区域或位于结构基因上游的核糖体结合位点突变。同样地，嵌入至结构基因上游的表达盒也起作用。通过诱导型启动子另外还可能在任一时间点处增强表达。此外，也可以给酶基因分派所谓的“增强子”作为调控序列，其通过RNA聚合酶和DNA之间改善的相互作用也导致提高的基因表达。通过用于延长mRNA寿命的措施也可改善表达。此外，通过防止酶蛋白质的降解也可增强酶活性。在此，基因或基因构建体或者存在于具有不同拷贝数的质粒中，或者整合在染色体中并于其中进行扩增。备选地，所涉及的基因的过表达此外还可以通过改变培养基组成和培养条件来达到。本领域技术人员尤其可在Martin等人(Bio/Technology 5，137-146(1987))中，在Guerrero等人(Gene 138，35-41(1994))，在Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))中，在Eikmanns等人(Gene 102，93-98(1991))中，在EP-A-0 472 869中，在US4,601,893中，在Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))中，在Reinscheid等人(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，126-132(1994))中，在LaBarre等人(Journalof Bacteriology 175，1001-1007(1993))中，在WO-A-96/15246中，在Malumbres等人(Gene 134，15-24(1993))中，在JP-A-10-229891中，在Jensen和Hammer(Biotechnology andBioengineering 58，191-195(1998))中，以及在已知的遗传学和分子生物学教科书中找到关于此的指导。与突变一样，上面所描述的措施产生经基因工程改造的细胞。
为了提高各基因的表达，使用例如附加型质粒。合适的质粒特别为在棒状杆菌中进行复制的质粒。众多的已知质粒载体，例如pZ1(Menkel等人，Applied and Environmental Microbiology 64549-554(1989))、pEKEx1(Eikmanns等人，Gene 10769-74(1991))或pHS2-1(Sonnen等人，Gene 10769-74(1991))基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或pGA1。同样地，也可以使用其他质粒载体，例如基于pCG4(US 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人，FEMSMicrobiology Letters 66119-124(1990))或pAG1(US 5,158,891)的那些质粒。
此外，这样的质粒载体也是合适的，借助于所述质粒载体可以采用通过整合入染色体中来进行基因扩增的方法，如由Reinscheid等人(Applied and Environmental Microbiology 60126-132(1994))对于复制或扩增hom-thrB操纵子所描述的那样。在该方法中，将完整的基因克隆到质粒载体中，后者可以在宿主(通常为大肠杆菌(Escherichia coli))中进行复制，但不能在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中进行复制。作为载体，例如可以考虑pSUP301(Simon等人，Bio/Technology 1784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(

等人，Gene 14569-73(1994))、pGEM-T(Promega Corporation，Madison，Wisconsin，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman，Journal of Biological Chemistry 26932678-84(1994))、

Blunt(Invitrogen，Groningen，Niederlande)、pEM1(Schrumpf等人，Journal of Bacteriology 1734510-4516))或pBGS8(Spratt等人，Gene 41337-342(1986))。随后，包含待扩增的基因的质粒载体通过接合或转化而转移到所期望的谷氨酸棒杆菌菌株中。接合的方法例如在

等人，Applied andEnvironmental Microbiology 60756-759(1994)中进行了描述。转化的方法在例如在Thierbach等人，Applied Microbiology andBiotechnology 29356-362(1988)；Dunican和Shivnan，Bio/Technology 71067-1070(1989)；和Tauch等人，FEMSMicrobiology Letters 123343-347(1994)中进行了描述。在借助于“交换(cross-over)”事件进行同源重组后，所得的菌株包含至少两个拷贝的所涉及的基因。
在上文中和在下面的论述中所使用的表述“相对于其野生型而言增加的酶Ex的活性”优选地总是指，各酶Ex的活性增加到至少2倍，特别优选地至少10倍，更优选地至少100倍，更加优选地至少1000倍和最优选地至少10000倍。此外，在根据本发明的方法中所使用的、经基因工程改造的细胞(其具有“相对于其野生型而言增加的酶Ex的活性”)特别地也包括这样的细胞，所述细胞的野生型不具有该酶Ex的活性或至少不具有可检测的该酶Ex的活性，并且在提高所述酶活性之后(例如通过过表达)才显示出可检测的该酶Ex的活性。在这种情况下，术语“过表达”或者在下面的论述中所使用的表述“表达的提高”也包括这样的情况，即起始细胞例如野生型细胞不具有表达或至少不具有可检测的表达，并且只有通过重组方法才诱导出可检测的酶Ex的表达。
相应地，下面所使用的表述“降低的酶Ex的活性”优选地是指，降低为至少0.5倍，特别优选地至少0.1倍，更优选地至少0.01倍，更加优选地至少0.001倍和最优选地至少0.0001倍的活性。特定酶的活性的降低可以例如通过定向突变，通过添加竞争性或非竞争性抑制剂，或者通过本领域技术人员已知用于降低特定酶的表达的其他措施来实现。
催化琥珀酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A的酶E1优选地为甲基丙二酰辅酶A变位酶(EC 5.4.99.2)。优选地，该酶由选自下列的基因编码mut、mutA、mutB、sbm、sbmA、sbmB、sbm5、bhbA、mcmA、mcmA1、mcmA2、mcmB、mcm1、mcm2、mcm3、icmA、meaA1和meaA2。这些基因的核苷酸序列可以例如从“基因和基因组京都百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)”(KEGG数据库)、国家医学图书馆(National Library of Medicine)(Bethesda，MD，USA)的国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI)的数据库或者欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecular Biologies Laboratories)(EMBL，Heidelberg，Deutschland或Cambridge，UK)的核苷酸序列数据库获取。
依照根据本发明的方法的第一种变化形式的一个特别优选的实施方案，酶E1为来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的甲基丙二酰辅酶A变位酶，其由具有根据SEQ ID NO01的DNA序列编码并具有根据SEQ IDNO02的氨基酸序列。
此外，依照根据本发明的方法的第一个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸时形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，优选的是，依照根据本发明的方法的该备选方案所使用的经基因工程改造的细胞，任选地除了增加的酶E1的活性外，还具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4中至少一种酶的活性(见图2) -酶E2，其催化甲基丙二酰辅酶A转化为甲基丙二酸； -酶E3，其催化甲基丙二酸转化为甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
根据本发明，特别地使用这样的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E2、E3、E4、E2E3、E2E4、E3E4、E2E3E4，其中E2E3E4是最优选的。此外，也可能的是，酶还能够催化至少两个前面所描述的反应步骤。因此，例如可以使用这样的酶，其不仅具有酶E2的活性，而且具有酶E3的活性(因而催化甲基丙二酰辅酶A直接转化为甲基丙二酸半醛)，例如来自Sulfolobus tokodaii的丙二酰辅酶A还原酶，其由具有SEQ ID NO03的DNA序列编码并且具有根据SEQ ID NO04的氨基酸序列；或者可以使用这样的酶，其具有所有三种酶活性E2、E3和E4，如来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酰辅酶A还原酶(Hügler等人，Journal of Bacteriology 184，第2404-2410页，2002)。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E2为甲基丙二酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.17)， 酶E3为醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)或醛氧化酶(EC 1.2.3.1)，和 酶E4为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
优选地，酶E2由aox1基因编码。来自大鼠肝脏的甲基丙二酰辅酶A水解酶例如描述于Kovachy等人，“Recognition，isolation，andcharacterization of rat liver D-methylmalonyl coenzyme Ahydrolase”，J.Biol.Chem.258(1983)，第11415-11421页中。
优选地，酶E3由选自下列的基因编码aldh2、aldh3a1、aldh3a2、aldh1b1、aldh9a1、aldh7a1、aldh1a4、aldh1a1、aldh1a2、mgc80785、mgc83352、mgc89020、dmel-CG31075、cg3752、cg9629、alh-9、alh-1、alh-2、f508.35、t7023.15、f15I1.19、tT17F15.130、ald1、ald2、ald4、ald5、ald6、ac1044Wp、adr417wp、msc7、tb06.5F5.780、aldH、puuC、putA、aldA、badH、alkH、pcD、rsp1591、rs01031、exaC、acoD、dhaL、pchA、aldB、dhaS、betB、ywdH、ycbD、aldX、aldY、aldA1、aldA2、aldC、pcd、cg10546、cg12668、cg12796、scg11A.05、sci30A.27c、sce9.27c、sck13.05c、sc5H4.03、thcA、gabD2、alkH、aldH、aldH1、aldY1、aldY2、aldY3、aldY4、aldY5、aldY6、aldY7和aldhT。
酶E4的合适的基因选自hibadh、cg15093、cg15093、cg4747、mwL2.23、t13k14.90、f19b15.150、hibA、ygbJ、mmsB、mmsB、garR、tsar、mmsB-1、mmsB-2、yfjR、ykwC、ywjF、hibD、glxR、SCM1.40c、hibD、ehhahd、hadh2、hadhsc、hsd17B4、loc488110、had、mgC81885、hadh2-prov、cg3415、cg7113、ech-1、ech-8、ech-9、ard-1、yfcX、fadB、faoA、fadB2x、hbd-1、hbd-2、hbd-3、hbd-4、hbd-5、hbd-6、hbd-7、hbd-8、hbd-9、hbd-10、fadJ、rs04421、rs02946、rs05766、bbsD、bbsC、fadB1、fadB2、fadB5、hbdA、pimF、fabJ-1、fabJ、scbac19f3.11、sci35.13、scbac8d1.10c、sc5f2a.15、sc6a5.38、fadC2、fadC4、fadC5、fadC6、had和paaH。其他合适的3-羟基异丁酸脱氢酶例如描述于下列文献中Bannerjee等人，(1970)，J.Biol.Chem，245，第1828至1835页；Steele等人，(1992)，J.Biol.Chem.，267，第13585至13592页；Harris等人，(1988)，J.Biol.Chem.，263，第327至331页；Harris等人，Biochim.Biophys.Acta，1645(1)，第89至95页；Hawes等人，(2000)，Methods Enzymol.，324，第218至228页；Harris等人，J.Biol.Chem.，275(49)，第38780至38786页；Rougraff等人，(1988)，J.Biol.Chem.，263(1)，第327至331页；Robinson等人，J.Biol.Chem.，225，第511至521页；Hawes等人，(1995)，Biochemistry，34，第4231至4237页；Hasegawa J.(1981)，Agric.Biol.Chem.，45，第2805至2814页；Hawes等人，(1996)，FEBS Lett.，389，第263至267页；Hawes等人，(1996)，Enzymology and Molecular Biology of CarbonylMetabolism，Plenum Press，New York，第395至402页；Adams等人，(1994)，Structure，2，第651至668页；Zhang等人，(1999)，Biochemistry，38，第11231至11238页；Mirny等人，(1999)，J.Mol.Biol.，291，第177至196页；和Lokanath等人，(2005)，J MolBiol.。这些出版物的公开内容在此引入作为参考，并且构成本发明公开内容的一部分。
酶E2至E4的上述基因以及其他基因的核苷酸序列尤其还可以

KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
依照根据本发明的方法的该备选方案的一个特别优选的实施方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸时形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，优选的是，关于使甲基丙二酰辅酶A转化为甲基丙二酸半醛，使用来自Sulfolobus tokodaii的丙二酰辅酶A还原酶，其由具有SEQ ID NO03的DNA序列编码并且具有根据SEQ ID NO04的氨基酸序列。根据该变化形式的另一个特别优选的实施方案，关于使甲基丙二酰辅酶A转化为3-羟基异丁酸，使用来自橙色绿屈挠菌的丙二酰辅酶A还原酶(Hügler等人，Journalof Bacteriology 184，第2404-2410页，2002)。
此外，在根据本发明的方法的第一个特别的实施方案的该第一个备选方案方面，优选的是，根据该实施方案所使用的、经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言降低的酶E5的活性，所述酶E5具有从甲基丙二酸半醛向丙酰辅酶A的转化，其中该酶优选地为甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.27)。
依照根据本发明的方法的第二个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸时形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，优选的是，所述细胞，任选地除了增加的酶E1的活性外，还具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4至E7中至少一种酶的活性(见图3) -酶E6，其催化(R)-甲基丙二酰辅酶A转化为(S)-甲基丙二酰辅酶A； -酶E7，其催化(S)-甲基丙二酰辅酶A转化为丙酰辅酶A； -酶E5，其催化丙酰辅酶A转化为甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
根据本发明，特别优选地使用这样的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E4、E5、E6、E7、E4E5、E4E6、E4E7、E5E6、E5E7、E6E7、E4E5E6、E4E5E7、E4E6E7、E5E6E7和E4E5E6E7，其中E4E5E6E7是最优选的。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E6为甲基丙二酰辅酶A差向异构酶(EC 5.1.99.1)， 酶E7为甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(EC 4.1.1.41)， 酶E5为甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.27)，和 酶E4为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
在此，优选的酶E4为已经在上文中在根据本发明的方法的第一个优选实施方案的第一种变化形式方面作了描述的那些。
优选地，酶E6由mcee基因编码。合适的甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(酶E7)例如由Benning等人在Biochmistry，Vol.39(2000)，第4630-4639页中进行了描述。
优选地，酶E5的合适的基因选自aldh6a1、cg17896、t22c12.10、ald6、putA1、mmsA、mmsA-1、mmsA-2、mmsA-3、mmsA-4、msdA、iolA和iolAB。
优选地，酶E7的合适的基因选自mmdA、bcc、oadB、oadB2、oadB3、SC1C2.16、SC1G7.10、pccB1、accA2、mmdB、mmdC和ppcB。
酶E5、E6和E7的上述基因的核苷酸序列尤其还可以从KEGG数据库获取。
依照根据本发明的方法的第三个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸时形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，优选的是，所述细胞，任选地除了增加的酶E1的活性外，还具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4、E5和E7中至少一种酶的活性(见图4) -酶E7，其催化甲基丙二酰辅酶A转化为丙酰辅酶A； -酶E5，其催化丙酰辅酶A转化为甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
该途径基本上相应于根据本发明的方法的第一个优选实施方案的第二种变化形式，然而其中与第二种变化形式不同，直接从甲基丙二酰辅酶A制备丙酰-CoA。关于酶E4、E5和E7的优选的酶和基因为已经在上文中在第二种变化形式方面被提及的那些基因或酶。
此外，依照根据本发明的方法的第一个特别的实施方案(和还有依照所有在下面所描述的实施方案)，也可以是优选的是，使用经基因工程改造的细胞，所述细胞能够将所形成的3-羟基异丁酸转变成聚羟基链烷酸。这样的聚羟基链烷酸被许多微生物以强折光性颗粒的形式贮存在细胞内。在这种情况下，特别优选的是，在根据本发明的方法所使用的、经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的下列酶E8和E9中至少一种酶(优选地这两者)的活性(见图5) -酶E8，其催化3-羟基异丁酸转化为3-羟基异丁酰辅酶A； -酶E9，其催化3-羟基异丁酰辅酶A转化为基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E8为3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，和 酶E9为聚羟基链烷酸合酶。
如在上文中已经说明的，在根据本发明的方法的第一个优选实施方案的情况下，从作为中间产物的琥珀酰辅酶A和从作为初产物的甲基丙二酸半醛产生3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸。在此，原则上可能合适的是，除了影响上文所提及的酶活性E1至E9中的一种或多种酶活性外，还影响这样的酶活性，该酶活性导致细胞中琥珀酰辅酶A的形成的提高。
如果依照根据本发明的方法的第一种变化形式的第一个特别的实施方案，经由作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛从碳水化合物或甘油来形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸，那么依照在上文中所描述的根据本发明的方法的第一个、第二个或第三个备选方案之中一个特别的布置方案，优选的是，所使用的经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E10和E11中至少一种酶(优选地这两者)的活性(见图6) -酶E10，其催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸； -酶E11，其催化丙酮酸转化为草酰乙酸。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E10为磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.31)，和 酶E11为丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1)。
优选地，酶E10由选自下列的基因编码f12m16.21、f14n22.13、k15m2.8、ppc、clpA、pepC、capP、cgl1585、pepC、pck、ppc和pccA，其中ppc基因是特别优选的。特别地，根据本发明优选的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶还描述于US 4,757,009、US 4,980,285、US 5,573,945、US 6,872,553和US 6,599,732中。这些出版物中关于磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的公开内容在此引入作为参考，并且构成本发明公开内容的一部分。
优选地，酶E11由选自下列的基因编码pc、pcx、cg1516、cg1516、pyc-1、pyc-2、aar162Cp、pyr1、accC-2、pycA、pycA2、pca、cgl0689、pyc、pycB、accC、oadA、acc和accC1，其中pyc基因是特别优选的。特别地，根据本发明优选的丙酮酸羧化酶还描述于US 6,455,284、US6,171,833、US 6,884,606、US 6,403,351、US 6,852,516和US6,861,246中。其他根据本发明特别优选的丙酮酸羧化酶为在″A novelmethodology employing Corynebacterium glutamicum genomeinformation to generate a new L-lysine-producing mutant″，Ohnishi J等人，Applied Microbiology and Biotechnology，Vol.58(2)，第217-223页(2002)中所描述的那种突变体。
酶E10和E11的合适的基因的核苷酸序列可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
从草酰乙酸-中间阶段开始，存在有几种可能性来达到琥珀酰辅酶A，其然后可以借助于开头所提及的三种变化形式经由甲基丙二酰辅酶A而转化为3-羟基异丁酸。
第一条途径经由作为中间产物的富马酸而前行。在该情况下，依照在上文中所描述的根据本发明的方法的第一个、第二个或第三个备选方案之中第一个特别的布置方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中形成作为初产物的甲基丙二酸半醛和作为中间产物的琥珀酰辅酶A)，优选的是，所述细胞，任选地除了增加的酶E10或E11的活性外，还具有相比于其野生型而言增加的下述酶E12至E15中至少一种酶的活性(见图7) -酶E12，其催化草酰乙酸转化为苹果酸； -酶E13，其催化苹果酸转化为富马酸； -酶E14，其催化富马酸转化为琥珀酸； -酶E15，其催化琥珀酸转化为琥珀酰辅酶A。
在此，根据本发明特别地使用这样的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E12、E13、E14、E15、E12E13、E12E14、E12E15、E13E14、E13E15、E14E15、E12E13E14、E12E13E15、E12E14E15、E13E14E15、E12E13E14E15，其中E12E13E14E15是最优选的。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E12为苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.37)或苹果酸-醌氧化还原酶(1.1.99.16)， 酶E13为富马酸水合酶(EC 4.2.1.2)， 酶E14为琥珀酸脱氢酶(EC 1.3.99.1或EC 1.3.5.1)或琥珀酸-醌氧化还原酶(1.3.5.1)，和 酶E15为琥珀酸-辅酶A连接酶(EC 6.2.1.4或EC 6.2.1.5)。
优选地，酶E12由选自下列的基因编码mdh1、mdh2、mor1、cg10748、cg10749、cg5362、mdh-1、f46e10.10、f19p19.13、f12m16.14、t30120.4、k15m2.16、f1p2.70、f17i14.150、mn112.18、mik19.17、mdh3、adl164cp、adr152cp、adr252wp、mdhA、mdhC、mdhB、ybiC、mdh、yiaK、ybiC、allD、citH、yjmC、citH、cg12380、ldh、sqdB、mqo、yojH、mqoA、mqoB、mqo1、mqo2、mqo3、mqo4和cgl2001，其中mqo基因和mdh基因是特别优选的。
优选地，酶E13由选自下列的基因编码fh、fh1、sc4094、sc4095、t30b22.19、k3k7.11、acr013Cp、fum1、fum2、fum3、fum4、fumH、fumA、fumB、fumC、fumC1、fumC2、fum、ttdA、ttdB、fumB-alpha、fumB-beta、citG、citB、fumX、fum-1和fum-2，其中fum基因是特别优选的。
优选地，酶E14由选自下列的基因编码sdh1、sdh2、sdh3、sdh4、sdh5、sdh6、osm1、osm2、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、frdA、frdB、frdC、frdD、ifcA-1、ifcA-2、sdhB-1、sdhB-2、frdC2、cgl0370、cgl0371、cgl0372、scm10.10c、scm10.11c、scm10.12c、sc5g8.25c、sc5g8.26c、scbac-31e11.02c、scbac31e11.02c、sc4b10.10c、sdhA2、sdhB2、sdhA1、sdhB1、qcrB2、sdhA3、sdhB3、frdB1和frdB2，其中基因sdhA、sdhB和sdhC是特别优选的。
优选地，酶E15由选自下列的基因编码suclg1、suclg2、loc434885、cg10622、dmel-CG6255、f11a3.3、f8115.30、mkd15.11、lsc1、lsc2、ae1211wp、afr134cp、scsA、scsB、sucC和sucD。
酶E12至E15的合适的基因的核苷酸序列依旧同样还是可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
如果提高酶E12至E15中一种或多种酶的活性，那么还经证明有利的是，所述细胞具有相比于其野生型而言降低的下述酶E16至E23之一的活性 -酶E16，其催化草酰乙酸转化为柠檬酸； -酶E17，其催化苹果酸转化为草酰乙酸； -酶E18，其催化琥珀酰辅酶A转化为琥珀酸； -酶E19，其催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸； -酶E20，其催化草酰乙酸转化为丙酮酸； -酶E21，其催化草酰乙酸转化为天冬氨酸； -酶E22，其催化苹果酸转化为丙酮酸； -酶E23，其催化丙酮酸转化为乙酸。
在此，根据本发明特别优选的细胞为这样的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是降低的E16、E17、E18、E19、E20、E21和E16E17E18E19E20E21E22E23。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E16为柠檬酸合酶(EC 2.3.3.1或EC 2.3.3.8)， 酶E17为苹果酸氧化酶(EC 1.1.3.3)， 酶E18为琥珀酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.3)， 酶E19为磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(EC 4.1.1.49或4.1.1.32)， 酶E20为草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)， 酶E21为天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)， 酶E22为苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.38、EC 1.1.1.39或EC1.1.1.40)， 酶E23为丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.1.51)。
