Vegf-d突变体及其用途的制作方法

专利名称：Vegf-d突变体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及对VEGF-D的修饰，所述修饰增加其对VEGF受体的活性；及其在治疗中 的用途。
背景技术：
血管内皮生长因子(VEGF)不仅被认为是在成年期维持脉管系统的关键生长因 子，还被认为是在胚胎发生过程中诱导血管发生和淋巴管发生的关键生长因子。还在若干 病理状态如癌症和视网膜病中发现了它们的不正常表达。VEGF-A属于较大的相关生长因子 家族，所述家族包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子PIGF，以及来源于口疮病毒的 VEGF-E蛋白和蛇毒中的多种同源物。人类内源性VEGF蛋白家族成员以若干异构体形式存 在，这是mRNA的可变剪接的结果或是由于蛋白水解处理所致。这些变体的血管发生作用区 别很大，因为它们对三种主要的VEGF受体、共受体例如神经菌毛素(neuopilin)、硫酸类肝 素蛋白多糖以及细胞外基质的其他组分的特异性和亲和性不同。 VEGFR-2是最重要的调控血管发生的