优选地，酶E16由选自下列的基因编码glt、cs、csl、cg3861、cts-1、f7f19.21、f4i1.16、t20n10.90、t20n10.100、t209.80、cit1、cit2、cit3、aar004cp、agr002wp、cshA、gltA、citZ、cit、prpC、cisY、cis、mmgD、citA、gltA1、gltA2、gltA3、cg10829、prpC1、scd10.20、citA1、citA2、citA3、acly、cg8322、f5e6.2、k7jJ8.14和citE，其中gltA是最优选的。
优选地，酶E19由选自下列的基因编码pckA、pck1、pck2、cg10924、cg17725、cg17725、pckG、ppcK、cg12863、pck和2sck36.02。
优选地，酶E20由选自下列的基因编码oadA、oadB、oadC、oadG、oag3、eda、dcoA、oadA1、oadA2、pycB和mmdB。
优选地，酶E21由选自下列的基因编码myn8.7、glt1、adr290wp、gltB、gltD、glt1、gls1、gltA、glt、glxD、gltD1、gltD2、gdh2、agl040Cp、gdhA1、gdhA、gdhA2、gluD、gluD1、gluD2、rocG、ypcA、gudB、t11i18.2、t2i1.150、mrg7.13、f19c24.7、gdh、gdh1、gdh2、gdh3、got1、got2、cg4233、cg8430、f23n19.17、f13j11.16、t26c19.9、f7f1.18、F10N7.200、t1611.170、f15n18.110、t20d1.70、aat1、aat2、abl038wp、afr211cp、agx1、bna4、aatA、aatB、ybdL、aspC、yfbQ、aat、avtA1、avtA2、tyrB、avtA、avtB、argD1、argD2、aspB1、aspB2、aspB3、aspB、aspC1、aspC2、aspC3、aspC4、RS05143、aspAT、ywfG、yhdR、argD、mtnV、alaT、hisC、avtA1、avtA2、avtA3、cg10240、cgl1103、cgl2599、cgl2844、2sck36.07c、sc9e12.21、sc2h4.04c、tyrB、gtp、gtp1、gtp2、cg1640、f20d23.34、f26f24.16、f24j13.15、t10d10.20和agr085wp，其中aspC、aatA、gdh、gudB、gdhA、gltB和gltD是特别优选的。
优选地，酶E21由选自下列的基因编码myn8.7、glt1、adr290wp、gltB、gltD、glt1、gls1、gltA、glt、glxD、gltD1、gltD2、gdh2、agl040Cp、gdhA1、gdhA、gdhA2、gluD、gluD1、gluD2、rocG、ypcA， 优选地，酶E22由选自下列的基因编码me、me1、me2、me3、mae、mae1、mae2、sfcA、sfcA1、maeA、maeB、tme、yqkJ、ywkA、yqkJ、malS、ytsJ、mleA、mleS、mez、sce59.10c、2sc7g11.23、malS1、malS2、dme、maeB1、maeB2、mdh、mdh1、mdh2、dmel_cg10120、dmel_cg10120、dmel-cg5889、f19k16.27、f6f22.7、t22p22.60、f18a17.1、mod1、tme、mao、cgl3007、malS和malE。
优选地，酶E23由选自下列的基因编码me、me1、me2、me3、mae、mae1、mae2、sfcA、sfcA1、maeA、maeB、tme、yqkJ、ywkA、yqkJ、malS、ytsJ、mleA、mleS、mez、sce59.10c、2sc7g11.23、malS1、malS2、dme、maeB1、maeB2、mdh、mdh1、mdh2、dmel_cg10120、dmel_cgl0120、dmel-cg5889、f19k16.27、f6f22.7、t22p22.60、f18a17.1、mod1、tme、mao、cg13007、malS和malE。
此外，根据本发明优选的是，在借助于上文所描述的途径(草酰乙酸-＞苹果酸-＞富马酸-＞琥珀酰辅酶A)来实现细胞中增加的琥珀酰辅酶A的供给这样的情况下，还有针对性地增加细胞中还原当量

的供给。
增加还原当量的一种可能性在于增加氧化戊糖磷酸途径。在这种情况下，特别优选的是，提高葡糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)和/或6-磷酸葡糖酸脱氢酶(EC 1.1.1.44)(其优选地由gnd基因编码)的活性，并且任选地同时抑制糖酵解，例如通过减弱葡糖-6-磷酸异构酶的活性，如在WO-A-01/07626中所描述的那样。除了有针对性地促进戊糖磷酸途径外，或者代替有针对性地促进戊糖磷酸途径，可以是进一步优选的是，通过下述方式供给还原当量，即给细胞提供乙醇作为碳源并且促进在细胞中借助于醇脱氢酶(EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.71或EC 1.1.99.8)将乙醇转化为乙醛和借助于乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)将乙醛进一步转化为乙酰辅酶A。醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的合适的基因依旧同样可以从技术人员已知的基因数据库，例如KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
从草酰乙酸至琥珀酰辅酶A的第二条途径经由作为中间产物的柠檬酸而前行。在该情况下，依照在上文中所描述的根据本发明的方法的第一个、第二个或第三个备选方案之中第二个特别的布置方案，优选的是，使用经基因工程改造的细胞，其任选地除了增加的酶E10或E11的活性外，还具有相比于其野生型而言增加的下述酶E13至E16和E24至E26中至少一种酶的活性(见图8) -酶E16，其催化草酰乙酸转化为柠檬酸； -酶E24，其催化柠檬酸转化为异柠檬酸； -酶E25，其催化异柠檬酸转化为乙醛酸和琥珀酸； -酶E26，其催化乙醛酸转化为苹果酸； -酶E13，其催化苹果酸转化为富马酸； -酶E14，其催化富马酸转化为琥珀酸； -酶E15，其催化琥珀酸转化为琥珀酰辅酶A。
在此，根据本发明特别优选的细胞为这样的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是提高的E13、E14、E15、E16、E24、E25、E26、E13E14、E13E15、E13E16、E13E24、E13E25、E13E26、E14E15、E14E16、E14E24、E14E25、E14E26、E15E16、E15E24、E15E25、E15E26和E13E14E15E16E24E25E26，其中E13E14E15E16E24E25E26是最优选的。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E13为富马酸水合酶(EC 4.2.1.2)， 酶E14为琥珀酸脱氢酶(EC 1.3.99.1或EC 1.3.5.1)或琥珀酸-醌氧化还原酶(1.3.5.1)， 酶E15为琥珀酸-辅酶A连接酶(EC 6.2.1.4或EC 6.2.1.5)， 酶E16为柠檬酸合酶(EC 2.3.3.1或EC 2.3.3.8)， 酶E24为乌头酸水合酶(EC 4.2.1.3)， 酶E25为异柠檬酸裂合酶(EC 4.1.3.1)，和 酶E26为苹果酸合酶(EC 2.3.3.9)。
酶E13至E16的优选的基因为已经在上文中在从草酰乙酸至琥珀酰辅酶A的第一条途径方面作了描述的那些。
优选地，酶E24由选自下列的基因编码aco1、aco2、ratireb、dmel-CG4706、dmel-CG4900、dmel-cg6342、cg9244、t3p4.5、f10m23.310、f4b14.100、adl032Wp、afr629wp、acnA、acnB、acnC、acnD、rpfA、acnA1、acnA2、acnM、citB、leuC、cgl1540、sacA、can和aco，其中acnA和acnB是特别优选的。
优选地，酶E25由选自下列的基因编码msd21.4、ic11、ic12、adl066cp、agl057wp、aceA、icl、aceAa、aceAb、cgl0097和cgl2331，其中aceA是特别优选的。根据一个特别的实施方案，这样的基因是优选的，所述基因编码在基因水平或蛋白质水上失调的异柠檬酸裂合酶。
优选地，酶E26由选自下列的基因编码med24.5、mlsS1、acr268cp、masA、glcB、aceB、mls、glcB-1、glcB-2、cgl2329、masZ、aceB1、aceB2和mas，其中aceB基因是特别优选的。
在此，酶E24至E26的合适的基因的核苷酸序列还是可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
当通过增加酶E10或E11的活性来促进从磷酸烯醇丙酮酸或从丙酮酸供给草酰乙酸时，在通过异柠檬酸裂合酶裂解异柠檬酸时除了乙醛酸外所形成的琥珀酸也可以用于形成琥珀酰辅酶A。此外，在从草酰乙酸至琥珀酸的该第二条途径的情况下，可以是有利的是，降低酶E27的活性，所述酶E27催化异柠檬酸转化为2-酮戊二酸并且优选地为异柠檬酸脱氢酶(EC 1.1.1.41或EC 1.1.1.42)。优选地，异柠檬酸脱氢酶为由选自下列的基因编码的酶idh1、idh2、cg7176、cg7176、cg7176、f20d21.16、f12p19.10、t15n1.80、idp1、idp2、idp3、aal022Wp、aer061Cp、idhC、idhM、icdA、icd、idh、icd1、icd2、leuB、citC、citC、cgl0664、leuB2、idh3A、idg3B、idh3G、cg12233、dmel-CG5028、dmel-CG6439、f6p23.14、f23e12.180、f8d20.160、f12e4.20、adl223wp和afr137cp，其中icdA和citC是特别优选的。
从草酰乙酸至琥珀酰辅酶A的第三条途径经由作为中间产物的2-酮戊二酸而前行。在该情况下，依照在上文中所描述的根据本发明的方法的第一个、第二个或第三个备选方案的第三个特别的布置方案，优选的是，使用经基因工程改造的细胞，其任选地除了增加的酶E10或E11的活性外，还具有相比于其野生型而言增加的下述酶E16、E24、E27和E28中至少一种酶的活性(见图9) -酶E16，其催化草酰乙酸转化为柠檬酸； -酶E24，其催化柠檬酸转化为异柠檬酸； -酶E27，其催化异柠檬酸转化为2-酮戊二酸； -酶E28，其催化2-酮戊二酸转化为琥珀酰辅酶A。
在此，根据本发明特别优选的细胞为这样的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是提高的E16、E24、E27、E28、E16E24、E16E27、E16E28、E24E27、E24E28、E27E28、E16E24E27、E16E24E28、E24E27E28和E16E24E27E28，其中E16E24E27E28是最优选的。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E16为柠檬酸合酶(EC 2.3.3.1或EC 2.3.3.8)， 酶E24为乌头酸水合酶(EC 4.2.1.3)， 酶E27为异柠檬酸脱氢酶(EC 1.1.1.41或EC 1.1.1.42)，和 酶E28为2-酮戊二酸合酶(EC 1.2.7.3)。
酶E16、E24和E27的优选的基因为已经在上文中在从草酰乙酸至琥珀酰辅酶A的第一条和第二条途径方面作了描述的那些。
优选地，酶E28由选自下列的基因编码korA、korB、korD、korA1、korA2、korB1、korB2、oorA、oorB、oorC、oorD、oforA、oforB、porA、porB、porA1、porA2、porA3、porA4、porG、porG1、porG2、porB1、porB2、porB3、SCD20.12c、SCD20.13c、SCAH10.34c、SCAH10.35c、korG、orA、orB、korG1和korG2。此外，E28还可以为由具有不同的酶活性的几个亚基组成的脱氢酶复合物。特别地，可以涉及包含酮戊二酸脱氢酶(EC 1.2.4.2)、二氢硫辛酸脱氢酶(EC1.8.1.4)和二氢硫辛酰赖氨酸残基-琥珀酰基转移酶(EC 2.3.1.61)的脱氢酶复合物。在此，优选地，酮戊二酸脱氢酶(EC 1.2.4.2)由选自下列的基因编码ogdh、ghdhl、loc239017、mgc68800、mgc80496、cg11661、t22e16.70、mpA24.10、kgd1、aer374cp、sucA、odhA、kgdA和cgl1129，其中sucA和odhA是特别优选的。优选地，二氢硫辛酸脱氢酶(EC 1.8.1.4)由选自下列的基因编码dld、dld-prov、dldh、cg7430、t2j15.6、k14a17.6、at3g17240、mgd8.71pd1、afr512wp、dld1、lpd、tb03.26j7.650、tb04.3m17.450、tb927.8.7380、tb08.10k10.200、lpdA、lpdG、lpdV、lpd3、acoD、lpdA1、lpdA2、lpdA3、odhL、pdhD、pdhD1、pdhD2、pdhD3、pdhD42、lpdAch1、lpdAch2、lpdAc、acoL、bfmbC、bkdD、cgl0366、cgl0688、scm1.17c、pdhL、sck13.11、lpdB2和dld1，其中lpd是特别优选的。在此，优选地，二氢硫辛酰赖氨酸残基-琥珀酰基转移酶(EC 2.3.1.61)由选自下列的基因编码dlst、dlst-prov、mgc89125、dmel_CG5214、f10m23.250、k13p22.8、kgd2agl200wp、kgd2、odhB、sucB、aceF、kgdB、sucB1、sucB2、pdhC、dlaT、kgd、sc5F7.20和sc4B10.24c，其中sucB和odhB是特别优选的。
酶E28或上文所提及的酶E28的亚基的合适的基因的核苷酸序列依旧同样可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
上文所描述的从草酰乙酸至琥珀酰辅酶A的途径开始于作为底物前体的磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸。在这种情况下，可以是进一步优选的是，所述细胞如此地经基因工程改造，从而其可以从碳水化合物和/或甘油提供特别大量的丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸。
如果细胞可以利用甘油作为培养物来源，那么优选的是，在根据本发明的方法中所使用的、经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E29至E42中至少一种酶(优选地所有酶)的活性 -酶E29，其使得甘油易于扩散入细胞中， -酶E30，其催化甘油转化为甘油-3-磷酸， -酶E31，其催化甘油-3-磷酸转化为二羟丙酮磷酸， -酶E32，其催化硫转移至硫接纳体硫氧还蛋白1， -酶E33，其催化磷脂水解从而形成醇和甘油， -酶E34，其催化甘油-3-磷酸通过交换磷酸而转运入细胞中， -酶E35，其催化二羟丙酮磷酸转化为甘油醛-3-磷酸， -酶E36，其催化甘油醛-3-磷酸转化为1，3-二磷酸甘油酸， -酶E37，其催化1，3-二磷酸甘油酸转化为3-磷酸甘油酸， -酶E38，其催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸， -酶E39，其催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇丙酮酸， -酶E40，其催化磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸， -酶E41，其催化甘油转化为二羟丙酮， -酶E42，其催化二羟丙酮转化为二羟丙酮磷酸。
在此，根据本发明特别优选的细胞为这样的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是降低的E29、E30、E31、E32、E33、E34、E35、E36、E37、E38、E39、E40、E41、E42、E29E30、E29E31、E29E32、E29E33、E29E34、E29E35、E29E36、E29E37、E29E38、E29E39、E29E40、E29E41、E29E42、E30E31、E30E32、E30E33、E30E34、E30E35、E30E36、E30E37、E30E38、E30E39、E30E40、E30E41、E30E42、E31E32、E31E33、E31E34、E31E35、E31E36、E31E37、E31E38、E31E39、E31E40、E31E41、E31E42、E32E33、E32E34、E32E35、E32E36、E32E37、E32E38、E32E39、E32E40、E32E41、E32E42、E33E34、E33E35、E33E36、E33E37、E33E38、E33E39、E33E40、E34E41、E33E42、E34E35、E34E36、E34E47、E34E38、E34E39、E34E40、E34E41、E34E42、E35E36、E35E37、E35E38、E35E39、E35E40、E35E41、E35E42、E36E37、E36E38、E36E39、E36E40、E36E41、E36E42、E37E38、E37E39、E37E40、E37E41、E37E42、E38E39、E39E40、E39E41、E39E42、E40E41、E40E42、E41E42和E29E30E31E32E33E34E35E36E37E38E39E40E41E42。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E29为水甘油孔蛋白(Aquaglyceroporin)(甘油易化蛋白)，其优选地由glpF基因编码， 酶E30为甘油激酶(EC 2.7.1.30)，其优选地由glpK基因编码， 酶E31为甘油-3-磷酸脱氢酶(EC 1.1.99.5)，优选地FAD-依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶，其中所述甘油-3-磷酸脱氢酶优选地由glpA基因、glpB基因、glpC基因或glpD基因，特别优选地由glpD基因编码， 酶E32为硫转移酶，其由glpE基因编码， 酶E33为甘油磷酸二酯酶(EC 3.1.4.46)，其优选地由glpQ基因编码， 酶E34为甘油-3-磷酸通透酶，其优选地由glpT基因编码， 酶E35为丙糖磷酸异构酶(EC 5.3.1.1)， 酶E36为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.12)， 酶E37为磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)， 酶E38为磷酸甘油酸变位酶(EC 5.4.2.1)， 酶E39为烯醇化酶(EC 4.2.1.11)， 酶E40为丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)， 酶E41为甘油脱氢酶(EC 1.1.1.6)，其优选地由gldA基因编码，和 酶E42为二羟丙酮激酶(EC 2.7.1.29)，其优选地由dhaK基因编码。
上文所提及的酶的基因序列依旧同样可以从技术人员已知的基因数据库，特别是KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
此外，还从其他来源知晓编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，Journal of Bacteriology 1746076-6086)、编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)和编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，Journal of Bacteriology 1746076-6086)。
用已知的酶E29至E42的基因，可以制备这样的经基因工程改造的细胞，在所述细胞中，酶E29至E42中至少一种酶，特别优选地至少两种酶，更加优选地至少三种酶和最优选地所有酶的活性通过开头在酶E1方面所描述的技术(酶的突变或酶表达的增加)而得到提高。这些细胞能够在作为唯一碳源的甘油(或者与作为进一步的碳源的碳水化合物一起)存在下进行培养。
除了提高酶活性E29至E42中的一种或多种酶活性外，当细胞能够利用甘油作为碳源时，如果在根据本发明的方法中所使用的细胞之中表达，优选地异源表达下列基因，那么这也可以是有利的 -glpG基因或3925基因， -glpX基因， -dhaR基因、ycgU基因或b1201基因， -fsa基因、mipB基因、ybiZ基因或B0825基因， -talC基因、fsaB基因、yijG基因或b3946基因。
这些基因的核苷酸序列依旧同样可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
如果细胞可以利用碳水化合物作为培养物来源，那么优选的是，在根据本发明的方法中所使用的细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E43至E45和E36至E40中至少一种酶(优选地所有酶)的活性 -酶E43，其催化α-D-葡糖-6-磷酸转化为β-D-果糖-6-磷酸， -酶E44，其催化β-D-果糖-6-磷酸转化为β-D-果糖-1，6-二磷酸， -酶E45，其催化β-D-果糖-1，6-二磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和二羟丙酮磷酸， -酶E36，其催化甘油醛-3-磷酸转化为1，3-二磷酸甘油酸， -酶E37，其催化1，3-二磷酸甘油酸转化为3-磷酸甘油酸， -酶E38，其催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸， -酶E39，其催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇丙酮酸，和 -酶E40，其催化磷酸烯醇丙酮酸转化为丙酮酸。
在此，根据本发明特别优选的经基因工程改造的细胞为这样的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E36、E37、E38、E39、E40、E43、E44、E45、E36E37、E36E38、E36E39、E36E40、E36E43、E36E44、E36E45、E37E38、E37E39、E37E40、E37E43、E37E44、E37E45、E38E39、E38E40、E38E43、E38E44、E38E45、E39E40、E39E43、E39E44、E39E45、E40E43、E40E44、E40E45、E43E44、E43E45、E44E45和E36E37E38E39E40E43E44E45。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E43为葡糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)， 酶E44为6-磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11)， 酶E45为果糖二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)， 酶E36为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.12)， 酶E37为磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)， 酶E38为磷酸甘油酸变位酶(EC 5.4.2.1)， 酶E39为烯醇化酶(EC 4.2.1.11)，和 酶E40为丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)。
这些基因的核苷酸序列依旧同样可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
此外，当细胞能够利用碳水化合物作为碳源时，优选的是，除了上述酶E43至E45和E36至E40的活性外，细胞中葡萄糖的摄取也得到提高，例如通过提高磷酸转移酶系统的酶(特别是由ptsI、ptsH和ptsM基因编码的那些酶)的活性，或者通过增强优选地由glk基因编码的葡糖激酶(EC 2.7.1.2)。在这种情况下，特别地可参阅US 6,680,187、US 6,818,432、US 6,913,910和US 6,884,614，其关于用于过表达ptsI、ptsH、ptsM和glk基因的可能性的公开内容在此引入作为参考，并且构成本发明公开内容的一部分。在碳水化合物作为碳源的情况下，也可以是有利的是，有针对性地促进戊糖磷酸途径，例如通过提高葡糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(EC1.1.1.44)(其优选地由gnd基因编码)的活性，并且任选地同时抑制糖酵解，例如通过减弱葡糖-6-磷酸异构酶的活性，如在WO-A-01/07626中所描述的那样。
如果依照根据本发明的方法的一个特别的布置方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中形成作为初产物的甲基丙二酸半醛和作为中间产物的琥珀酰辅酶A)，细胞经由作为中间产物的草酰乙酸和丙酮酸而形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸，那么可以是进一步优选的是，降低所述细胞中至少一种(优选地所有)下述酶活性的活性 -催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸的酶，例如磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(EC 4.1.1.49)(还可参见DE-A-199 50 409)， -催化丙酮酸转化为乙酸的酶，例如丙酮酸氧化酶(EC 1.2.2.2)(还可参见DE-A-199 51 975)， -催化α-D-葡糖-6-磷酸转化为β-D-果糖-6-磷酸的酶(还可参见US 09/396,478)， -催化丙酮酸转化为乳酸的酶，例如1-乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)或乳酸-苹果酸转氢酶(EC 1.1.99.7)， -催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A的酶，例如丙酮酸脱氢酶(EC1.2.1.51)， -催化丙酮酸转化为乙酰磷酸的酶，例如丙酮酸氧化酶(EC1.2.3.3)， -催化丙酮酸转化为乙酸的酶，例如丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.2.2)， -催化丙酮酸转化为磷酸烯醇丙酮酸的酶，例如磷酸烯醇丙酮酸合酶(EC 2.7.9.2)或丙酮酸磷酸二激酶(EC 2.7.9.1)， -催化丙酮酸转化为丙氨酸的酶，例如丙氨酸转氨酶(2.6.1.2)或丙氨酸-酮酸转氨酶(EC 2.6.1.12)，和/或 -催化丙酮酸转化为乙酰乳酸的酶，例如乙酰羟酸合酶(EC2.2.1.6)。
根据本发明特别优选的细胞(所述细胞能够经由作为中间产物的琥珀酰辅酶A从作为碳源的碳水化合物形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸，并且在所述细胞中可以提高一种或多种上文所提及的酶活性，特别是酶活性E1至E45之一，更优选地酶活性E1、E1E2E3E4、E1E4E5E6E7或/和E1E4E5E7)是由Bennett等人，Metab.Eng.(2005)，7(3)，第229至239页；Bennett等人，Biotechnol.Bioeng.(2005)，90(6)，第775至779页；Bennett等人，Biotechnol.Prog.(2005)，21(2)，第358至365页；Bennett等人，(2005)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，67(4)，第515至523页；Vemuri等人，(2002)，Applied and Ebvironmental Microbiology 68(4)，第1715至1727页以及在US 6,455,284中所描述的那些微生物。
如果依照根据本发明的方法的第一个特别的实施方案，经由作为中间产物的琥珀酰辅酶A从作为碳源的L-谷氨酸形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸，那么依照根据本发明的方法的进一步的特别的实施方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中形成作为初产物的甲基丙二酸半醛和作为中间产物的琥珀酰辅酶A)，根据本发明进一步优选的是，所使用的细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E28和E46中至少一种酶(优选地这两者)的活性(见图10) -酶E46，其催化L-谷氨酸转化为2-酮戊二酸； -酶E28，其催化2-酮戊二酸转化为琥珀酰辅酶A。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E46为谷氨酸合酶(EC 1.4.1.13或EC 1.4.1.14)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)或天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1或EC 2.6.1.2)，和 酶E28为2-酮戊二酸合酶(EC 1.2.7.3)。
作为酶E28，优选的是已经在开头作为优选的酶E28而提及的那些。
优选地，酶E46由选自下列的基因编码myn8.、glt1、adr290wp、gltB、gltD、yeiT、aegA、ygfT、gltD-1、gltD-2、glt1、glt2、gls1、gltA、glt、glxD、gltA、yerD、cgl0184、cgl0185、sc3c9.12、gdh1、gdh2、agl40cp、gdhA、gdhA1、gdhA2、gluD、rocG、ypcA、gudB、gluD、gdhA、gdhA2、gdh、gdhA-1、gdhA2-2、gdhA-3、gluD1、gluD2、glud1-prov、glud1a、t11I18.2、t2I1.150、mrg7.13、got1、got2、caspat、got2-prov、xr406-prov、406-prov、cg4233、cg4233、cg8430、cg8430、f23n19.17、f13j11.16、t26c19.9、f7f1.18、f10n7.200、t1611.170、f15n18.110、t20d1.70、aat、aat1、aat2、abl038wp、afr211cp、agx1、bnA4、aatA、aatB、ybdL、aspC、yfbQ、ydcR、avtA2、aspC-1、aspC-2、aspC-3、aspC-4、aspB、aspB-1、aspB-2、aspB-3、aspB-4、argD1、argD2、aatAc、ywfG、mtnV、alaT、avtA1、avtA2、avtA3、cgl0240、cgl1103、cgl2599、cgl2844、dapC、2sck36.07c、sc9e12.21、sc2h4.04c、aspB1、aspB2、aspB3、tyrB、gpt、gpt1、gpt2、mgc82097、cgl640、c32f10.8、f20d23.34、f26f24.16、f24j13.15、t10d10.20和agrwp。
这些基因的核苷酸序列依旧同样可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
依照根据本发明的方法的第二个特别的实施方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为初产物的甲基丙二酸半醛来实现)，优选的是，3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为中间产物的丙酰辅酶A来实现，其中所使用的细胞优选地能够利用碳水化合物、甘油、甲烷或甲醇作为碳源。在此，存在有各种不同的途径来从丙酰辅酶A达到3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸。
依照根据本发明的方法的第二个特别的实施方案的第一个备选方案，中间产物丙酰辅酶A的形成经由作为进一步的中间产物的乙酰辅酶A来实现。在这种情况下，特别优选的是，所使用的经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4、E5和E47至E52中至少一种酶的活性(见图11和12) -酶E47，其催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A； -酶E48，其催化丙二酰辅酶A转化为丙二酸半醛； -酶E49，其催化丙二酸半醛转化为3-羟基丙酸； -酶E50，其催化3-羟基丙酸转化为3-羟基丙酰辅酶A； -酶E51，其催化3-羟基丙酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A； -酶E52，其催化丙烯酰辅酶A转化为丙酰辅酶A； -酶E5，其催化丙酰辅酶A转化为甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
根据本发明特别优选的是，使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E47、E48、E49、E50、E51、E52、E4、E5和E47E48E49E50E51E52E4E5。
此外，在这种情况下，特别优选的是， 酶E4为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)， 酶E5为甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.27)， 酶E47为丙二酰辅酶A脱羧酶(EC 4.1.1.9)、丙二酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.3)、甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶(EC 2.1.3.1)或乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)， 酶E48为丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.18)， 酶E49为3-羟基丙酸脱氢酶(EC 1.1.1.59)， 酶E50为3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.4)， 酶E51为烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)，和 酶E52为酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.3)。
酶E4和E5的优选的基因为已经在上文中在根据本发明的细胞的第一个特别的实施方案方面作了描述的那些。
优选地，酶E47由选自下列的基因编码mlycd、t19b17.4、tb08.2904.110、matA、acac、acaca、acacb、f5j5.21、f15c21.2、t8p21.5、acc1、aar071wp、accA、accB、accC、accD、accC1、accC2、mmdA、fabG、accD1、accD2、accD3、cgl0831、accBC、dtsR1、accDA、scc24.16c和cgl1327，其中accA、accC和accD是最优选的。
优选地，酶E48由iolD基因编码。
优选地，酶E51由选自下列的基因编码echS1、ehhadh、hadha、echs1-prov、cg4389、cg4389、cg6543、cg6984、cg8778、ech-1、ech-2、ech-3、ech-4、ech-5、ech-6、ech-7、FCAALL.314、fcaall.21、fox2、eci1、eci2、paaF、paaG、yfcX、fadB、faoA、rpfF、phaA、phaB、echA1、echA2、echA3、echA4、echA5、echA6、echA7、echA8、echA9、echA9、echA10、echA11、echA12、echA13、echA14、echA15、echA16、echA17、echA18、echA19、echA20、echA21、fad-1、fad-2、fad-3、dcaE、hcaA、fadJ、rsp0671、rsp0035、rsp0648、rsp0647、rs03234、rs03271、rs04421、rs04419、rs02820、rs02946、paaG1、paaG2、paaG3、ech、pksH、ydbS、eccH1、eccH2、pimF、fabJ1、fabJ2、caiD2、ysiB、yngF、yusL、fucA、cg10919、scf41.23、scd10.16、sck13.22、scp8.07c、stbac16h6.14、sc5f2a.15、sc6a5.38、hbd-1、hbd-2、hdb-3、hdb-4、hdb-5、hdb-6、hdb-7、hdb-8、hdb-9、hdb-10、fad-1、fad-2、fad-3、fad-4、fad-5、paaF-1、paaF-2、paaF-3、paaF-4、paaF-5、paaF-6、paaF-7和crt。
优选地，酶E52由选自下列的基因编码acadl、acadm、acad10、acad11、acadm-prov、acadl-prov、mgc81873、cg12262、cg4703、cg4860、f3e22.5、afl213wp、acdC、fadE13、acd-1、acd-2、acd-3、acd-4、acd-5、acd-6、acd-7、acd-8、acd-9、acd-10、acd-11、acd-12、acd、fadE1、fadE2、fadE3、fadE4、fadE5、fadE6、fadE7、fadE13、fadE14、fadE15、fadE16、fadE17、fadE18、fadE19、fadE20、fadE21、fadE22、fadE23、fadE26、fadE27、fadE30、fadE31、fadE33、fadE35、fadE38、fadE45、fadE、caiA、aidB、RSp0036、RS03588、mmgC、acdA-3、bcd、acdA、acdH1、acdH2、acdH3、aidB、acdI和acdH。
酶E47至E52，特别是酶E49和E50的合适的基因的核苷酸序列可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
依照根据本发明的方法的该第二个特别的实施方案的第二个备选方案，中间产物丙酰辅酶A的形成同样也是经由乙酰辅酶A(作为进一步的中间产物)来实现，其中依照该备选方案，丙酰辅酶A不是直接地，而是经由甲基丙二酰辅酶A来转化为甲基丙二酸半醛。在这种情况下，特别优选的是，所使用的经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4、E6、E7和E47至E52中至少一种酶的活性(见图13和14) -酶E47，其催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A； -酶E48，其催化丙二酰辅酶A转化为丙二酸半醛； -酶E49，其催化丙二酸半醛转化为3-羟基丙酸； -酶E50，其催化3-羟基丙酸转化为3-羟基丙酰辅酶A； -酶E51，其催化3-羟基丙酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A； -酶E52，其催化丙烯酰辅酶A转化为丙酰辅酶A； -酶E7，其催化丙酰辅酶A转化为(S)-甲基丙二酰辅酶A； -酶E6，其催化(S)-甲基丙二酰辅酶A转化为(R)-甲基丙二酰辅酶A； -酶E2，其催化(R)-甲基丙二酰辅酶A转化为甲基丙二酸； -酶E3，其催化甲基丙二酸转化为甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
根据本发明特别优选的是，使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E2、E3、E4、E6、E7、E47、E48、E49、E50、E51、E52和E2E3E4E6E7E47E48E49E50E51E52。
这些酶的优选的酶和基因为已经在上文中在酶E2至E4、E6、E7和E47至E52方面被提及的那些基因和酶。
依照根据本发明的方法的第二个特别的实施方案的该第一个备选方案的第三个备选方案，中间产物丙酰辅酶A的形成同样也是经由乙酰辅酶A(作为进一步的中间产物)来实现，其中依照该备选方案，丙酰辅酶A同样也不是直接地，而是经由(R)-甲基丙二酰辅酶A(和不经由(S)-甲基丙二酰辅酶A)来转化为甲基丙二酸半醛。在这种情况下，特别优选的是，所使用的经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4、E7和E47至E52中至少一种酶的活性(见图15和16) -酶E47，其催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A； -酶E48，其催化丙二酰辅酶A转化为丙二酸半醛； -酶E49，其催化丙二酸半醛转化为3-羟基丙酸； -酶E50，其催化3-羟基丙酸转化为3-羟基丙酰辅酶A； -酶E51，其催化3-羟基丙酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A； -酶E52，其催化丙烯酰辅酶A转化为丙酰辅酶A； -酶E7，其催化丙酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A； -酶E2，其催化甲基丙二酰辅酶A转化为甲基丙二酸； -酶E3，其催化甲基丙二酸转化为甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
根据本发明特别优选的是，使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E2、E3、E4、E7、E47、E48、E49、E50、E51、E52和E2E3E4E7E47E48E49E50E51E52。
这些酶的优选的酶和基因依旧同样为已经在上文中在酶E2至E4、E7和E47至E52方面被提及的那些基因和酶。
依照根据本发明的方法的第二个特别的实施方案的第四个备选方案，中间产物丙酰辅酶A的形成同样也是经由乙酰辅酶A(作为进一步的中间产物)来实现，其中根据该备选方案，形成作为中间产物的乙酰乙酰辅酶A。在这种情况下，可以是优选的是，所使用的经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E8和E53至E61中至少一种酶的活性 -酶E53，其催化两个乙酰辅酶A单元转化为乙酰乙酰辅酶A； -酶E54，其催化乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基丁酰辅酶A； -酶E55，其催化3-羟基丁酰辅酶A转化为巴豆酰辅酶A； -酶E56，其催化巴豆酰辅酶A转化为丁酰辅酶A； -酶E57，其催化丁酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A； -酶E58，其催化乙基丙二酰辅酶A转化为甲基琥珀酰辅酶A； -酶E59，其催化甲基琥珀酰辅酶A转化为异丁酰辅酶A； -酶E60，其催化异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A； -酶E61，其催化甲基丙烯酰辅酶A转化为3-羟基异丁酰辅酶A； -酶E8，其催化3-羟基异丁酰辅酶A转化为3-羟基异丁酸。
在此，根据本发明特别优选的经基因工程改造的细胞是这样的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E8、E53、E54、E55、E56、E57、E58、E59、E60、E61和E8E53E54E55E56E57E58E59E60E61。
该代谢途径以及参与该代谢途径的酶例如描述于Korotkova等人，Journal of Bacteriology(2002)，第1750-1758页中。
依照根据本发明的方法的第二个特别的实施方案的第五个备选方案，中间产物丙酰辅酶A的形成依旧同样经由乙酰辅酶A(作为进一步的中间产物)来实现，其中根据该改变形式，同样形成作为中间产物的乙酰乙酰辅酶A，然而其中在该情况下，从巴豆酰辅酶A直接形成乙基丙二酰辅酶A。在这种情况下，可以是优选的是，所述细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E8、E53至E55、E58和E62至E65中至少一种酶的活性(见图17) -酶E53，其催化两个乙酰辅酶A单元转化为乙酰乙酰辅酶A； -酶E54，其催化乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基丁酰辅酶A； -酶E55，其催化3-羟基丁酰辅酶A转化为巴豆酰辅酶A； -酶E62，其催化巴豆酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A； -酶E58，其催化乙基丙二酰辅酶A转化为甲基琥珀酰辅酶A； -酶E63，其催化甲基琥珀酰辅酶A转化为中康酰辅酶A； -酶E64，其催化中康酰辅酶A转化为β-甲基苹果酰辅酶A； -酶E65，其催化β-甲基苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和丙酰辅酶A。
然后，可以以上文所描述的方法类型和方式(提高酶E7、E2、E3和E4中一种或多种酶的活性，提高酶E7、E6、E2、E3和E4中一种或多种酶的活性，或者提高酶E4和E5中一种酶或两者的活性)，从丙酰辅酶A形成3-羟基异丁酸。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E53为β-酮硫解酶(EC 2.3.1.9)， 酶E54为乙酰乙酰辅酶A还原酶(EC 1.1.1.36)， 酶E55为烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)， 酶E62为巴豆酰辅酶A脱羧酶， 酶E58为乙基丙二酰辅酶A变位酶(EC 5.4.99.2)， 酶E63为甲基琥珀酰辅酶A脱氢酶， 酶E64为中康酰辅酶A水合酶，和 酶E65为β-甲基苹果酰/L-苹果酰辅酶A裂合酶。
优选地，酶E53由选自下列的基因编码acat1、acat2、loc484063、loc489421、mgc69098、mgc81403、mgc81256、mgc83664、kat-1、erg10、ygeF、atoB、fadAx、phbA-1、phbA-2、atoB-2、pcaF、pcaF-2、phb-A、bktB、phaA、tioL、thlA、fadA、paaJ、phbAf、pimB、mmgA、yhfS、thl、vraB、th1、mvaC、thiL、paaJ、fadA3、fadA4、fadA5、fadA6、cgl12392、catF、sc8f4.03、thiL1、thiL2、acaB1、acaB2、acaB3或acaB4，其中acat1、acat2、atoB和phbA以及来自类球红细菌的相应基因是特别优选的。
优选地，酶E54由选自下列的基因编码phbB、fabG、phbN1、phbB2或cgl12444，其中phbB以及来自类球红细菌的相应基因是特别优选的。
优选地，酶E55由选自下列的基因编码echS1、ehhadh、hadha、echs1-prov、cg4389、cg4389、cg6543、cg6984、cg8778、ech-1、ech-2、ech-3、ech-4、ech-5、ech-6、ech-7、FCAALL.314、fcaall.21、fox2、eci1、eci2、paaF、paaG、yfcX、fadB、faoA、rpfF、phaA、phaB、echA1、echA2、echA 3、echA4、echA5、echA6、echA7、echA8、echA9、echA9、echA10、echA11、echA12、echA13、echA14、echA15、echA16、echA17、echA18、echA19、echA20、echA21、fad-1、fad-2、fad-3、dcaE、hcaA、fadJ、rsp 0671、rsp0035、rsp0648、rsp0641rs03234、rs03271、rs04421、rs04419、rs02820、rs02946、paaG1、paaG2、paaG3、ech、pksH、ydbS、eccH1、eccH2、pimF、fabJ1、fabJ2、caiD2、ysiB、yngF、yusL、fucA、cg10919、scf41.23、scd10.16、sck13.22、scp8.07c、stbac16h6.14、sc5f2a.15、sc6a5.38、hbd-1、hbd-2、hdb-3、hdb-4、hdb-5、hdb-6、hdb-7、hdb-8、hdb-9、hdb-10、fad-1、fad-2、fad-3、fad-4、fad-5、paaF-1、paaF-2、paaF-3、paaF-4、paaF-5、paaF-6、paaF-7和crt，其中来自类球红细菌的相应基因是特别优选的。
酶E58的合适的基因选自mut、mutA、mutB、sbm、sbmA、sbmB、sbm5、bhbA、mcmA、mcmA1、mcmA2、mcmB、mcm1、mcm2、mcm3、icmA、meaA1和meaA2，其中来自类球红细菌的相应基因在此也是特别优选的。
作为酶E62，优选地使用来自类球红细菌的酶，其由具有SEQ ID NO05的DNA序列编码并且具有根据SEQ ID NO06的氨基酸序列。
酶E63、E64和E65的优选的基因特别地为来自类球红细菌的这些酶的基因。
上文所提及的基因的核苷酸序列的其他例子尤其还可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
如在上文中已经说明的，在根据本发明的方法的第二个优选实施方案的第一个备选方案的情况下，经由丙酰辅酶A和乙酰辅酶A(作为中间产物)产生3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸。在此，原则上可能合适的是，除了影响上文所提及的酶活性E2至E8和E47至E65中的一种或多种酶活性外，还影响这样的酶活性，该酶活性导致细胞中乙酰辅酶A的形成的提高。
当从碳水化合物或从甘油(作为碳源)来形成3-羟基异丁酸时，可以是优选的是，所述细胞具有增加的酶E66的活性，所述酶E66催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A。优选地，该酶E66为丙酮酸脱氢酶(EC1.2.1.51)。
当从C1-碳源例如甲烷或甲醇来形成3-羟基异丁酸时，可以是优选的是，所述细胞具有相比于其野生型而言增加的酶E67至E71中至少一种酶的活性 -酶E67，其催化甲烷转化为甲醇； -酶E68，其催化甲醇转化为甲醛； -酶E69，其催化甲醛转化为5，10-亚甲基四氢叶酸； -酶E70，其催化5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸； -酶E71，其催化5-甲基四氢叶酸转化为乙酰辅酶A。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E67为甲烷单加氧酶(EC 1.14.13.25)， 酶E68为甲醇脱氢酶(EC 1.1.1.244)， 酶E69为甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.27)， 酶E70为亚甲基四氢叶酸还原酶(EC 1.5.1.20)， 酶E71为一氧化碳脱氢酶(EC 1.2.99.2)。
酶E63至E67的合适的基因的核苷酸序列可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
依照根据本发明的方法的第三个特别的实施方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为初产物的甲基丙二酸半醛来实现)，优选的是，3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为中间产物的丙烯酰辅酶A来实现，其中所使用的细胞优选地能够利用碳水化合物、甘油或谷氨酸作为碳源。
在根据本发明的方法的第三个特别的实施方案方面，当所使用的经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4、E62、E72和E73中至少一种酶的活性(见图18)时，是特别优选的 -酶E72，其催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶A； -酶E73，其催化β-丙氨酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A； -酶E62，其催化丙烯酸辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A(或者巴豆酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A)； -酶E2，其催化甲基丙二酰辅酶A转化为甲基丙二酸； -酶E3，其催化甲基丙二酸转化为甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
在此，根据本发明特别优选的细胞为这样的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E62E2、E62E3、E62E4、E62E2E3和E72E73E62E2E3E4。在根据本发明的方法的第四个特别的实施方案方面，也可以是有利的是，使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中过表达能够催化至少两个上文所描述的反应步骤的酶。因此，在此，还可以使用例如不仅具有酶E2的活性而且具有酶E3的活性的酶，例如来自Sulfolobus tokodaii的丙二酰辅酶A还原酶，其由具有SEQ ID NO03的DNA序列编码并且具有根据SEQ ID NO04的氨基酸序列。此外，在根据本发明的细胞的第四个特别的实施方案方面，原则上还可能使用这样的细胞，其已经能够形成特别大量的丙烯酰辅酶A。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E72为辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)或辅酶A合成酶，优选地辅酶A转移酶， 酶E73为β-丙氨酰辅酶A铵裂合酶(EC 4.3.1.6)， 酶E62为巴豆酰辅酶A脱羧酶， 酶E2为甲基丙二酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.17)， 酶E3为醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)或醛氧化酶(EC 1.2.3.1)，和 酶E4为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
优选的具有辅酶A转移酶活性的酶E72为来自埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和还有大肠杆菌的那些。作为编码辅酶A转移酶的DNA序列的例子，在这点上可以提及在WO-A-03/062173中称为SEQ ID NO24的来自埃氏巨球形菌的序列。其他优选的酶为在WO-A-03/062173中所描述的辅酶A转移酶的那些变体。
合适的具有β-丙氨酰辅酶A铵裂合酶活性的酶E73例如为来自丙酸梭菌的那些。编码此类酶的DNA序列可以例如从丙酸梭菌中获得，如在WO-A-03/062173的实施例10中所描述的。编码来自丙酸梭菌的β-丙氨酰辅酶A铵裂合酶的DNA序列在WO-A-03/062173中被指定为SEQ ID NO22。
作为酶E62，依旧同样优选地使用来自类球红细菌的巴豆酰辅酶A脱羧酶，其由具有SEQ ID NO05的DNA序列编码并且具有根据SEQ IDNO06的氨基酸序列。该酶不仅能够将巴豆酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A，而且还能够将丙烯酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A。
酶E2至E4的合适的基因已经在根据本发明的方法的第一种变化形式方面提及，其中在第二种变化形式方面，也优选的是，作为酶E3的基因，上文所描述的来自Sulfolobus tokodaii的基因是特别优选的。
依照根据本发明的方法的第三个特别的实施方案的特别优选的变化形式，使用经基因工程改造的细胞，所述细胞相比于其野生型而言至少具有增加的酶E2和E62或者酶E2、E3和E62的活性，其中酶E2或者酶E2和E3由根据SEQ ID NO03的DNA序列编码和酶E62由根据SEQ IDNO05的DNA序列编码。在这种情况下，当增加的这两种酶的活性通过在细胞中过表达具有SEQ ID NO04和SEQ ID NO06的多肽或者分别与根据SEQ ID NO04和SEQ ID NO06的氨基酸序列具有至少50％，优选地至少55％，更优选地至少60％，更加优选地至少65％和最优选地至少70％同一性的氨基酸序列来获得时，则是优选的。在此，这两种DNA序列可以整合入细胞的基因组中，或者存在于在细胞内的载体上。
在上文所描述的根据本发明的方法的第三个特别的实施方案方面，当出现下述情况时，可以是进一步有利的，即除了酶E62的活性和/或酶E2或酶E2和E3的活性的提高外，所使用的经基因工程改造的细胞还具有下列特性中的至少一种特性(优选地两者) -相比于其野生型而言增加的催化丙酮酸转化为草酰乙酸的酶E11或催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的酶E74的活性，然而优选的是增加的催化丙酮酸转化为草酰乙酸的酶E11的活性，以及 -增加的催化天冬氨酸转化为β-丙氨酸的酶E75的活性。
优选地，酶E11为羧化酶，特别优选地为催化丙酮酸转化为草酰乙酸的丙酮酸羧化酶(EC编号6.4.1.1)。在这种情况下特别优选的丙酮酸羧化酶为在″A novel methodology employing Corynebacteriumglutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant.″Ohnishi J等人，Applied Microbiology andBiotechnology，Vol.58(2)，第217-223页(2002)中所描述的那些突变体。在该突变中，第458位处的氨基酸脯氨酸被置换为丝氨酸。该出版物关于用于制备丙酮酸羧化酶突变体的可能性的公开内容在此引入作为参考，并且构成本发明公开内容的一部分。
酶E75优选地为脱羧酶，特别优选地为谷氨酸脱羧酶或天冬氨酸脱羧酶，其中1-天冬氨酸-1-脱羧酶(EC编号4.1.1.11)是最优选的，其由panD基因编码。天冬氨酸脱羧酶催化天冬氨酸转化为β-丙氨酸。尤其已经从大肠杆菌中(FEMS Microbiology Letters，143，第247-252页(1996)，″Photorhabdus luminescens subsp.Laumondii，Mycobacterium bovis subsp.Bovis″)以及从众多的其他微生物中克隆了天冬氨酸脱羧酶的基因(panD基因)，并进行了测序。特别地，在DE-A-198 55 313中描述了来自谷氨酸棒杆菌的panD基因的核苷酸序列。原则上，可以使用具有任何想得到的来源的panD基因，不论来自细菌、来自酵母还是来自真菌都是无关紧要的。此外，还可以使用panD基因的所有等位基因，特别是还有由于遗传密码的简并性或通过功能中性有义突变而产生的那些。除了来自谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸脱羧酶外，根据本发明特别优选的天冬氨酸脱羧酶还为大肠杆菌-突变体DV9(Vallari和Rock，Journal of Bacteriology，164，第136-142页(1985))。该出版物关于上述突变体的公开内容在此引入作为参考，并且构成本发明公开内容的一部分。在DE-A-10 2005 048 818中描述了重组细胞的制备，在所述细胞中不仅丙酮酸羧化酶的活性而且天冬氨酸脱羧酶的活性是提高的。
依照根据本发明的方法的第二种变化形式，3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为初产物的3-羟基异丁酰辅酶A来实现。
当在根据本发明的方法中使用这样的细胞(即在所述细胞中3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成根据第二种变化形式经由作为初产物的3-羟基异丁酰辅酶A来实现)时，依照第一个特别的实施方案，优选的是，3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为中间产物的异丁酰辅酶A来实现，其中所述细胞优选地能够利用碳水化合物、甘油或L-缬氨酸作为碳源。
如果碳水化合物或甘油充当碳源，那么依照根据本发明的方法的第二种变化形式的该第一个特别的实施方案的第一个备选方案，优选的是，使用经基因工程改造的细胞，所述细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E76至E79、E60、E61和E8中至少一种酶的活性(见图19) -酶E76，其催化丙酮酸转化为2-乙酰乳酸； -酶E77，其催化2-乙酰乳酸转化为2，3-二羟基异戊酸； -酶E78，其催化2，3-二羟基异戊酸转化为2-氧代异戊酸； -酶E79，其催化2-氧代异戊酸转化为异丁酰辅酶A； -酶E60，其催化异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A； -酶E61，其催化甲基丙烯酰辅酶A转化为3-羟基异丁酰辅酶A； -酶E8，其催化3-羟基异丁酰辅酶A转化为3-羟基异丁酸。
根据本发明特别优选的是，使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E8、E60、E61、E76、E77、E78、E79和E8E60E61E76E77E78E79。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E8为3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.4)， 酶E76为乙酰乳酸合酶(EC 2.2.1.6)， 酶E77为二羟基异戊酸脱氢酶(EC 1.1.1.86)， 酶E78为2，3-二羟基异戊酸脱水酶(EC 4.2.1.9)， 酶E79为2-氧代异戊酸脱氢酶(EC 1.2.1.25或EC 1.2.4.4)， 酶E60为酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.3)、丁酰辅酶A脱氢酶(EC1.3.99.2)或2-甲基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.12)，和 酶E61为烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。
优选的酶E8、E60和E61为已经在上文中描述了的那些。
优选地，酶E76由选自下列的基因编码ilvb1、t8p19.70、ilv1、ilv2、ilv6、aal021wp、ael305cp、ilvI、ilvH、ilvN、ilvB、ilvM、ilvG、ilvN、budB、ilvN-1、ilvN-2、atrC、ilvX、iolD、budB、alsS、ilvK、ilvB1、ilvB2、ilvB3、ilvN1、ilvN2、cgl1271、cgl1272、iolD和scc57A.40c。
优选地，酶E77由选自下列的基因编码f14p22.200、ilv5、acl198Wp、ilvC、ilvY、ilvC-1、ilvC-2、ilvC-3和cgl1273，其中ilvC基因是最优选的。
优选地，酶E78由选自下列的基因编码f14o13.18、ilv3、acl117wp、ilvD、cgl1268、ilvD1和ilvD2，其中ilvD是最优选的。
如果L-缬氨酸充当碳源，那么依照根据本发明的方法的第二个备选方案的第一个特别的实施方案的第二个改变形式(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为初产物的3-羟基异丁酰辅酶A和作为中间产物的异丁酰辅酶A来实现)，优选的是，这些所使用的细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E79、E80、E60、E61和E8中至少一种酶的活性(见图20) -酶E80，其催化L-缬氨酸转化为2-氧代异戊酸； -酶E79，其催化2-氧代异戊酸转化为异丁酰辅酶A； -酶E60，其催化异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A； -酶E61，其催化甲基丙烯酰辅酶A转化为3-羟基异丁酰辅酶A； -酶E8，其催化3-羟基异丁酰辅酶A转化为3-羟基异丁酸。
根据本发明特别优选的是，使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中下列酶或酶组合的活性是增加的E8、E60、E61、E79、E80和E8E60E61E79E80。
在这种情况下，特别优选的是， 酶E8为3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.4)， 酶E60为酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.3)、丁酰辅酶A脱氢酶(EC1.3.99.2)或2-甲基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.12)， 酶E61为烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)， 酶E79为2-氧代异戊酸脱氢酶(EC 1.2.1.25或EC 1.2.4.4)，和 酶E80为氨基酸转移酶(EC 2.6.1.42)。
优选的酶E8、E60、E61和E79为已经在上文中描述了的那些。
优选地，酶E80由选自下列的基因编码bcat1、bcat2、t27I1.8、t27i1.9、f2j10.5、f2j10.4、t12h1.16、mmb12.20、t9c5.3、mpa24.13、bat1、bat2、adl384wp、eca39、bcaA、ilvE、ilvE1、ilvE2、ilvE3、ywaA、ybgE、bcaT和cgl2204，其中ilvE是特别优选的。
酶E80的合适的基因的核苷酸序列依旧同样可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
在根据本发明的方法的第二种变化形式的第一个特别的实施方案的该第二个备选方案方面，可以是进一步有利的是，使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸的酶E4的活性是降低的，其中该酶E4优选地为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
此外，依照根据本发明的方法的第二种变化形式的第一个特别的实施方案的第二个改变形式(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中经由作为初产物的3-羟基异丁酰辅酶A和作为中间产物的异丁酰辅酶A而从作为碳源的L-缬氨酸开始来形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸)，优选的是，使用这样的细胞，其已经能形成大量的L-缬氨酸。在此，特别地考虑由Blombach等人在Applied Environmental Microbiology，Vol.73(7)(2007)，第2079-2084页中描述的那些细胞。
依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案，进一步优选的是，所使用的经基因工程改造的细胞具有相对于其野生型而言增加的glbO基因的表达。此外，可能可以是优选的是，所使用的经基因工程改造的细胞具有相比于其野生型而言降低的柠檬酸转运蛋白的活性，所述柠檬酸转运蛋白由dctA基因或citP基因编码。
优选地，在根据本发明的方法中所使用的经基因工程改造的细胞可通过这样的方法来获得，所述方法包括提高所述细胞中上文所描述的酶中至少一种酶(优选地一种或多种下列酶)的活性的步骤 -E1至E4， -E1、E4、E5、E6和E7， -E1、E4、E5和E7， -E4、E5和E47至E52， -E2至E4、E6、E7和E47至E52， -E2至E4、E7和E47至E52， -E8和E53至E61， -E8、E53至E55、E58和E62至E64， -E2至E3、E62、E72和E73， -E8、E60、E61和E76至E79，或 -E8、E60、E61、E79和E80， 其中，所述酶活性的提高优选地通过开头所描述的方法来实现。
在根据本发明的方法的步骤IA)中，可以以分批方法(分批培养)或补料分批方法(给料方法)或重复补料分批方法(重复给料方法)，使经基因工程改造的细胞连续地或不连续地与培养基相接触并因此进行培养，以便产生3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸。还可以考虑半连续的方法，如在GB-A-1009370中所描述的。关于已知的培养方法的概括描述在Chmiel的教科书(″Bioprozesstechnik1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik″(Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科书(″Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen″，Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994)中。
待使用的培养基必须以合适的方式满足各菌株的要求。关于各种微生物的培养基的描述包含在American Society for Bacteriology的手册″Manual of Methods for General Bacteriology″(WashingtonD.C.，USA，1981)中。
作为碳源，可以使用碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类例如甘油和甲醇，烃类例如甲烷，氨基酸例如L-谷氨酸或L-缬氨酸，或者有机酸例如乙酸。这些物质可以单独地或者作为混合物来进行使用。特别优选的是使用碳水化合物，特别是单糖、寡糖或多糖(如在US 6,01,494和US 6,136,576中所描述的)，使用C5-糖，或者使用甘油。
作为氮源，可以使用有机含氮化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素，或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独地或者作为混合物来进行使用。
作为磷源，可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠盐。此外，培养基还必须包含金属盐例如硫酸镁或硫酸铁，它们是生长所必需的。最后，除了上面所述的物质外，还可以使用必需的生长物质例如氨基酸和维生素。另外，可以向培养基中添加合适的前体。所述材料可以以单次添加的形式补充给培养物或者在培养期间以合适的方式供料给培养物。
关于培养物的pH控制，可以以合适的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或者酸性化合物例如磷酸或硫酸。为了控制泡沫形成，可以使用防沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中添加合适的具有选择作用的物质例如抗生素。为了维持有氧条件，向培养物中输入氧或含氧气体混合物例如空气。培养温度通常为20℃至45℃，和优选地25℃至40℃。特别地，在使用能转化作为底物的甘油的细胞的情况下，可以是优选的是，使用在US 6,803,218中所描述的此类细胞作为细胞。在该情况下，所述细胞可以在40至100℃的温度下进行培养。
优选地，连续地从营养液中纯化出3-羟基异丁酸，其中，在这方面进一步优选的是，也连续地进行通过发酵来制备3-羟基异丁酸，从而由3-羟基异丁酸的制备到从发酵液中纯化出3-羟基异丁酸的整个过程可以连续地进行。为了从发酵液中连续地纯化出3-羟基异丁酸的制备，将发酵液连续地引导通过用于分离在发酵中所使用的微生物的装置，优选地通过具有20至200kDa的排阻大小的过滤器，在其中发生固/液分离。还可以设想使用离心机、合适的沉降装置或这些装置的组合，其中特别优选的是，首先通过沉降来分离出至少一部分微生物，随后将从中部分地去除了微生物的发酵液输送至超滤或离心装置。
在分离出微生物之后，将在其3-羟基异丁酸比例方面经富集的发酵产品输送至优选地多步骤的分离设备。在该分离设备中，设置有多个相继衔接的分离阶段，从这些分离阶段中各自汇出被引回至发酵罐的回输管路。此外，从各个分离阶段中引出排出管路。单个分离阶段可以根据电渗析、反渗透、超滤或纳米过滤的原理进行工作。通常，在单个分离阶段中涉及膜分离设备。基于发酵副产物和底物残留物的类型和规模来选择单个分离阶段。
除了借助于电渗析、反渗透、超滤或纳米过滤(在其过程中作为终产物获得了3-羟基异丁酸水溶液)来分离3-羟基异丁酸外，还可以通过萃取方法由从中去除了微生物的发酵液中分离出3-羟基异丁酸，其中在该情况下最终可以获得纯的3-羟基异丁酸。为了通过萃取来分离3-羟基异丁酸，可以向发酵液中添加例如铵化合物或胺，以形成3-羟基异丁酸的铵盐。然后，可以通过下列方式从发酵液中分离出该铵盐添加有机萃取剂，并随后加热如此获得的混合物，由此铵盐富集在有机相中。然后，例如通过进一步的萃取步骤可以从该相中分离出3-羟基异丁酸，从而获得纯的3-羟基异丁酸。关于该分离方法的更精确的细节可从WO-A-02/090312获取，该专利关于从发酵液中分离出羟基羧酸的公开内容在此引入作为参考，并且构成本申请公开内容的一部分。
根据从发酵液中分离3-羟基异丁酸的方法类型和方式，获得包含2至90重量％，优选地7.5至50重量％和特别优选地10至25重量％的3-羟基异丁酸的3-羟基异丁酸水溶液，或者获得纯的3-羟基异丁酸。
此外，可以在纯化之前、纯化过程中或纯化之后中和在根据本发明的方法的步骤IA)中制备的3-羟基异丁酸，其中为此可以使用碱例如氢氧化钙或氢氧化钠。
在根据本发明的方法的步骤IB)中，使3-羟基异丁酸脱水从而形成甲基丙烯酸，其中为此可以使用从发酵液中分离出的纯的3-羟基异丁酸，或者使用在处理发酵液时分离出的3-羟基异丁酸水溶液，其中任选地，该3-羟基异丁酸水溶液还在脱水之前，任选地在合适的共沸剂存在下，例如通过蒸馏进行浓缩。
原则上，脱水可以在液相或气相中进行。此外，根据本发明优选的是，脱水在催化剂存在下进行，其中所使用的催化剂的类型取决于施行气相反应还是液相反应。
作为脱水催化剂，不仅可以考虑酸性催化剂，而且还可以考虑碱性催化剂。特别地，由于低的寡聚物形成倾向，酸性催化剂因而是优选的。脱水催化剂不仅可以作为均相催化剂而且可以作为多相催化剂进行使用。当脱水催化剂作为多相催化剂存在时，优选的是，所述脱水催化剂与支持物x相接触。作为支持物x，可以考虑技术人员认为合适的所有固体材料。在这种情况下，优选的是，该固体材料具有合适的孔体积，其适合于良好地系住和接纳脱水催化剂。此外，在0.01至3ml/g范围内的根据DIN 66133的总孔体积是优选的，和在0.1至1.5ml/g范围内的总孔体积是特别优选的。此外，优选的是，按照根据DIN 66131的BET测试，适合作为支持物x的固体材料具有0.001至1000m2/g，优选地0.005至450m2/g，和更优选地0.01至300m2/g的表面积。作为用于脱水催化剂的支持物，首先可以使用具有0.1至40mm，优选地1至10mm，和更优选地1.5至5mm的平均颗粒直径的疏松材料。进一步地，脱水反应器的壁可以充当支持物。此外，支持物本身可以是酸性的或碱性的，或者可以在惰性支持物上涂覆酸性或碱性的脱水催化剂。作为涂覆技术，特别可以提及浸没或浸渍或者掺入到支持物基质中。
作为还可以具有脱水催化剂特性的支持物x，特别合适的是天然或合成的硅酸盐物质，例如特别是丝光沸石、蒙脱石、酸性沸石；用一、二或多碱价无机酸(特别是磷酸)或者无机酸的酸式盐涂布的支持物材料，例如氧化物或硅酸盐类型的物质，例如Al2O3、TiO2；氧化物和混合氧化物，例如γ-Al2O3和杂多酸的ZnO-Al2O3混合氧化物。
相应于一个根据本发明的实施方案，支持物x至少部分地由氧化物类型的化合物组成。这样的氧化物类型的化合物应当具有元素Si、Ti、Zr、Al、P中的至少一种元素或者其中至少两种元素的组合。这样的支持物由于其酸性或碱性特性而本身还可以用作脱水催化剂。优选的既用作为支持物x也用作脱水催化剂的化合物类别包括硅/铝/磷氧化物。优选的既用作脱水催化剂也用作支持物x的碱性物质包括碱金属、碱土金属、镧、镧系元素或其中至少两种(以其氧化物形式)的组合。这样的酸性或碱性脱水催化剂不仅可以从Degussa AG，而且可以从Südchemie AG商购获得。其他类别为离子交换剂。同样地，这不仅可以以碱性形式，而且可以以酸性形式存在。
特别地，作为均相脱水催化剂，可以考虑无机酸，优选地含磷的酸，和更优选地磷酸。这些无机酸可以通过浸没或浸渍而固定在支持物x上。
特别地，在气相脱水的情况下，使用多相催化剂经证明是特别有利的。然而，在液相脱水的情况下，既使用均相脱水催化剂也使用多相脱水催化剂。
此外，优选的是，在根据本发明的方法中，所使用的脱水催化剂具有+1至-10，优选地+2至-8.2，和更优选地，在液相脱水的情况下+2至-3，和在气相脱水的情况下-3至-8.2的H0-值。H0-值相应于根据

的酸性功能(

)，并且通过所谓的胺滴定和使用指示剂，或通过气体形式的碱的吸收来算出(参见“Studies inSurface Science and Catalytics”，Vol.51，1989“New solid Acidsand Bases，their catalytic Properties”，K.Tannabe等人)。
根据本发明的方法的一个特别的实施方案，作为酸性固体催化剂，使用与无机酸，优选地与磷酸，或与超酸例如硫酸化或磷酸化的锆氧化物相接触的多孔支持体，所述多孔支持体以优选地至少90重量％，更优选地至少95重量％，和最优选地至少99重量％基于硅氧化物，优选地基于SiO2。多孔支持体与无机酸的接触优选地通过用酸对支持体进行浸渍来实现，其中优选地以相对于支持体的重量而言10至70重量％，特别优选地20至60重量％，和更优选地30至50重量％的量，使所述酸与所述多孔支持体相接触，并随后进行干燥。在干燥后，加热所述支持体以固定无机酸，优选地在300至600℃，更优选地在400至500℃的温度下。
依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案，脱水在气相中进行。在此，可以使用常规的装置(如技术人员已知其用于气相反应)，例如管式反应器。特别优选的是，使用管束热交换器以及包含热交换板(Thermobleche)作为热交换器的反应器。
根据气相脱水的一个实施方案，将纯的3-羟基异丁酸引入到反应器中，所述反应器包含上文所提及的固定床催化剂中的一种。根据另一个实施方案，将以下列形式的3-羟基异丁酸引入到反应器中包含2至80重量％，特别优选地5至50重量％，和更加优选地10至25重量％的3-羟基异丁酸的水溶液(各基于水溶液的总重量计)。如此地来选择反应器内的压力和温度条件，即从而使得3-羟基异丁酸或水溶液在其进入反应器中时以气态形式存在。气相中的脱水优选地在200至400℃，特别优选地250至350℃的温度范围内来进行。在气相脱水的情况下，反应器内的压力优选地在0.1至50巴的范围内，特别优选地在0.2至10巴的范围内，和最优选地在0.5至5巴的范围内。
在气相脱水的情况下，引入反应器中的3-羟基异丁酸的量优选地在10至100体积％的范围内，特别优选地在20至100体积％的范围内，和最优选地在30至100体积％的范围内。
根据本发明的方法的另一个特别的实施方案，脱水在液相中进行。液相脱水同样可以在技术人员已知的所有装置中进行，在所述装置中可以将流体加热至所希望的反应温度，其中可以向所述装置施加这样的压力，所述压力足以使反应组分在所希望的温度条件下保持液态。
依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案，液相脱水的方法包括第一步骤，在所述步骤中，将纯的3-羟基异丁酸或者包含5至100重量％，特别优选地20至100重量％和最优选地50至100重量％的3-羟基异丁酸的水溶液(基于水溶液的总重量计)引入到反应器中。如此地来选择反应器内的压力和温度条件，即从而使得3-羟基异丁酸或水溶液在其进入反应器中时以液体形式存在。依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案(其中脱水在液相中进行)，使3-羟基异丁酸或水溶液在脱水反应器内如此地经过催化剂固定床，从而使得液相滴流经过催化剂颗粒的表面。这样的程序例如可以在滴流床反应器中进行。
液相中的脱水优选地在200至350℃，特别优选地250至300℃的温度范围内进行。在液相脱水的情况下，反应器内的压力优选地在1至50巴的范围内，特别优选地在2至25巴的范围内，和最优选地在3至10巴的范围内。
不仅在气相脱水的情况下，而且在液相脱水的情况下，脱水过程的催化可以均相地或多相地来进行。
在均相催化的情况下，首先将催化剂与纯的3-羟基异丁酸或者与包含3-羟基异丁酸的水溶液相接触，在此所述催化剂优选地为无机酸例如磷酸或硫酸。随后，将如此获得的组合物引入反应器中，并在所希望的压力和温度条件下转变成甲基丙烯酸。还可以考虑独立于3-羟基异丁酸或所述水溶液地将无机酸引入反应器中。在该情况下，反应器具有至少两个输入管道，一个用于3-羟基异丁酸或包含3-羟基异丁酸的水溶液，而另一个用于催化剂。如果在滴流床反应器中在液相中进行脱水，那么优选的是，将催化剂与3-羟基异丁酸或包含3-羟基异丁酸的水溶液一起引入至反应器的顶部区域。
在异相催化的情况下，催化剂在反应室中以固体基质的形式存在，例如以固定床填料的形式，以涂覆有催化剂的板(优选地，被布置于反应器内的热交换板)的形式，或者以涂覆有催化剂的反应器壁的形式。可能的反应器例如描述于DE-A-198 48 208、DE-A-100 19 381和EP-A-I 234 612中。在异相催化的情况下，作为催化剂，优选的是与无机酸相接触的(优选地，用无机酸浸渍的)多孔支持物。然后，将3-羟基异丁酸或包含3-羟基异丁酸的水溶液以蒸汽或液体形式与固体催化剂材料的表面相接触。
依照根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案，3-羟基异丁酸在液相中的脱水，在200至500毫巴的压力下，在200至230℃的温度下，并在作为催化剂的碱金属离子存在下进行。
作为在脱水后获得的反应混合物，获得不含催化剂成分的甲基丙烯酸水溶液(这样的溶液是在异相催化脱水的情况下获得的)或者包含催化剂的甲基丙烯酸水溶液(这样的溶液是在均相催化脱水的情况下获得的)。此外，甲基丙烯酸水溶液可以以液体形式(如果脱水在液相中进行)或者以气态形式(如果脱水在气相中进行)存在。
依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案，可以任选地使如此获得的甲基丙烯酸溶液进行酯化，而无需进一步的处理。在此，使甲基丙烯酸溶液与相应的醇(例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或1-丁醇)以及合适的技术人员已知的酯化催化剂(例如浓酸)在加热下相接触，并且以这种方式将甲基丙烯酸转变成相应的酯。然而，有利的是，还在酯化前对甲基丙烯酸进行纯化，其中原则上可以使用技术人员已知的任何纯化方法来进行纯化，所述纯化方法常规地用于纯化被污染的、通过丙烯的催化气相氧化而获得的(甲基)丙烯酸。
如果脱水在气相中进行，那么优选的是，首先使甲基丙烯酸冷凝，从而获得甲基丙烯酸水溶液。在此，原则上可以使用技术人员已知的任何冷凝方法，例如分级冷凝，如在WO-A-2004/035514、WO-A-03/014172或EP-A-EP 1 163 201中所描述的，或者通过完全冷凝，如在EP-A-0 695 736中所描述的。还可以考虑的是，在冷凝的情况下添加另外的溶剂，特别是水，以便尽可能完全地吸收甲基丙烯酸。
然后，可以在进一步的纯化步骤中使在冷凝后获得的甲基丙烯酸水溶液或者在液相脱水的情况下获得的甲基丙烯酸水溶液去除水和其他污染物。在此，可以首先在共沸剂存在下通过共沸蒸馏来除去水，如例如在DE-A-198 53 064中所描述的。还可以考虑的是，使用高沸点有机溶剂来吸收甲基丙烯酸，如例如在EP-A-0 974 574中所公开的。除了这些蒸馏方法外，还可以使用膜来进行除水，如例如在DE-A-44 01405中所提出的。此外，还可以考虑通过结晶方法来纯化在液相脱水的情况下得到的或者通过冷凝获得的甲基丙烯酸水溶液。
在除水后获得的甲基丙烯酸可以在进一步的步骤中更进一步进行纯化。因此，可以通过进一步的蒸馏步骤来去除仍然含有的高沸点污染物。然而，下述情形是特别优选的，即通过结晶方法来进一步纯化在除水后获得的甲基丙烯酸，如例如在DE-A-101 49 353中所描述的。
然后，任选地，如此获得的经纯化的甲基丙烯酸可以经历酯化。
此外，一种用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法为解决开头所述的任务作出了贡献，所述方法包括下列步骤 IIA)通过上文所描述的方法来制备基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸， IIB)裂解基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸从而形成3-羟基异丁酸，以及任选地，中和3-羟基异丁酸和/或纯化3-羟基异丁酸， IIC)使3-羟基异丁酸脱水从而形成甲基丙烯酸，以及任选地，使甲基丙烯酸盐或甲基丙烯酸酯化。
一种用于制备聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法也为解决开头所述的任务作出了贡献，所述方法包括下列步骤 IIIA)通过上文所描述的方法来制备甲基丙烯酸， IIIB)甲基丙烯酸的自由基聚合， 其中，任选地，在自由基聚合之前或之后，甲基丙烯酸的羧基基团可以至少部分地被酯化。
现在，借助于非限制性的附图和实施例来更详细地说明本发明。
图1显示了由酶E1所催化的从琥珀酰辅酶A向甲基丙二酰辅酶A的转化。
图2显示了依照根据本发明的方法的第一个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E2至E4所催化的从甲基丙二酰辅酶A向3-羟基异丁酸的转化。
图3显示了依照根据本发明的方法的第二个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E4、E6和E7所催化的从(R)-甲基丙二酰辅酶A向3-羟基异丁酸的转化。
图4显示了依照根据本发明的方法的第三个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E4、E5和E7所催化的从甲基丙二酰辅酶A向3-羟基异丁酸的转化。
图5显示了由酶E8和E9所催化的从3-羟基异丁酸向聚羟基链烷酸的转化。
图6显示了依照根据本发明的方法的第一个、第二个或第三个备选方案的一个特别的布置方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E10或E11所催化的从磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸向草酰乙酸的转化。
图7显示了依照根据本发明的方法的第一个、第二个或第三个备选方案的第一个特别的布置方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E12至E15所催化的从草酰乙酸向琥珀酰辅酶A的转化。
图8显示了依照根据本发明的方法的第一个、第二个或第三个备选方案的第二个特别的布置方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E13至E16和E24至E26所催化的从草酰乙酸向琥珀酰辅酶A的转化。
图9显示了依照根据本发明的方法的第一个、第二个或第三个备选方案的第三个特别的布置方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E16、E24、E27和E28所催化的从草酰乙酸向琥珀酰辅酶A的转化。
图10显示了依照根据本发明的方法的第一个、第二个或第三个备选方案的进一步的特别的布置方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的琥珀酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E46和E28所催化的从L-谷氨酸向琥珀酰辅酶A的转化。
图11和12显示了依照根据本发明的方法的第二个特别的实施方案的第一个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的丙酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E4、E5和E47至E52所催化的从乙酰辅酶A向3-羟基异丁酸的转化。
图13和14显示了依照根据本发明的方法的第二个特别的实施方案的第二个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的丙酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E2至E4、E6、E7和E47至E52所催化的从丙酰辅酶A向3-羟基异丁酸的转化。
图15和16显示了依照根据本发明的方法的第二个特别的实施方案的第三个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的丙酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E2至E4、E7和E47至E52所催化的从丙酰辅酶A向3-羟基异丁酸的转化。
图17显示了依照根据本发明的方法的第二个特别的实施方案的第五个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的丙酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E53至E55、E58和E62至E65所催化的从两个单元的乙酰辅酶A向乙醛酸和丙酰辅酶A的转化。
图18显示了依照根据本发明的方法的第三个特别的实施方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的丙烯酰辅酶A和作为初产物的甲基丙二酸半醛)，由酶E2至E4、E62、E72和E73所催化的从β-丙氨酸向3-羟基异丁酸的转化。
图19显示了依照根据本发明的方法的第二种变化形式的第一个特别的实施方案的第一个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的异丁酰辅酶A和作为初产物的3-羟基异丁酰辅酶A)，由酶E76至E79、E60、E61和E8所催化的从丙酮酸向3-羟基异丁酸的转化。
图20显示了依照根据本发明的方法的第二种变化形式的第一个特别的实施方案的第二个备选方案(其中使用经基因工程改造的细胞，在所述细胞中在制备3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸期间，形成作为中间产物的异丁酰辅酶A和作为初产物的3-羟基异丁酰辅酶A)，由酶E8、E60、E61、E79和E80所催化的从L-缬氨酸向3-羟基异丁酸的转化。
图21显示了来自实施例3的质粒pEKEx2MCM cgl。
图22显示了来自实施例3的载体pGA4_3HIBDH。
图23显示了来自实施例3的载体pGA5_MMCoAR_3HIBDH。
图24显示了来自实施例3的载体pECXT99A。
图25显示了来自实施例3的载体pECXT99A_MMCoAR_3HIBDH。
图26显示了在实施例3中借助于离子色谱法来检测由重组细胞所进行的3-羟基异丁酸的形成。
图27显示了离子色谱法检测，其表明在图26中所标出的峰为关于3-羟基异丁酸的峰。
实施例 实施例1 现在，在实施例1中借助于这样的重组细胞来阐明本发明，所述重组细胞能够从作为碳源的L-缬氨酸开始，经由作为初产物的3-羟基异丁酰辅酶A和作为中间产物的异丁酰辅酶A来产生3-羟基异丁酸。根据本发明，可以使用所述细胞来制备甲基丙烯酸。为此，在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达酶EC 2.6.1.42和EC 1.2.4.4(均来自铜绿假单胞菌)，以及包括三种酶EC 1.3.99.12、EC 4.2.1.17和EC 3.1.2.4(来自乙酸钙不动杆菌)的簇。
在此，酶EC 1.2.4.4由具有根据SEQ ID NO07和08(α-和β-亚基)的DNA序列的基因编码，而酶EC 2.6.1.42由具有根据SEQ IDNO09的DNA序列的基因编码。酶EC 1.3.99.12由具有根据SEQ IDNO10的DNA序列的基因编码，酶EC 4.2.1.17由具有根据SEQ ID NO11的DNA序列的基因编码，和酶EC 3.1.2.4由具有根据SEQ ID NO12的DNA序列的基因编码。
1.生物体、质粒和寡核苷酸 使用下列细菌菌株、载体、基因组DNA和寡核苷酸来制备所述重组细胞 表1所使用的细菌菌株
表2所使用的载体
表3所使用的基因组DNA 表4所使用的寡核苷酸
2.PCR片1.2.4.4(2313kb)和2.6.1.42(958bp)的扩增 首先，借助于表4中给出的根据SEQ ID NO15至SEQ ID NO18的引物，从来自铜绿假单胞菌的总DNA开始通过PCR来扩增出1.2.4.4和2.6.1.42的片段。
3.载体pCDF-Duet-1和PCR片段2.6.1.42(958bp)的消化 用EcoRI/SalI切割载体pCDFDuet-1(具有链霉素/壮观霉素抗性)，PCR片段2.6.1.42也同样如此处理，并用T4连接酶使如此获得的限制酶切物连接过夜。获得载体pCDFDuet::2.6.1.42。
4.将PCR片段克隆到载体pCR2.1-TOPO中 根据制造商的说明，使用载体pCR2.1-TOPO来制备包含片段2.6.1.42或片段1.2.4.4的克隆载体。用以这种方式获得的克隆载体pCR2.1-TOPO::1.2.4.4和pCR2.1-TOPO::2.6.1.42来转化大肠杆菌DH5α细胞。由于载体pCR2.1-TOPO具有卡那霉素和氨苄青霉素抗性，因而将其在2AXI和KXI平板上铺板(20和40μl)。分离出所获得的克隆的质粒，并进行消化 pCR2.1-TOPO::1.2.4.4 BgIII+KpnI片段大小2313bp pCR2.1-TOPO::2.6.1.42 EcoRI+SalI片段大小958bp 将所述片段各自从凝胶中洗脱，并用Qiagen试剂盒QIAquick(根据指导)进行纯化。
5.载体pCDFDuet::2.6.1.42-1.2.4.4的制备 将载体pCDFDuet::2.6.1.42以及载体pCR2.1-TOPO::1.2.4.4用BgIII/KpnI进行消化。随后，将pCDFDuet::2.6.1.42(BgIII/KpnI)与pCR2.1-TOPO::1.2.4.4进行连接，从而获得载体pCDFDuet::2.6.1.42-1.2.4.4。用该克隆载体再次转化大肠杆菌DH5α细胞。分离出质粒。质粒pCDFDuet::2.6.1.42-1.2.4.4具有根据SEQID NO19的DNA序列。
6.来自乙酸钙不动杆菌的缬氨酸-簇(V-ClusAca)的克隆 培养菌株ATCC 33304酸钙不动杆菌(HH琼脂或培养基)以用于分离总DNA。用Qiagen的试剂盒DNEasy(L1和L2)并通过包括下列步骤的方法来进行总DNA的分离i)离心1mL培养物，ii)向粒状沉淀中添加200μL H2O，iii)在95℃下加热10分钟，iv)离心(10分钟，13000rpm)，以及v)移出上清液以用于PCR。
为了从乙酸钙不动杆菌中扩增出缬氨酸-簇，使用表4中给出的根据SEQ ID NO13和SEQ ID NO14的引物进行PCR(根据制造商的指导，使用聚合酶Pfu或Taq)。
将PCR产物进行纯化，并根据指导连接至质粒pET101/D-TOPO，以及引入大肠杆菌DH5α中。获得质粒pET101/D-TOPO::V-簇Aca。质粒pET101/D-TOPO::V-簇Aca具有根据SEQ ID NO20的DNA序列。
7.能够从L-缬氨酸形成3-羟基异丁酸的重组细胞的制备 用质粒pET101/D-TOPO::V-簇Aca和pCDF-Duet::2.6.1.42-1.2.4.4转化大肠杆菌BL21(DE3)(在LB-Spec./Amp培养基上铺板)。如此获得的细胞能够在包含L-缬氨酸的培养基中将L-缬氨酸转化为3-羟基异丁酸。与此相反，所述细胞的野生型(大肠杆菌BL21(DE3))在这样的培养基中不形成可检测量的3-羟基异丁酸。
实施例2 在该实施例中，分离出编码基因的DNA，并在大肠杆菌中过表达该基因。该DNA编码不仅具有酶E2的活性而且具有酶E3的活性的酶。
1.Sulfolobus tokodaii的培养和收获 在75℃和3.0的pH值下，在摇动(150rpm)下，以小的培养体积(40-200ml)使Sulfolobus tokodaii进行生长。采用光度法通过测量578nm处的光密度(OD578nm)来监测生长。使用经改良的Sulfolobus-培养基(根据Brock等人，Archives of Microbiology 84，第54-68页，1972；Suzuki等人，Extremophiles，6，第39-44页，2002进行改良)。酵母提取物、酪蛋白氨基酸和葡萄糖充当能源和碳源。该培养基由下列组分组成基础培养基、葡萄糖储液、铁储液和痕量元素储液。在0.3-0.5的OD578nm(指数期)时收获细胞。在Sorvall离心机(SS34转子)中以9000rpm离心15分钟。将细胞沉淀直接用于DNA提取。
基础培养基。KH2PO4(0.28g/l)、(NH4)2SO4(1.3g/l)、MgSO4×7H2O(0.25g/l)、CaCl2×6H2O(0.07g/l)、酵母提取物(1g/l)和酪蛋白氨基酸(1g/l)。在进行高压灭菌前，用H2SO4将pH值调整至3.0。
葡萄糖储液(100倍)。葡萄糖(100g/l)。对该溶液进行过滤除菌。
铁储液(1000倍)。FeCl3×6H2O(20g/l)。对该溶液进行过滤除菌。
痕量元素储液(1000倍)。MnCl2×4H2O(1.8g/l)、Na2B4O7×10H2O(4.5g/l)、ZnSO4×7H2O(220mg/l)、CuCl2×2H2O(50mg/l)、Na2MoO4×2H2O(30mg/l)、VOSO4×5H2O(30mg/l)、CoCl2×6H2O(8.4mg/l)。将各组分依次溶解在蒸馏H2O中，用HCl将pH值调整至3.0，并对该溶液进行过滤除菌。
2.从S.tokodaii中分离基因组DNA 依照Murray和Thompson的方法(Nucleic Acid Research，8，第4321-4325页，1980)进行基因组DNA的分离。为此，在1.5mlEppendorf反应容器中称取10-50mg(湿重)新收获的细胞，并重悬浮于570ml TE缓冲液(10mM Tris/HCl(pH 8.0)，1mM NaEDTA)中。添加30μl 10％(w/v)SDS溶液(十二烷基硫酸钠溶液)和3μl蛋白酶K(20μg/μl)，并在52℃下温育1小时。此后添加100μl 5M NaCl溶液和80μl经预热的10％(w/v)鲸蜡基三甲基铵溴化物(CTAB)溶液(10％(w/v)CTAB，在0.7M NaCl中)。在65℃下温育10分钟后，用780μl氯仿/异戊醇(24∶1(v/v))提取由CTAB、细胞壁碎片和蛋白质组成的复合物，并在14000rpm下离心15分钟。将上层水相转移至Eppendorf反应容器中，并重复进行提取。在水相没有色素后，将其用400μl 100％异丙醇覆盖。通过小心地混合两个相，染色体DNA在边界层处沉淀出来。可以用拉长的巴斯德移液管捞出DNA，并在200μl 70％乙醇中进行洗涤。在再次进行离心(5分钟，14000rpm)后吸出上清液，将DNA在室温下干燥2小时，并最后溶解在100μl TE缓冲液中。
3.丙二酰辅酶A还原酶基因的扩增 使用聚合酶链式反应(PCR)(Mullis等人，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.，51，第263-273页，1986)，以便从在实施例2中获得的Sulfolobus tokodaii基因组DNA开始有针对性地扩增出丙二酰-CoA还原酶基因。所述聚合酶链式反应在循环变温器(Biometra，

)中进行。
采用其中使用Pfu聚合酶(Pfunds，Genaxxon)的制备型PCR。Pfu聚合酶包含3′-5′外切核酸酶(“校正”)功能。
使用下面的引物 5′-ATTATCCCATGGGGAGAACATTAAAAGC-3′(“正向引物”；NcoI切割位点用下划线标出；SEQ ID NO21)，和 5′-CGGGATCCTTACTTTTCAATATATCC-3′(“反向引物”；BamHI切割位点用下划线标出；SEQ ID NO22)。
对于PCR反应，使用在下表1中给出的反应批料(Ansatz)。作为热启动PCR来进行所述PCR，即在添加Pfu聚合酶之前，将反应批料在95℃下温育2分钟。随后进行30个循环，其中每个循环为95℃ 1分钟，45℃ 1分钟，和72℃ 5分钟，接着进行最后步骤，其中45℃30秒，72℃ 15分钟，和最后停留在6℃。
表1用于使用Pfu聚合酶的校正PCR的标准反应批料(50μl) 获得长度为1.1kb的基因片段。
4.丙二酰辅酶A还原酶基因的克隆 为了从Sulfolobus tokodaii中克隆出丙二酰辅酶A还原酶基因，用“pCR T7 Topo TA Expression Kit”(Invitrogen，Karlsruhe)将在实施例3中扩增出的基因非特异性地克隆到载体pCR T7/CT-Topo(Invitrogen，Karlsruhe)中。这按照制造商的说明来进行。
为了分离质粒DNA，依照制造商的指导，用Qiagen的“QIAprepSpin Plasmid Miniprep Kit”(Hilden)，从5ml经转化的大肠杆菌TOP10F′细胞的过夜培养物中制备质粒DNA。
5.表达载体的制备 为了制备包含丙二酰辅酶A还原酶基因的表达载体，用限制酶NcoI和BamHI对在实施例4中获得的经分离的克隆载体进行限制酶切消化。为此，将25-27μl质粒DNA(表达载体pTrc99A或装配有丙二酰辅酶A还原酶基因的pCR T7/CT-Topo载体)与5μl 10倍浓缩反应缓冲液和2-3μl限制酶(10U/μl；Fermentas，St.Leon-Rot)充分混合。用蒸馏H2O将该反应批料补足至50μl，并在制造商指定的温度下温育5小时。在进一步使用前，进行乙醇沉淀。为此，将DNA与3个体积单位的100％乙醇和0.1个体积单位的3M乙酸钠缓冲液(pH5.3)相混合，并在-80℃下温育2小时或过夜。在离心步骤(20分钟，14000rpm，4℃，Eppendorf台式离心机)之后，小心地移去上清液，并用3个体积单位的70％(v/v)乙醇洗涤DNA。在室温下温育10分钟后，再次离心(10分钟，14000rpm，4℃，Eppendorf台式离心机)，并弃去上清液。将DNA在室温下干燥1小时，并随后接纳在所希望的体积的H2O或TE缓冲液(10mM Tris/HCl(pH 8，0)，1mM NaEDTA)中。
然后，使用碱性磷酸酶，以便去除线性化的双链载体的5′-磷酸基团。以这种方式增加了克隆效率，这是因为阻止了载体的重新连接。使用牛小肠碱性磷酸酶来使经消化的载体去磷酸化。
去磷酸化在与限制酶切消化相同的缓冲液中进行。将50μl限制酶切批料与1.5μl CIAP(牛小肠碱性磷酸酶)(1U/μl；Fermentas，St.Leon-Rot)相混合，并于37℃温育30分钟。在进一步使用经切割并去磷酸化的载体之前，如上文所描述的进行乙醇沉淀。
使用T4 DNA连接酶进行插入物DNA与表达载体的连接，其中以1∶3至1∶6的摩尔比使用质粒DNA和插入物DNA。
储液 连接缓冲液(10倍) 0.5M Tris/HCl，pH 7.6 100mM MgCl2 0.5mg/ml BSA 过滤除菌，在室温下贮存 5mM ATP(腺苷三磷酸) 总是在无菌蒸馏H2O中新鲜配制 50mM DTE(二硫赤藓糖醇) 总是在连接缓冲液中新鲜配制 连接批料具有50μl的体积。将质粒DNA(2-10μl)、插入物DNA(2-20μl)、5μl具有DTE(50mM)的连接缓冲液和相应量的无菌蒸馏H2O移液在一起，涡旋振荡，短暂离心，并随后在45℃下温育5分钟。将批料在冰上进行冷却。添加5μl 5mM ATP和1.5μl T4 DNA连接酶(1U/μl；Fermentas；St.Leon-Rot)，并将所得批料进行混合。于16℃连接过夜。
直接使用该连接批料来转化化学感受态细胞。
6.用表达载体转化大肠杆菌细胞 从大肠杆菌Rosetta 2细胞的单个菌落开始，生长出5ml过夜培养物。次日早晨，用0.5-1.0ml该培养物接种50ml LB培养基(Sambrook等人，“Molecular CloningA Laboratory Manual”，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。在培养1.5-2小时(37℃，摇动(180rpm))后，达到0.6的OD578nm，将细胞在冰上冷却10分钟，并随后在5000rpm和4℃下离心5分钟(GSA转子，Sorvall离心机)。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬浮在2.7ml冷的0.1M CaCl2溶液中。在添加2.3ml无菌的50％(v/v)甘油后，将细胞悬浮液按份(各300μl)分配入1.5mlEppendorf反应容器中。立即将感受态细胞在液氮中进行冷冻，并随后贮存于-80℃。
为了转化细胞，将化学感受态细胞的等分试样(300μl)在冰上解冻，并掺入25μl连接批料。小心地混合所得的批料，并在冰上温育30分钟。在热激(42℃，1分钟)后，在冰上再温育5分钟。接着添加800μl LB培养基(Sambrook等人，1989)，并将细胞于37℃摇动1小时(Thermomixer，Eppendorf 5436)。在将该批料涂布在LB培养基上之前，再次浓缩该批料。为此，在10000rpm下离心1分钟，弃去750μl的上清液，并重悬浮细胞沉淀。将50μl、100μl和200μl的该经浓缩的批料涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板(Sambrook等人，1989)上，并于37℃在培养箱中温育过夜。用1mlLB培养基洗涤平板。然后，在500ml带挡板的锥形瓶(Erlenmeyer-Schikanekolben)中用该细胞悬浮液接种150ml LB培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)。培养物在37℃和180rpm下生长。在0.6的OD578nm时，通过经添加0.5M IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖糖苷)而诱导pTrc99A中的启动子来进行过表达。将经诱导的培养物在所述条件下温育3小时，然后在OD578nm＝2.7时进行收获。
7.酶活性的检测 借助于细胞破碎装置将在实施例6中获得的大肠杆菌菌株破碎。将细胞破碎物在85℃下加热15分钟。在该加热沉淀期间，非热稳定的酶凝固并沉淀下来。由于目标蛋白质是热稳定的，因而它保留在上清液中。为了测量丙二酰辅酶A还原酶活性，将上清液按1∶50的比例稀释在TM缓冲液(50mM Tris/Cl，1mM MgCl2，pH 8.1)中。向500μl HIPS缓冲液(100mM HEPES/NaOH，5mM MgCl2，1mM二硫赤藓糖醇，包含0.5mM NADPH)中，移液入30μl经稀释的或未稀释的(用于检测甲基丙二酰辅酶A还原酶活性)上清液。
在第一批料中，通过添加丙二酰辅酶A来开始反应，其中终浓度为0.5mM。测得在365nm处的NADPH吸收下降。所测得的酶活性为15.5μmol/分钟/mg蛋白质(15.5U/mg)。
在第二批料中，通过添加甲基丙二酰辅酶A(Fluka公司，产品编号67767)来开始反应，其中终浓度为2.0mM。测得NADPH吸收下降。所测得的酶活性为0.24μmol/分钟/mg蛋白质(0.24U/mg)。
从这些结果可以得知，由具有SEQ ID NO03的DNA序列所编码的多肽，不仅催化丙二酰-CoA的转化而且催化甲基丙二酰辅酶A的转化。
对于每摩尔所使用的丙二酰-CoA或甲基丙二酰-CoA，氧化了1摩尔NADPH。由此得出结论所述酶反应导致获得相应的半醛。
实施例3 在实施例3中，借助于由这样的重组细胞制备甲基丙烯酸来进一步阐明本发明，所述重组细胞能够从作为碳源的葡萄糖开始，经由作为初产物的甲基丙二酸半醛来产生3-羟基异丁酸。为此，在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中尤其过表达了甲基丙二酰辅酶A变位酶(E1)和3-羟基异丁酸脱氢酶(E4)。
1.将基因NCgl1470、NCgl1471和NCgl1472(精氨酸/鸟氨酸转运系统ATP酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶和甲基丙二酰辅酶A变位酶，N-末端结构域/亚基)克隆到pEKEx2中，构建pEKEx2MCM cgl 关于DNA操作，采用标准技术，如在Sambrook，J.等人，(1989)，“Molecular Cloninga laboratory manual”，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York中所说明的。用SAWADY Pwo-DNA聚合酶(Peqlab Biotechnologie，Erlangen，Germany)或Platinum Pfx-DNA-聚合酶(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)来进行DNA扩增。当没有另外说明时，聚合酶的使用按照制造商的说明来进行。用于PCR扩增的寡核苷酸以及限制酶切位点的引入从MWG-Biotech(Ebersberg，Germany)获得。所构建的菌株的检测通过菌落PCR来进行，其中使用Taq聚合酶READYMIX(Sigma，Taufkirchen，Germany)以及质粒制备物。根据制造商的说明，用MinElute凝胶提取试剂盒(Quiagen，Hilden，Germany)来纯化和获得DNA片段。借助于Qiaprep spin Miniprep试剂盒(Quiagen，Hilden，Germany)来分离质粒DNA。所有构建出的质粒通过限制性分析以及随后的测序来进行验证。
为了构建pEKEx2MCM_cgl，使用载体pEKEx2(Kleinertz等人，1991 Gene 10293)，其允许所克隆的基因在(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖糖苷)(IPTG)可诱导的tac启动子和lac阻抑蛋白系统(lacIq)的控制下进行转录。借助于下面的寡核苷酸和作为模板的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的DNA来扩增编码基因NCgl1470、NCgl1471和NCgl1472的5.2kb大小的DNA片段 pcg1859-57_正向(SEQ ID NO23) 5′-cggtcgacaaggagatatagataTGACTGATCTCACAAAGACTGC-3′，和 pcg1857-59_反向(SEQ ID NO24) 5′-cTTAGGCTTTGTCGAACGCCTCC-3′。
(与基因组序列互补的序列以大写字母标明)。
此外，在扩增产物中在起始密码子前8个核苷酸处引入限制酶切位点(用下划线标出)和核糖体结合位点(aaggag)。在此，原始的起始密码子TTG被替换为ATG。用多核苷酸激酶(Roche，Basel，Switzerland)使PCR扩增产物磷酸化，并将其以平端克隆到载体pUC19的SmaI切割位点中(Yanisch-Perron等人，1985，Gene 33103-19)。5.2kb插入物的身份和正确性通过测序来确认。然后，从该pUC19衍生物中分离出5.2kb片段(作为SalI片段)，并连接到载体pEKEx2的SalI切割位点中。根据限制酶切消化来选择具有正确方向的质粒，并且将其中一个命名为pEKEx2MCM cgl。在图21中显示了该所获得的质粒。
2.将来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的3-羟基异丁酸脱氢酶克隆到pEKEx2中，构建pEC-XT99A MMCoAR 3HIBDH 在考虑了谷氨酸棒杆菌的密码子使用的情况下来合成来自嗜热栖热菌(TTHA0237)的3-羟基异丁酸脱氢酶(3HIBDH)的基因。将该在密码子使用方面经优化的基因(SEQ ID NO25)合成入载体pGA4中(pGA4_3HIBDH，图22)。通过用内切核酸酶KpnI和Ecl136II消化载体pGA4_3HIBDH，将3HIBDH的基因连接到用限制酶BamHI(和随后的补平反应)和KpnI线性化的载体pGA5_MMCoAR中，所述载体已经包含有处于T7启动子的功能性表达控制下的从来自Sulfolobustokodaii的甲基丙二酰辅酶A变位酶推导出的序列。所得到的载体pGA5_MMCoAR_3HIBDH描绘在图23中。
通过用KpnI和Ecl136II进行消化，从载体pGA5_MMCoAR_3HIBDH中，将具有甲基丙二酰辅酶A还原酶和3HIBDH的插入片段克隆到通过用限制性内切核酸酶BamHI(和随后的补平反应)和KpnI进行消化而线性化的目标载体pECXT99A(登录号AY219684，图24)中(所得到的载体pECXT99A_MMCoAR_3HIBDH，图25)。
3.用pEKEx2MCM cgl和pEC-XT99A 3HIBDH varIIMMCoAR转化的谷氨酸棒杆菌细胞的制备 如Tauch等人所描述的(Curr Microbiol.2002，45362-367)来进行谷氨酸棒杆菌ATCC13032的感受态细胞的制备。借助于电穿孔来引入pE-KEx2MCM_cgl和pEC-XT99A_3HIBDH_varIIMMCoAR的DNA，并且将转化体在Merck公司(Darmstadt，Deutschland)的脑心琼脂(补充有50mg/l卡那霉素和5mg/l四环素)上进行选择(Liebl等人，FEMS Microbiol Lett.，1989，53299-303)。从转化体中分离出质粒DNA，并且借助于限制酶切消化来进行表征。以这种方式，获得了谷氨酸棒杆菌pEKEx2MCM_cgl/pEC-XT99A_3HIBDH_varIIMMCoAR。
4.进行培养和制备3-羟基异丁酸 将谷氨酸棒杆菌pEKEx2MCM_cgl/pEC-XT99A_3HIBDH_varIIMMCoAR的单个菌落接种在25ml含有15μg/l卡那霉素和5μg/l四环素的完全培养基(脑心培养基)中，并在30℃和200rpm下培养过夜。作为对照，使野生型在没有抗生素的情况下生长。
将培养物进行离心(10分钟，4℃，5292×g)并用盐水(0.9％NaCl)进行洗涤。将细胞重悬浮在25ml(在250ml烧瓶)含有抗生素(15μg/l卡那霉素和5μg/l四环素)的GCXII培养基中。用0.5mM(12.5μl的1M储液)IPTG来诱导携带质粒的菌株。
基本培养基CGXII(根据Keilhauer等人，J Bacteriol.1993，1755595-5603) 20g(NH4)2SO4 5g 尿素 1g K2HPO4 1g KH2PO4 42g MOPS 1ml MgSO4×7H2O(25g/100ml，过滤除菌) 1ml CaCl2×2H2O(1.32g/100ml，过滤除菌) 将所述盐溶解在约800ml重蒸馏水中并用KOH将pH调整至7。为此，添加约20-25颗KOH丸粒，随后用10N KOH滴定至pH 7。然后，用重蒸馏水将所述培养基成分补足至约900ml，并进行高压灭菌。
在高压灭菌后，添加1ml痕量元素盐溶液。
痕量元素盐溶液 1g FeSO4×7H2O 1g MnSO4×H2O 0.1g ZnSO4×7H2O 0.02gCuSO4 0.002g NiCl2×6H2O 将所述盐溶解在100ml去离子H2O中，并且在此用HCl进行酸化(pH-试纸，约pH 1)。接着，对溶液进行过滤除菌。
向该培养基中添加100ml 50％的葡萄糖(终浓度5％)，若为了得到4％的终浓度则添加80ml 50％的葡萄糖和20ml无菌的重蒸馏水。
给该培养基补充1ml生物素(20mg/100ml)、60μg/l辅酶B12(7小时后)、0.1mM丙酸盐(22小时后)和痕量元素盐溶液。
在27小时后，通过离子色谱法(具有自动进样器的MetrohmCompact IC 761，流动相8mM NaOH；柱Dionex AS15 4×250mm+前置柱AG15 4×50mm；柱温25℃，流速1.4mL/分钟；检测器电导率；注射体积10μl；运行时间30分钟)在样品中可以检测到6mg/l的3-羟基异丁酸(图26)。通过增添化学纯的3-羟基异丁酸(30mg/l)来确认所得3-羟基异丁酸的身份(图27)。
5.将3-羟基异丁酸脱水成甲基丙烯酸 在搅拌下向5ml根据上面实施例4所产生的3-羟基异丁酸溶液(0.2g/L)中掺入NaOH(0.06mg)。在真空下(300托)于185-195℃在搅拌和回流冷凝下使该溶液进行温育。在5小时的时间段内，每小时再次添加在5mL中的0.5mg 3-羟基异丁酸。该溶液包含0.4重量％的对甲氧基苯酚，以防止甲基丙烯酸聚合。在温育24小时后，结束反应。3-羟基异丁酸向甲基丙烯酸的转化合计超过90％。通过蒸馏从该反应批料中分离出甲基丙烯酸。
实施例4 在实施例4中，借助于由这样的重组大肠杆菌细胞制备甲基丙烯酸来进一步阐明本发明，所述重组大肠杆菌细胞能够经由作为初产物的甲基丙二酸半醛和经由作为中间产物的丙烯酰辅酶A来形成3-羟基异丁酸。
为了用重组大肠杆菌细胞将C-源甘油转化为3-羟基异丁酸，将七种不同酶的基因克隆到一系列表达质粒中。为此，采用Duet载体(Merck，Deutschland)。这是具有四种表达载体的系统，这些表达载体都是彼此相容的，而且具有不同的抗生素抗性标记。
1.具体而言，为了将甘油转化为3-羟基异丁酸，将编码下列酶的基因克隆到表达载体中 a)来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶(EC 4.2.1.30)(GD)。该酶催化甘油的依赖于腺苷酰钴胺素的脱水而形成3-HPA(3-羟基丙醛)。它由3个亚基(GD-α、GD-β和GD-γ)组成，这些亚基在肺炎克雷伯氏菌中由处于一个操纵子中的3个基因(gldA、gldB和gldC)编码。
b)来自肺炎克雷伯氏菌的再活化因子。由于甘油使依赖于腺苷酰钴胺素的甘油脱水酶失活，因此为了将甘油转化为3-HPA，另外还需要再活化因子的活性。来自肺炎克雷伯氏菌的用于甘油脱水酶的再活化因子由基因gdrA和gdrB编码。
c)来自大肠杆菌的醛脱氢酶AldH。为了将3-HPA转化为3-羟基丙酸(3-HP)，扩增大肠杆菌aldH基因。
d)来自橙色绿屈挠菌的丙酰辅酶A合酶(Pcs)(由基因pcs编码)。丙酰辅酶A合酶催化3-HP转化为丙酰辅酶A。它为三功能酶，并且包含三个功能结构域。酰基辅酶A合成酶(ACS)结构域催化3-HP激活为3-羟基丙酰-CoA。在这之后，Pcs的烯酰-CoA水合酶(ECH)结构域催化脱水为丙烯酰-CoA。最后，Pcs的烯酰-CoA还原酶(ECR)结构域催化丙烯酰-CoA的依赖于NADPH的还原而形成丙酰-CoA。然而，该反应对于所描述的计划而言是不相关的，因为在此中间产物丙烯酰-CoA会立即进一步地被下一个酶(巴豆酰-CoA羧化酶/还原酶，见下文)转化。
e)来自类球红细菌的巴豆酰辅酶A羧化酶/还原酶(酶E62)(Ccr)(由基因ccR编码)。Ccr的主要活性是将巴豆酰辅酶A还原羧化酶乙基丙二酰-CoA。然而，该酶显示出宽的底物特异性，并非常有效地将丙烯酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A。
f)来自Sulfolobus tokodaii的丙二酰-CoA还原酶(Mcr，E，和E3)(由基因Mcr编码)。Mcr优先催化依赖于NADPH的丙二酰辅酶A的还原而形成丙二酸半醛。然而，它还显示出以甲基丙二酰辅酶A作为底物的副活性，并将其转化为甲基丙二酸半醛。
g)来自嗜热栖热菌的3-羟基异丁酸脱氢酶(E4)(3-HIB-DH)(由基因MmsB编码)。该酶催化甲基丙二酸半醛依赖于NADPH地可逆地转化为3-羟基异丁酸(3-HIB)。
2.在下文中详细地描述了用于上面所描述的酶的异源过表达的克隆策略。
a)用于过表达甘油脱水酶再活化因子(GDRF)的质粒pACYCDuet-KpGDRF的构建 首先，借助于PCR来扩增基因gdrA(异名ORF4)和gdrB(异名ORF2b)，它们编码肺炎克雷伯氏菌GDRF的两个亚基。使用肺炎克雷伯氏菌菌株DSM2026的染色体DNA作为模板。
使用下面的寡核苷酸来扩增gdrA orf4fw(SEQ ID NO26) 5′-TGAAGATCCTAGGAGGTTTAAACATATGCCGTTAATAGCCGGGATTG-3′ orf4Salrv(SEQ ID NO27) 5′-TATATAGTCGACTTAATTCGCCTGACCGGCCAG-3′ (SalI识别序列用下划线标出)。
使用下面的寡核苷酸来扩增gdrB orf2bPcifw(SEQ ID NO28) 5′-TATATAACATGTCGCTTTCACCGCCAGGC-3′ (PciI识别序列用下划线标出) orf2brv(SEQ ID NO29) 5′-CATATGTTTAAACCTCCTAGGATCTTCAGTTTCTCTCACTTAACGGCAGG-3′。
随后，将所获得的PCR产物通过交叉PCR(Crossover-PCR)而融合在一起。
为此，使用下面的寡核苷酸 orf2bNcofw(SEQ ID NO30) 5′-TATATACCATGGCGCTTTCACCGCCAGGC-3′ (NcoI识别序列用下划线标出) orf4Salrv(SEQ ID NO31) 5′-TATATAGTCGACTTAATTCGCCTGACCGGCCAG-3′ (SalI识别序列用下划线标出)。
根据制造商的说明书，借助于Qiagen，Hilden的QIAquick-PCR纯化试剂盒来纯化PCR产物(2220bp)，并连接到载体pCR-BluntII-TOPO中，从而获得pCR-BluntII-Topo-KpGDRF载体。根据制造商Invitrogen Corporation，Carlsbad(Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒)的说明书来进行连接以及随后转化到大肠杆菌细胞中。
然后，通过用PciI和SalI消化pCR-BluntII-Topo-KpGDRF而将GDRF序列从该载体中切出，并连接到用NcoI和SalI切割的pACYC-Duet表达载体中，从而获得pACYCDuet-KpGDRF(6142bp)。
b)用于过表达肺炎克雷伯氏菌甘油脱水酶(GD)和大肠杆菌醛脱氢酶aldH的质粒pAS50_Ec_aldH的构建 肺炎克雷伯氏菌GD的三个亚基天然地组织在一个操纵子中(基因gldA、gldB和gldC)。借助于PCR来扩增它们，其中仍使用肺炎克雷伯氏菌DSM2026的染色体DNA作为模板。
使用下面的寡核苷酸来进行扩增 KpGDNdefw(SEQ ID NO32) 5′-TATATACATATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTACTGG-3′ (NdeI识别序列用下划线标出) KpGDSalrv(SEQ ID NO33) 5′-TATATAGTCGACTTAGCTTCCTTTACGCAGCTTATGC-3′ (SalI识别序列用下划线标出)。
将扩增产物连接到载体pCR-BluntII-TOPO中，从而获得pCR-BluntII-Topo-KpGD载体。根据制造商Invitrogen Corporation，Carlsbad(Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒)的说明书来进行连接以及随后转化到大肠杆菌细胞中。
用XbaI(通过Klenow补平而使成为平端)和NdeI从载体pCR-BluntII-Topo-KpGD中切出GD编码片段，并连接到用NdeI和EcoRV切割的pET-Duet表达载体中，从而获得质粒pAS50(8161bp)。
随后，扩增大肠杆菌aldH基因。为此，使用大肠杆菌K12的染色体DNA作为模板，使用下列寡核苷酸作为PCR引物 1228_ald_fp(SEQ ID NO34) 5′-AAAACATATGAATTTTCATCATCTGGCTTACTGG-3′ (NdeI识别序列用下划线标出)，和 1228_ald_rp(SEQ ID NO35) 5′-AAAACATATGTATATTTCCTTCTTTCAGGCCTCCAGGCTTATCCAGATG-3′ (NdeI识别序列用下划线标出)。
在凝胶上来纯化PCR扩增产物，然后通过NdeI消化连接到质粒pAS50的NdeI位点中，从而获得质粒pAS50_Ec_aldH(9666bp)。
c)用于过表达橙色绿屈挠菌丙酰辅酶A合酶(Pcs)以及类球红细菌巴豆酰辅酶A羧化酶/还原酶(CCR)的质粒pCDFDuet-1_Rs_ccR_Cau_pcs的构建 为了在大肠杆菌中异源表达CCR以及纯化CCR，将所述基因克隆入表达载体pET3d中，从而获得质粒pTE13通过使用寡核苷酸ccr-fw(SEQ ID NO36) 5′-GGAGGCAACCATGGCCCTCGACGTGCAGAG-3′ (NcoI识别序列用下划线标出)，和 ccr-rev(SEQ ID NO37) 5′-GAGACTTGCGGATCCCTCCGATCAGGCCTTGC-3′ (BamHI识别序列用下划线标出) 经PCR来扩增类球红细菌ccr基因，其中使用类球红细菌菌株2.4.1(DSMZ 158)的染色体DNA作为模板。将该PCR产物作为NcoI/BamHI片段连接到用NcoI/BamHI切割的载体pET3d(Merck，Deutschland)中，从而获得质粒pTE13。
从pTE13中，将ccr基因作为NcoI/BamHI片段转克隆到质粒pCDFDuet-1(Merck，Deutschland)的NcoI/BamHI切割位点中，从而获得质粒pCDFDuet-1_Rs_ccr。
然后，用寡核苷酸 1228_Cau_pcs_fp(71)(SEQ ID NO38) 5′-AAAACATATGATCGACACTGCGCCCCTTGC-3′ (NdeI识别序列用下划线标出)，和 1228_Cau_pcs_rp(74)(SEQ ID NO39) 5′-AAGACGTCCTACCGCTCGCCGGCCGTCC-3′ (AatII识别序列用下划线标出) 通过PCR扩增出橙色绿屈挠菌pcs基因，其中使用橙色绿屈挠菌菌株OK-70-fl(DSM 636)的染色体DNA作为模板。在通过凝胶提取进行纯化后，通过NdeI/AatII消化将扩增产物连接到经相应切割的载体pCDFDuet-1_Rs_ccr中，从而获得质粒pCDFDuet-1_Rs_ccR_Cau_pcs(10472bp)。
d)用于过表达Sulfolobus tokodaii丙二酰-CoA还原酶(Mcr)以及嗜热栖热菌3-羟基异丁酸脱氢酶(3-HIB-DH)的质粒pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg的构建 首先，通过基因合成来制备在谷氨酸棒杆菌的密码子使用方面经适应调整的S.tokodaii基因mcr的变体(St_mcr_oCg)。在GeneArt公司(Deutschland)进行合成，并且以质粒pGA4_MMCoAR_ST(SEQ IDNO40)的形式提供人工基因St_mcr_oCg。使用pGA4_MMCoAR_ST DNA作为PCR模板，以便用寡核苷酸 1228_MMCoAR_fp(SEQ ID NO41) 5′-AACCATGGGCCGCACCCTGAAGG-3′ (NcoI识别序列用下划线标出)，和 1228_MMCoAR_rp(SEQ ID NO42) 5′-AAGGATCCTTACTTTTCGATGTAGCCCTTTTCC-3′ (BamHI识别序列用下划线标出) 来扩增人工基因St_mcr_oCg。在通过凝胶提取进行纯化后，用NcoI/BamHI消化扩增产物，并连接到质粒pCOLADuet_1(Merck，Deutschland)的相应切割位点中，从而获得质粒pCOLADuet_St_mcr_oCg。
同样地，通过基因合成(GeneArt，Deutschland)提供了在谷氨酸棒杆菌的密码子使用方面经适应调整的嗜热栖热菌基因MmsB(编码3-HIB-DH)的变体，即以质粒pGA4_3HIBDH_TT(SEQ ID NO43)的形式。
使用pGA4_3HIBDH_TT作为PCR模板，以便用寡核苷酸1228_Tth_HIBDH_fp(SEQ ID NO44) 5′-AAAACATATGGAAAAGGTGGCATTCATCG-3′ (NdeI识别序列用下划线标出)，和 1228_Tth_HIBDH_rp(SEQ ID NO45) 5′-AAAAGATCTTTAGCGGATTTCCACACCGCC-3′ (BglII识别序列用下划线标出) 来扩增人工基因Tth_HIBDH_oCg。在凝胶提取后，用NdeI/BglII切割扩增产物，并连接到质粒pCOLADuet_St_mcr_oCg的NdeI/BglII切割位点中，从而获得质粒pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg(5620bp)。
e)然后，根据制造商的方案，将4种质粒pACYCDuet-KpGDRF、pAS50_Ec_aldH、pCDFDuet-1_Rs_ccR_Cau_pcs和pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg共转化到商购可得的通过化学方法成为感受态的大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Merck，Deutschland)中。在补充有氨苄青霉素(25μg/ml)、氯霉素(17μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)和链霉素(25μg/ml)的LB琼脂上进行选择。
f)在大肠杆菌中表达质粒的诱导 将在上面e)中所描述的携带有质粒的大肠杆菌菌株在经修饰的M9培养基(6.8g/l Na2HPO4×2H2O；3g/l KH2PO4；0.5g/l NaCl；1g/l NH4Cl；1.25g/l酵母提取物；1％v/v甘油；15mg/l CaCl2×2H2O；250mg/l MgSO4×7H2O；1％v/v Gibco MEM维生素溶液；41.9g/l MOPE)中进行培养。该培养基补充有氨苄青霉素(25μg/ml)、氯霉素(17μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)和链霉素(25μg/ml)。于37℃在温控摇床上进行整个培养(预培养和主培养)。首先，将菌株在5ml培养基中培养过夜。然后，从过夜培养物中，以1∶20的比例将20ml培养基接种到100ml的带挡板的烧瓶(Schikanekolben)中，并继续进行培养。当达到大约0.8的OD600时，添加6μM钴胺素和1μM IPTG，并继续培养4小时。在该时间点，取出2.5ml细胞悬浮液，并贮存于-20℃直至进行分析。
g)借助于离子色谱法(IC)和电导率检测来进行3-HIB的检测和定量。为此，在室温下解冻2.5ml的样品，并离心(10分钟，13,200rpm)。使用喷雾过滤器(Sprttzenfilter)(孔径大小0.44μm)来纯化上清液。用具有自动进样器的Metrohm Compact IC 761进行测量。流动相8mM NaOH。柱Dionex AS15 4×250mm，前置柱AG154×50mm。柱温25℃。流速1.4ml/分钟。注射体积10μl。
h)将3-羟基异丁酸脱水成甲基丙烯酸 在搅拌下向5ml浓缩的3-羟基异丁酸溶液(根据上面的在f)中所描述的方法而产生的)(0.2g/L)中掺入NaOH(0.06mg)。在真空下(300托)于185-195℃在搅拌和回流冷凝下使该溶液进行温育。在5小时的时间段内，每小时再次添加在5mL中的0.5mg 3-羟基异丁酸。该溶液包含0.4重量％的对甲氧基苯酚，以防止甲基丙烯酸聚合。在温育24小时后，结束反应。3-羟基异丁酸向甲基丙烯酸的转化合计超过90％。通过蒸馏从该反应批料中分离出甲基丙烯酸。
序列表
<110>Evonik Degussa GmbH
<120>用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法
<130>2008P00165WO
<160>45
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>2214
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
<400>1
atgacgtcga tccctaattt ttcagacatc ccattgactg ctgagacacg tgcatcggag 60
tcacacaacg ttgacgccgg caaggtgtgg aacactcccg aaggcattga tgtcaagcgc120
gtattcacgc aggctgaccg cgacgaggcg caagcggcgg gacatccggt ggattctttg180
ccaggtcaaa agccatttat gcgcgggccg tacccaacta tgtacaccaa tcagccgtgg240
acgattcgcc agtacgcagg cttttcaacc gccgcggaat ccaatgcgtt ttatcggagg300
aaccttgctg cgggtcaaaa aggtttgtcg gttgcgttcg atctagcgac ccaccgcggt360
tatgactcgg ataatgagcg cgtggtcggc gatgtgggta tggccggcgt ggcgattgat420
tcgattttgg atatgcgtca gctgtttgat ggcattgatt tgtccagcgt gtcggtgtcg480
atgaccatga atggcgctgt gctgccgatt cttgcgttct atatcgtggc ggctgaggaa540
caaggtgtgg gtccggagca gcttgcgggc acgatccaga atgacatctt gaaagaattt600
atggtgcgca acacctatat ttatccgccg aagccgtcga tgcgcatcat ttccaacatc660
tttgagtaca cctccttgaa gatgccacgt tttaactcca tttcgatttc tggctatcac720
atccaggaag cgggagcgac tgccgatttg gagctggcct acactctggc ggatggtatt780
gaatacatcc gtgcaggtaa agaggtaggc cttgacgtgg ataagttcgc gcctcgtctg 840
tccttcttct ggggtatttc tatgtacacc ttcatggaga tcgcaaagct gcgtgcggga 900
cgactgctgt ggagcgagtt ggtggcaaaa ttcgatccga aaaacgccaa gtcccagtcg 960
ctgcgcacgc actcgcagac ctctggttgg tcgttgaccg cgcaggatgt gtacaacaac1020
gtcgcccgca ccgcgattga ggcgatggct gcaacccagg gccacaccca gtcgctgcac1080
accaatgcac ttgatgaggc gttggcgctg cccaccgatt tctctgctcg tatcgcccga1140
aacacccagc tgttgctgca gcaggaatct ggcacggtgc gtccagttga tccatgggcg1200
ggctcctatt acgtggagtg gttgaccaat gagctggcta accgcgcgcg caagcacatc1260
gatgaggtgg aggaagccgg cggaatggcg caggccaccg cgcagggaat tcctaagctg1320
cgcattgagg aatcagcggc acgcacccag gctcgcattg attccggccg ccaggcgctg1380
atcggcgtga atcgctacgt ggcggaagaa gatgaggaaa ttgaagtcct caaggttgac1440
aacaccaagg ttcgcgcaga acagttggct aaactcgcgc aactgaaagc agagcgcaac1500
gatgcggaag tcaaggctgc gctggatgcg ttgacagctg ctgcccgcaa cgagcataaa1560
gagccagggg atttggatca gaacctgctc aaacttgccg tcgatgctgc gcgcgcaaaa1620
gctaccattg gagagatctc cgatgctttg gaagttgtct ttggccgcca cgaagcagaa1680
atcaggacgc tgtctggcgt gtacaaggat gaggttggaa aggaaggcac agtgagcaac1740
gtcgaacgcg cgatcgccct ggctgacgcc tttgaggctg aggaaggccg ccgcccacgt1800
atctttattg ccaagatggg ccaggatgga catgaccgtg gacagaaggt tgtcgcgtct1860
gcctatgctg acctgggcat ggacgtggat gttggaccgc tgtttcaaac tccagccgaa1920
gctgcccgcg ccgccgtgga cgccgatgtt cacgtggtgg gtatgtcttc gctggcagca1980
ggccacctca ccttgctgcc cgagctgaag aaagaacttg cagctcttgg ccgcgatgac2040
attctggtca ccgtgggcgg cgtcattccg ccgggcgatt tccaggatct ctacgatatg2100
ggtgccgccg cgatttaccc tccaggaacc gtcatcgcgg agtcggcgat cgatctgatc 2160
acccgactcg ccgcacacct gggctttgac ctggatgtgg atgtgaatga gtga2214
<210>2
<211>737
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
<400>2
Met Thr Ser Ile Pro Asn Phe Ser Asp Ile Pro Leu Thr Ala Glu Thr
1 5 10 15
Arg Ala Ser Glu Ser His Asn Val Asp Ala Gly Lys Val Trp Asn Thr
20 25 30
Pro Glu Gly Ile Asp Val Lys Arg Val Phe Thr Gln Ala Asp Arg Asp
35 40 45
Glu Ala Gln Ala Ala Gly His Pro Val Asp Ser Leu Pro Gly Gln Lys
50 55 60
Pro Phe Met Arg Gly Pro Tyr Pro Thr Met Tyr Thr Asn Gln Pro Trp
65 70 75 80
Thr Ile Arg Gln Tyr Ala Gly Phe Ser Thr Ala Ala Glu Ser Asn Ala
85 90 95
Phe Tyr Arg Arg Asn Leu Ala Ala Gly Gln Lys Gly Leu Ser Val Ala
100 105 110
Phe Asp Leu Ala Thr His Arg Gly Tyr Asp Ser Asp Asn Glu Arg Val
115 120 125
Val Gly Asp Val Gly Met Ala Gly Val Ala Ile Asp Ser Ile Leu Asp
130 135 140
Met Arg Gln Leu Phe Asp Gly Ile Asp Leu Ser Ser Val Ser Val Ser
145 150 155 160
Met Thr Met Asn Gly Ala Val Leu Pro Ile Leu Ala Phe Tyr Ile Val
165 170 175
Ala Ala Glu Glu Gln Gly Val Gly Pro Glu Gln Leu Ala Gly Thr Ile
180 185 190
Gln Asn Asp Ile Leu Lys Glu Phe Met Val Arg Asn Thr Tyr Ile Tyr
195 200 205
Pro Pro Lys Pro Ser Met Arg Ile Ile Ser Asn Ile Phe Glu Tyr Thr
210 215 220
Ser Leu Lys Met Pro Arg Phe Asn Ser Ile Ser Ile Ser Gly Tyr His
225 230 235 240
Ile Gln Glu Ala Gly Ala Thr Ala Asp Leu Glu Leu Ala Tyr Thr Leu
245 250 255
Ala Asp Gly Ile Glu Tyr Ile Arg Ala Gly Lys Glu Val Gly Leu Asp
260 265 270
Val Asp Lys Phe Ala Pro Arg Leu Ser Phe Phe Trp Gly Ile Ser Met
275 280 285
Tyr Thr Phe Met Glu Ile Ala Lys Leu Arg Ala Gly Arg Leu Leu Trp
290 295 300
Ser Glu Leu Val Ala Lys Phe Asp Pro Lys Asn Ala Lys Ser Gln Ser
305 310 315 320
Leu Arg Thr His Ser Gln Thr Ser Gly Trp Ser Leu Thr Ala Gln Asp
325 330 335
Val Tyr Asn Asn Val Ala Arg Thr Ala Ile Glu Ala Met Ala Ala Thr
340 345 350
Gln Gly His Thr Gln Ser Leu His Thr Asn Ala Leu Asp Glu Ala Leu
355 360 365
Ala Leu Pro Thr Asp Phe Ser Ala Arg Ile Ala Arg Asn Thr Gln Leu
370 375 380
Leu Leu Gln Gln Glu Ser Gly Thr Val Arg Pro Val Asp Pro Trp Ala
385 390 395 400
Gly Ser Tyr Tyr Val Glu Trp Leu Thr Asn Glu Leu Ala Asn Arg Ala
405 410 415
Arg Lys His Ile Asp Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Met Ala Gln Ala
420 425 430
Thr Ala Gln Gly Ile Pro Lys Leu Arg Ile Glu Glu Ser Ala Ala Arg
435 440 445
Thr Gln Ala Arg Ile Asp Ser Gly Arg Gln Ala Leu Ile Gly Val Asn
450 455 460
Arg Tyr Val Ala Glu Glu Asp Glu Glu Ile Glu Val Leu Lys Val Asp
465 470 475 480
Asn Thr Lys Val Arg Ala Glu Gln Leu Ala Lys Leu Ala Gln Leu Lys
485 490 495
Ala Glu Arg Asn Asp Ala Glu Val Lys Ala Ala Leu Asp Ala Leu Thr
500 505 510
Ala Ala Ala Arg Asn Glu His Lys Glu Pro Gly Asp Leu Asp Gln Asn
515 520 525
Leu Leu Lys Leu Ala Val Asp Ala Ala Arg Ala Lys Ala Thr Ile Gly
530 535 540
Glu Ile Ser Asp Ala Leu Glu Val Val Phe Gly Arg His Glu Ala Glu
545 550 555 560
Ile Arg Thr Leu Ser Gly Val Tyr Lys Asp Glu Val Gly Lys Glu Gly
565 570 575
Thr Val Ser Asn Val Glu Arg Ala Ile Ala Leu Ala Asp Ala Phe Glu
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Arg Arg Pro Arg Ile Phe Ile Ala Lys Met Gly Gln
595 600 605
Asp Gly His Asp Arg Gly Gln Lys Val Val Ala Ser Ala Tyr Ala Asp
610 615 620
Leu Gly Met Asp Val Asp Val Gly Pro Leu Phe Gln Thr Pro Ala Glu
625 630 635 640
Ala Ala Arg Ala Ala Val Asp Ala Asp Val His Val Val Gly Met Ser
645 650 655
Ser Leu Ala Ala Gly His Leu Thr Leu Leu Pro Glu Leu Lys Lys Glu
660 665 670
Leu Ala Ala Leu Gly Arg Asp Asp Ile Leu Val Thr Val Gly Gly Val
675 680 685
Ile Pro Pro Gly Asp Phe Gln Asp Leu Tyr Asp Met Gly Ala Ala Ala
690 695 700
Ile Tyr Pro Pro Gly Thr Val Ile Ala Glu Ser Ala Ile Asp Leu Ile
705 710 715 720
Thr Arg Leu Ala Ala His Leu Gly Phe Asp Leu Asp Val Asp Val Asn
725 730 735
Glu
<210>3
<211>1071
<212>DNA
<213>Sulfolobus tokodaii
<400>3
atgaggagaa cattaaaagc cgcaatatta ggtgctactg gtttagtagg aatcgaatac 60
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gtgggtaaac cgtatggtga ggtagtaaga tggcaaacag taggacaagt tcctaaggaa180
atagctgata tggaaataaa accaactgat cctaagttaa tggatgatgt agacataata240
ttttctccat tacctcaagg tgctgctggc ccagtagaag aacaatttgc aaaagaagga300
ttccctgtga ttagtaattc accagatcat agatttgatc ctgatgttcc cttattggtt360
cctgaactaa atcctcatac tattagctta attgatgagc aaagaaaaag aagagaatgg420
aaaggattta tagtaactac accactatgc acagcccagg gtgcagcaat accattaggt 480
gctatattta aagattataa gatggatgga gcatttataa ctactattca atcgctatct 540
ggtgccggtt atccaggaat accatcatta gatgtagtag ataatatctt gcctttaggt 600
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aaagttaagg agactttaga aaactttaga ggggaaccac aagatctaaa attaccaact 840
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aagagaatga taaggttagt atcattaatt cataacacgg tcagaggagc cgcaggagga1020
ggtatattag cagctgaatt acttgtcgaa aaaggatata ttgaaaagta a 1071
<210>4
<211>356
<212>PRT
<213>Sulfolobus tokodaii
<400>4
Met Arg Arg Thr Leu Lys Ala Ala Ile Leu Gly Ala Thr Gly Leu Val
1 5 10 15
Gly Ile Glu Tyr Val Arg Met Leu Ser Asn His Pro Tyr Ile Lys Pro
20 25 30
Ala Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Ser Val Gly Lys Pro Tyr Gly Glu Val
35 40 45
Val Arg Trp Gln Thr Val Gly Gln Val Pro Lys Glu Ile Ala Asp Met
50 55 60
Glu Ile Lys Pro Thr Asp Pro Lys Leu Met Asp Asp Val Asp Ile Ile
65 70 75 80
Phe Ser Pro Leu Pro Gln Gly Ala Ala Gly Pro Val Glu Glu Gln Phe
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Phe Pro Val Ile Ser Asn Ser Pro Asp His Arg Phe
100 105 110
Asp Pro Asp Val Pro Leu Leu Val Pro Glu Leu Asn Pro His Thr Ile
115 120 125
Ser Leu Ile Asp Glu Gln Arg Lys Arg Arg Glu Trp Lys Gly Phe Ile
130 135 140
Val Thr Thr Pro Leu Cys Thr Ala Gln Gly Ala Ala Ile Pro Leu Gly
145 150 155 160
Ala Ile Phe Lys Asp Tyr Lys Met Asp Gly Ala Phe Ile Thr Thr Ile
165 170 175
Gln Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Leu Asp Val
180 185 190
Val Asp Asn Ile Leu Pro Leu Gly Asp Gly Tyr Asp Ala Lys Thr Ile
195 200 205
Lys Glu Ile Phe Arg Ile Leu Ser Glu Val Lys Arg Asn Val Asp Glu
210 215 220
Pro Lys Leu Glu Asp Val Ser Leu Ala Ala Thr Thr His Arg Ile Ala
225 230 235 240
Thr Ile His Gly His Tyr Glu Val Leu Tyr Val Ser Phe Lys Glu Glu
245 250 255
Thr Ala Ala Glu Lys Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Phe Arg Gly Glu
260 265 270
Pro Gln Asp Leu Lys Leu Pro Thr Ala Pro Ser Lys Pro Ile Ile Val
275 280 285
Met Asn Glu Asp Thr Arg Pro Gln Val Tyr Phe Asp Arg Trp Ala Gly
290 295 300
Asp Ile Pro Gly Met Ser Val Val Val Gly Arg Leu Lys Gln Val Asn
305 310 315 320
Lys Arg Met Ile Arg Leu Val Ser Leu Ile His Asn Thr Val Arg Gly
325 330 335
Ala Ala Gly Gly Gly Ile Leu Ala Ala Glu Leu Leu Val Glu Lys Gly
340 345 350
Tyr Ile Glu Lys
355
<210>5
<211>1293
<212>DNA
<213>类球红细菌
<400>5
atggccctcg acgtgcagag cgatatcgtc gcctacgacg cgcccaagaa ggacctctac 60
gagatcggcg agatgccgcc tctcggccat gtgccgaagg agatgtatgc ttgggccatc120
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<210>6
<211>430
<212>PRT
<213>类球红细菌
<400>6
Met Ala Leu Asp Val Gln Ser Asp Ile Val Ala Tyr Asp Ala Pro Lys
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Ser Phe Ala Gln Phe Thr Arg Val Gln Ala Gln Gln Leu Met Lys
165 170 175
Arg Pro Lys His Leu Thr Trp Glu Glu Ala Ala Cys Tyr Thr Leu Thr
180 185 190
Leu Ala Thr Ala Tyr Arg Met Leu Phe Gly His Lys Pro His Asp Leu
195 200 205
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210 215 220
Ser Tyr Ala Ile Gln Leu Ile Asn Thr Ala Gly Ala Asn Ala Ile Gly
225 230 235 240
Val Ile Ser Glu Glu Asp Lys Arg Asp Phe Val Met Gly Leu Gly Ala
245 250 255
Lys Gly Val Ile Asn Arg Lys Asp Phe Lys Cys Trp Gly Gln Leu Pro
260 265 270
Lys Val Asn Ser Pro Glu Tyr Asn Glu Trp Leu Lys Glu Ala Arg Lys
275 280 285
Phe Gly Lys Ala Ile Trp Asp Ile Thr Gly Lys Gly Ile Asn Val Asp
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Phe Asn Cys Thr Phe Asp Val Arg Tyr Met Trp Met His Gln Lys Arg
340 345 350
Leu Gln Gly Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gln Ala Ser Ala Ala Asn
355 360 365
Gln Leu Met Ile Glu Arg Arg Leu Asp Pro Cys Met Ser Glu Val Phe
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Leu Arg Thr Phe Ala Asp Val Leu Glu Ala Gly Arg Lys Ala
420 425 430
<210>7
<211>1233
<212>DNA
<213>铜绿假单胞菌
<400>7
atgagtgatt acgagccgtt gcgtctgcat gtcccggagc ccaccgggcg tcctggctgc 60
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<210>8
<211>1049
<212>DNA
<213>铜绿假单胞菌
<400>8
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<210>9
<211>924
<212>DNA
<213>铜绿假单胞菌
<400>9
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gacgcgacca cgcacgtgct gacccatacc ctgcactatg gaatgggcgt gttcgagggc120
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cggctgttcg actccgcgca catcatgaac atgcagatcc cgtacagccg cgacgagatc240
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tccaacggcg cctacatcaa ctcgatgctg gccctccagg aagcgatctc cggcggcgcc 540
gacgaggcca tgatgctcga tccggaaggc tacgtggccg aaggctccgg cgagaacatc 600
ttcatcatca aggatggcgt gatctacacc ccggaagtca ccgcctgcct gaacggcatc 660
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atcacccgcg acgaggtgta catcgccgac gaggccttct tcactggcac tgccgcggaa 780
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gagtggcgta ccctggtcaa gtaa 924
<210>10
<211>1128
<212>DNA
<213>乙酸钙不动杆菌
<400>10
atgcaattta atgaagaaca gctattaatt caggatatgg cgaaaagttt tgccaatgaa 60
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tcccaaatgg ggcaattggg ttttatggga atgctggtga gtgagaaatg gggcggatca 180
aatacaggaa atttagctta tgtgctggca cttgaagaaa tcgctgccgc agatggtgcg 240
acttcaacca ttatgagtgt acataattct gttggctgtg tacccattgc taaatttggt 300
acagaggagc aaaagcagaa atatctagtg cctttagcac aaggtgaaat gatcggtgca 360
tttgctttaa cggaaccaca tacaggttcc gatgccgcag ccattaaaac ccgagcaatt 420
aaacaaggtg atgaatggat tattaatggc gctaaacaat ttataacatc aggtcataat 480
gcgggcgtga ttattgtatt tgctgtgaca gatccgaatg cagggaaaaa agggctgagt 540
gcatttattg tgccgcgtga aaccttgggt tatgaggtga ttcgcaccga agaaaaattg 600
ggtttacatg cgtcagatac gtgccaaatt gctttaacgg atgttcgagt acatcacagc 660
ttaatgcttg gtcaggaagg tgagggacta aaaatagcat tgtctaatct ggaaggtggc 720
cgtattggga ttgcagcgca agccgttggt ttggcacgtg ctgcactaga agaagcgaca 780
aaatatgcca aagagcgtgt gacctttgga aagcctattt ttgagcatca ggcgttagcc 840
tttcgtttag ccagtatggc cacagaaatt gaagcagcac gacaattggt tcattacgca 900
gcgcggctta aagaagctgg aaaaccttgt ttaaatgaag catcaatggc gaaattattt 960
tcatctgaaa tggtcgaacg cgtatgttct gctgctttgc aaatctttgg tggctatggc 1020
tatttaaaag actttcccat cgagcgaatt tatcgtgatg cacgtatttg ccagatttat 1080
gaaggtacaa gtgatattca gcgtttagtg atagcaagaa gcctataa 1128
<210>11
<211>774
<212>DNA
<213>乙酸钙不动杆菌
<400>11
atgacattcg caacaatttt attggaaaaa cgtaagggtg tgggcttgat tacacttaac 60
cgtccaaaag cattaaatgc tttaaactca gaattaattt atgaaataaa tttagcctta 120
gacgatttag aaaatgatca aacgattggt tgtatcgtcc ttacaggttc agaaaaagcc 180
tttgccgcag gtgcggatat caaagaaatg gcagaattaa cttttccaaa tatttatttt 240
gatgattttt ttagtcttgc agatcgtatt gcacagcgtc gtaagccttt aattgccgca 300
gtgagtggtt atgctttagg tggtggctgt gagttagcac tcatgtgtga ctttatttat 360
tgtgccgaca atgccaagtt tgcactacca gaagtaactt taggtgtcat tcctggtatt 420
ggtggaacac agcgtctaac gcttgcaata ggcaaagcca aagccatgga aatgtgtttg 480
actgcacggc aaatgcaggc tgctgaggca gaacaaagtg gtttggtggc acgcgttttt 540
agtaaagaag aacttttaga acaaacctta caggctgccg aaaaaatagc ggaaaaatca 600
cgggtatcta ccataatgat taaagagtca attaatcgag cttttgaagt gagtttagca 660
gagggtttac gttttgagcg ccgaatgttc cattcagttt ttgcgacctt agatcagaaa 720
gaaggcatgc aagcatttat tgataaacgt ccagcccaat ttaaacatca ataa774
<210>12
<211>1029
<212>DNA
<213>乙酸钙不动杆菌
<400>12
atgactacta ctgacaatca tttactcatt gaacataaaa acgctttagg aacaattatt 60
ttaaatcgtc cagcgagtct gaacgcgcta tctctagaaa tgattaatgc gattcgtcaa 120
caagttgagg attggcaagg tgatgtaaat gttcaggcca tattaattaa atcaaatagt 180
cctaaagcat tttgtgcagg tggtgatatt cgctatcttt atgaaagtta taaaagtgga 240
tcagaagagt ataaagatta tttcattgct gaatatgaga tgctcaatag cattcgaacg 300
tctaaaaaaa cagtgattgt tttattggat ggatatgtat tgggtggtgg ttttggttta 360
gcacaggctt gtcatatctt ggtgagtagt gaaaaatcac gattttcaat gccagaaaca 420
gcaataggtt ttttcccaga tgttgcagcg acttatttct tatctcgttt agatgatgtt 480
ggggtatatt tggcactgac tggtgatcaa atcagtagta gtgatgcatt gtatttagat 540
ctgattgatt atcatgttcc gagtcagaat tttgagcgac tagaaaatgc attcagccaa 600
tcacagaact tagataaatt tcatattcag aagattattt ctgcttatat ctccagccct 660
gttcagagtg aactcagtct atggcttgaa gccattcgtc agcattttgg tcttaaaaat720
gtgcaagata tcgaagaaag tttgaaaaat gaacaagatc ccaactatca agtatggaca780
agtaaagtgt taaatacttt gcaacaacgt tcctctattg caaaaaaaac cagtttaaag840
ttacagctgc tagggcgtgg atggtcatta cagcaatgta tgcgtatcga gcgaaaatta900
caggatatct ggtttgaaca tggtgatatg attgagggtg ttcgagcgtt gattattgat960
aaagataaac aaccgcaatg gcagcagcat aatgcgactt tagataatat attaggccaa 1020
ttaggttag 1029
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
atgcaattta atgaagaaca gctattaatt c 31
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
cagtctgaaa tgactaacct aattggc 27
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
acggaattct gaaggagctg gcaactatg 29
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
ttgtcgactt acttgaccag ggtacgcc 28
<210>17
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
acagatctgg aggcctgtca tgagtgatta c 31
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
atgggtaccc attcagacct ccatc 25
<210>19
<211>6960
<212>DNA
<213>人工的
<220>
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gcgtgttcga gggcgtgcgc gcctacgaca ccccgcaggg cacggcgatc ttccgcctgc 300
aggcgcatac cgaccggctg ttcgactccg cgcacatcat gaacatgcag atcccgtaca 360
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ccgaggccca cgccgagtgg cgtaccctgg tcaagtaagt cgacaagctt gcggccgcat1080
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cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc catcttagta tattagttaa1200
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<223>新质粒
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ggtcgtcatc tacctgcctg gacagcatgg cctgcaacgc gggcatcccg atgccgccgg7080
aagcgagaag aatcataatg gggaaggcca tccagcctcg cgtcgcgaac gccagcaaga7140
cgtagcccag cgcgtcggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt7200
tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa7260
gcgacaggcc gatcatcgtc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga7320
gcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga7380
cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca7440
tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac7500
tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg7560
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg7620
ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg7680
ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat7740
gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg7800
gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca7860
gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc7920
cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag7980
ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc8040
tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa8100
ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg8160
caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca8220
ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt 8280
tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg 8340
acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac 8400
tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc 8460
gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa 8520
acggtctgat aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca 8580
ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg 8640
cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa 8700
gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatg 8757
<210>21
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
attatcccat ggggagaaca ttaaaagc28
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
cgggatcctt acttttcaat atat24
<210>23
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
cggtcgacaa ggagatatag atatgactga tctcacaaag actgc 45
<210>24
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
cttaggcttt gtcgaacgcc tcc 23
<210>25
<211>870
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>新载体
<400>25
atggaaaagg tggcattcat cggcctgggc gcaatgggct acccaatggc aggtcacctg 60
gctcgccgct tcccaaccct ggtgtggaac cgcaccttcg aaaaggcact gcgccaccag 120
gaagagttcg gctccgaagc agtgccactg gaacgcgtgg ctgaagcacg cgtgatcttc 180
acctgcctgc caaccacccg cgaagtgtac gaagtggcag aagcactgta cccatacctg 240
cgcgaaggca cctactgggt ggatgcaacc tccggcgaac cagaagcatc ccgccgcctg 300
gctgaacgcc tgcgcgaaaa gggcgtgacc tacctggatg caccagtgtc cggtggcacc 360
tccggtgcag aagcaggcac cctgaccgtt atgctgggcg gtccagaaga agcagtcgaa 420
cgcgtccgcc cattcctggc ctacgcaaag aaggtggtcc acgtcggccc agttggtgca 480
ggccacgcag tgaaggcaat caacaacgca ctgctggccg tgaacctgtg ggcagcaggc 540
gaaggtctgc tggccctggt gaagcagggc gtgtccgcag aaaaggccct ggaagtgatc 600
aacgcatcct ccggccgctc caacgcaacc gaaaacctga tcccacagcg cgttctgacc 660
cgcgcattcc caaagacctt cgcactgggc ctgctggtga aggatctggg catcgcaatg 720
ggcgtgctgg atggcgaaaa ggcaccatcc ccactgctgc gcctggctcg cgaagtctac 780
gagatggcaa agcgcgaact cggcccagat gcagatcacg tggaagcact gcgcctgctc 840
gaacgctggg gcggtgtgga aatccgctaa 870
<210>26
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
tgaagatcct aggaggttta aacatatgcc gttaatagcc gggattg 47
<210>27
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
tatatagtcg acttaattcg cctgaccggc cag 33
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
tatataacat gtcgctttca ccgccaggc29
<210>29
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
catatgttta aacctcctag gatcttcagt ttctctcact taacggcagg 50
<210>30
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
tatataccat ggcgctttca ccgccaggc29
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
tatatagtcg acttaattcg cctgaccggc cag 33
<210>32
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
tatatacata tgaaaagatc aaaacgattt gcagtactgg40
<210>33
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
tatatagtcg acttagcttc ctttacgcag cttatgc 37
<210>34
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
aaaacatatg aattttcatc atctggctta ctgg 34
<210>35
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
aaaacatatg tatatttcct tctttcaggc ctccaggctt atccagatg49
<210>36
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
ggaggcaacc atggccctcg acgtgcagag 30
<210>37
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
gagacttgcg gatccctccg atcaggcctt gc 32
<210>38
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
aaaacatatg atcgacactg cgccccttgc 30
<210>39
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
aagacgtcct accgctcgcc ggccgtcc28
<210>40
<211>3967
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>新质粒
<400>40
atgcgccgca ccctgaaggc agcaatcctg ggcgccaccg gcctggtggg catcgaatac 60
gtgcgcatgc tgtccaacca cccatacatc aagccagcat acctggccgg caagggctcc 120
gttggcaagc catacggcga agtggtgcgc tggcagaccg tgggccaggt gccaaaggaa 180
atcgcagata tggaaatcaa gccaaccgat ccaaagctga tggatgatgt ggatatcatc 240
ttctccccac tgccacaggg tgcagcaggc ccagtggaag aacagttcgc aaaggaaggc 300
ttcccagtga tctccaactc cccagatcac cgcttcgatc cagatgtgcc actgctggtg 360
ccagaactca acccacacac catctccctg atcgatgaac agcgcaagcg ccgcgaatgg 420
aagggcttca tcgtgaccac cccactgtgc accgcacagg gcgcagcaat cccactgggc 480
gcaatcttca aggattacaa gatggatggc gcattcatca ccaccatcca gtccctgtcc 540
ggcgcaggct acccaggtat cccatccctg gatgtggtgg ataacatcct gccactgggc 600
gatggctacg atgcaaagac catcaaggaa atcttccgca tcctgtccga agtgaagcgc 660
aacgtggatg aaccaaagct ggaagatgtg tccctggccg caaccaccca ccgcatcgca 720
accatccacg gccactacga agtgctgtac gtgtccttca aggaagaaac cgcagcagaa 780
aaggtgaagg aaaccctgga aaacttccgc ggcgaaccac aggatctgaa gctgccaacc 840
gcaccatcca agccaatcat cgtgatgaac gaagataccc gcccacaggt gtacttcgat 900
cgctgggcag gcgatatccc aggcatgtcc gtggtggtgg gccgcctgaa gcaggtgaac 960
aagcgcatga tccgcctggt gtccctgatc cacaacaccg ttcgcggcgc agcaggtggt1020
ggtatcctgg ccgcagaact cctggtggaa aagggctaca tcgaaaagta agaattccgc1080
gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg cgcttggcgt aatcatggtc1140
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg1200
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt1260
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg1320
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga1380
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat1440
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca1500
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc1560
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata1620
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc1680
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc1740
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga1800
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc1860
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag1920
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag1980
aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag2040
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca2100
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga2160
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat2220
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga2280
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg2340
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga2400
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gaaccacgct caccggctcc2460
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac2520
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc2580
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc2640
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc2700
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt2760
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc2820
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg2880
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag2940
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat3000
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc3060
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa3120
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta3180
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa3240
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccaccta aattgtaagc3300
gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa3360
taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt3420
gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg3480
cgaaaaaccg tctatcaggg ctatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt3540
ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga3600
gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg3660
ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg3720
cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa3780
gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca3840
aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc3900
agtgagcgcg cgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg gtaccgcgga tccaaggaga3960
tatagat 3967
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
aaccatgggc cgcaccctga agg23
<210>42
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
aaggatcctt acttttcgat gtagcccttt tcc33
<210>43
<211>3766
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>新质粒
<400>43
atggaaaagg tggcattcat cggcctgggc gcaatgggct acccaatggc aggtcacctg 60
gctcgccgct tcccaaccct ggtgtggaac cgcaccttcg aaaaggcact gcgccaccag 120
gaagagttcg gctccgaagc agtgccactg gaacgcgtgg ctgaagcacg cgtgatcttc 180
acctgcctgc caaccacccg cgaagtgtac gaagtggcag aagcactgta cccatacctg 240
cgcgaaggca cctactgggt ggatgcaacc tccggcgaac cagaagcatc ccgccgcctg 300
gctgaacgcc tgcgcgaaaa gggcgtgacc tacctggatg caccagtgtc cggtggcacc 360
tccggtgcag aagcaggcac cctgaccgtt atgctgggcg gtccagaaga agcagtcgaa 420
cgcgtccgcc cattcctggc ctacgcaaag aaggtggtcc acgtcggccc agttggtgca 480
ggccacgcag tgaaggcaat caacaacgca ctgctggccg tgaacctgtg ggcagcaggc 540
gaaggtctgc tggccctggt gaagcagggc gtgtccgcag aaaaggccct ggaagtgatc 600
aacgcatcct ccggccgctc caacgcaacc gaaaacctga tcccacagcg cgttctgacc 660
cgcgcattcc caaagacctt cgcactgggc ctgctggtga aggatctggg catcgcaatg 720
ggcgtgctgg atggcgaaaa ggcaccatcc ccactgctgc gcctggctcg cgaagtctac 780
gagatggcaa agcgcgaact cggcccagat gcagatcacg tggaagcact gcgcctgctc 840
gaacgctggg gcggtgtgga aatccgctaa gaattccgcg agctccagct tttgttccct 900
ttagtgaggg ttaattgcgc gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 960
ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg1020
gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca1080
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tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg1200
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg1260
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa1320
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg1380
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tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc1500
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc1560
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg1620
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc1680
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga1740
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc1800
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac1860
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg1920
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc1980
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa2040
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta2100
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt2160
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag2220
tgctgcaatg ataccgcgag aaccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca2280
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc2340
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt2400
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag2460
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt2520
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat2580
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt2640
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc2700
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat2760
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag2820
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt2880
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg2940
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta3000
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc3060
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc3120
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc3180
ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag3240
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc3300
tatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa3360
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg3420
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt3480
gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 3540
gcgtcccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 3600
tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 3660
ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgagcgcgc gtaatacgac 3720
tcactatagg gcgaattggg taccgcggat ccaaggagat atagat 3766
<210>44
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
aaaacatatg gaaaaggtgg cattcatcg29
<210>45
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
aaaagatctt tagcggattt ccacaccgcc 30
权利要求
1.用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法，其包括下列步骤
IA)通过包括下述步骤的方法来制备3-羟基异丁酸，即在从碳源形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的条件下，使细胞与包含碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲烷、甲醇、L-缬氨酸或L-谷氨酸作为碳源的培养基相接触，所述细胞相对于其野生型而言如此地经基因工程改造，从而与其野生型相比，它能够形成更多的3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸；任选地，从培养基中纯化出3-羟基异丁酸；以及任选地，中和3-羟基异丁酸，
IB)使3-羟基异丁酸脱水从而形成甲基丙烯酸；以及任选地，使甲基丙烯酸酯化。
2.根据权利要求1的方法，其中3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为初产物的甲基丙二酸半醛来实现。
3.根据权利要求2的方法，其中所述细胞能够经由作为中间产物的琥珀酰辅酶A来形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸。
4.根据权利要求3的方法，其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的酶E1的活性，所述酶E1催化琥珀酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A。
5.根据权利要求4的方法，其中所述酶E1为甲基丙二酰辅酶A变位酶(EC 5.4.99.2)。
6.根据权利要求3至5中之一的方法，其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4中至少一种酶的活性
-酶E2，其催化甲基丙二酰辅酶A转化为甲基丙二酸；
-酶E3，其催化甲基丙二酸转化为甲基丙二酸半醛；
-酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
7.根据权利要求6的方法，其中，
酶E2为甲基丙二酰辅酶A水解酶(EC 3.2.1.17)，
酶E3为醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)或醛氧化酶(EC 1.2.3.1)，和
酶E4为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
8.根据权利要求3至5中之一的方法，其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4、E5、E6和E7中至少一种酶的活性
-酶E6，其催化(R)-甲基丙二酰辅酶A转化为(S)-甲基丙二酰辅酶A；
-酶E7，其催化(S)-甲基丙二酰辅酶A转化为丙酰辅酶A；
-酶E5，其催化丙酰辅酶A转化为甲基丙二酸半醛；
-酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
9.根据权利要求8的方法，其中，
酶E6为甲基丙二酰辅酶A差向异构酶(EC 5.1.99.1)，
酶E7为甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(EC 4.1.1.41)，
酶E5为甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.27)，和
酶E4为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
10.根据权利要求3至5中之一的方法，其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4、E5和E7中至少一种酶的活性
-酶E7，其催化甲基丙二酰辅酶A转化为丙酰辅酶A；
-酶E5，其催化丙酰辅酶A转化为甲基丙二酸半醛；
-酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
11.根据权利要求10的方法，其中，
酶E7为甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(EC 4.1.1.41)，
酶E5为甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.27)，和
酶E4为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
12.根据权利要求3至5中之一的方法，其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E28和E46中至少一种酶的活性
-酶E46，其催化L-谷氨酸转化为2-酮戊二酸；
-酶E28，其催化2-酮戊二酸转化为琥珀酰辅酶A。
13.根据权利要求12的方法，其中，
酶E46为谷氨酸合酶(EC 1.4.1.13或EC 1.4.1.14)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)或天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1或EC 2.6.1.2)，和
酶E28为2-酮戊二酸合酶(EC 1.2.7.3)。
14.根据权利要求2的方法，其中所述细胞能够经由作为中间产物的丙酰辅酶A来形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸。
15.根据权利要求14的方法，其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4、E5和E47至E52中至少一种酶的活性
-酶E47，其催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A；
-酶E48，其催化丙二酰辅酶A转化为丙二酸半醛；
-酶E49，其催化丙二酸半醛转化为3-羟基丙酸；
-酶E50，其催化3-羟基丙酸转化为3-羟基丙酰辅酶A；
-酶E51，其催化3-羟基丙酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A；
-酶E52，其催化丙烯酰辅酶A转化为丙酰辅酶A；
-酶E5，其催化丙酰辅酶A转化为甲基丙二酸半醛；
-酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
16.根据权利要求15的方法，其中，
酶E4为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)，
酶E5为甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.27)，
酶E47为丙二酰辅酶A脱羧酶(EC 4.1.1.9)、丙二酰辅酶A转移酶(EC2.8.3.3)、甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶(EC 2.1.3.1)或乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)，
酶E48为丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.18)，
酶E49为3-羟基丙酸脱氢酶(EC 1.1.1.59)，
酶E50为3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，
酶E51为烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)，和
酶E52为酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.3)。
17.根据权利要求2的方法，其中所述细胞能够经由作为中间产物的丙烯酰辅酶A来形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸。
18.根据权利要求17的方法，其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4、E56、E72和E73中至少一种酶的活性
-酶E72，其催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶A；
-酶E73，其催化β-丙氨酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A；
-酶E56，其催化丙烯酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A；
-酶E2，其催化甲基丙二酰辅酶A转化为甲基丙二酸；
-酶E3，其催化甲基丙二酸转化为甲基丙二酸半醛；
-酶E4，其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
19.根据权利要求18的方法，其中，
酶E72为辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)或辅酶A合成酶，优选地辅酶A转移酶，
酶E73为β-丙氨酰辅酶A铵裂合酶(EC 4.3.1.6)，
酶E56为巴豆酰辅酶A脱羧酶，
酶E2为甲基丙二酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.17)，
酶E3为醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)或醛氧化酶(EC 1.2.3.1)，和
酶E4为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
20.根据权利要求1的方法，其中3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的形成经由作为初产物的3-羟基异丁酰辅酶A来实现。
21.根据权利要求20的方法，其中所述细胞能够经由作为中间产物的异丁酰辅酶A来形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸。
22.根据权利要求21的方法，其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E76至E79、E60、E61和E8中至少一种酶的活性
-酶E76，其催化丙酮酸转化为2-乙酰乳酸；
-酶E77，其催化2-乙酰乳酸转化为2，3-二羟基异戊酸；
-酶E78，其催化2，3-二羟基异戊酸转化为2-氧代异戊酸；
-酶E79，其催化2-氧代异戊酸转化为异丁酰辅酶A；
-酶E60，其催化异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A；
-酶E61，其催化甲基丙烯酰辅酶A转化为3-羟基异丁酰辅酶A；
-酶E8，其催化3-羟基异丁酰辅酶A转化为3-羟基异丁酸。
23.根据权利要求22的方法，其中，
酶E8为3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，
酶E76为乙酰乳酸合酶(EC 2.2.1.6)，
酶E77为二羟基异戊酸脱氢酶(EC 1.1.1.86)，
酶E78为2，3-二羟基异戊酸脱水酶(EC 4.2.1.9)，
酶E79为2-氧代异戊酸脱氢酶(EC 1.2.1.25或EC 1.2.4.4)，
酶E60为酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.3)、丁酰辅酶A脱氢酶(EC1.3.99.2)或2-甲基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.12)，和
酶E61为烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。
24.根据权利要求21或22的方法，其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E8、E60至E61和E79至E80中至少一种酶的活性
-酶E80，其催化L-缬氨酸转化为2-氧代异戊酸；
-酶E79，其催化2-氧代异戊酸转化为异丁酰辅酶A；
-酶E60，其催化异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A；
-酶E61，其催化甲基丙烯酰辅酶A转化为3-羟基异丁酰辅酶A；
-酶E8，其催化3-羟基异丁酰辅酶A转化为3-羟基异丁酸。
25.根据权利要求24的方法，其中，
酶E8为3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，
酶E60为酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.3)、丁酰辅酶A脱氢酶(EC1.3.99.2)或2-甲基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.12)，
酶E61为烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)，
酶E79为2-氧代异戊酸脱氢酶(EC 1.2.1.25或EC 1.2.4.4)，和
酶E80为氨基酸转移酶(EC 2.6.1.42)。
26.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是通过用于制备经基因工程改造的细胞的方法可获得的，所述方法包括下述步骤，即提高所述细胞中在权利要求2至25中所提及的酶中至少一种酶的活性。
27.用于制备聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法，其包括下列步骤
IIIA)通过根据权利要求1至26中之一的方法来制备甲基丙烯酸，
IIIB)甲基丙烯酸的自由基聚合，
其中，任选地，在自由基聚合之前或之后，甲基丙烯酸的羧基基团或甲基丙烯酸盐的羧酸根基团可以至少部分地被酯化。
全文摘要
本发明涉及用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法，其包括下列步骤IA)通过包括下述步骤的方法来制备3-羟基异丁酸，即在从碳源形成3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸的条件下，使细胞与包含碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲醇、L-缬氨酸或L-谷氨酸作为碳源的培养基相接触，所述细胞相对于其野生型而言如此地经基因工程改造，从而与其野生型相比，它能够形成更多的3-羟基异丁酸或基于3-羟基异丁酸的聚羟基链烷酸；任选地，从培养基中纯化出3-羟基异丁酸；以及任选地，中和3-羟基异丁酸；IB)使3-羟基异丁酸脱水从而形成甲基丙烯酸；以及任选地，使甲基丙烯酸酯化。本发明还涉及用于制备聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法。
文档编号C07C57/04GK101679187SQ200880018364
公开日2010年3月24日 申请日期2008年5月30日 优先权日2007年6月1日
发明者A·马克斯, M·珀特, S·布赫霍尔茨, A·梅, H·西格特, B·艾尔伯, G·福克斯, L·埃格林 申请人:赢创罗姆有限责任公司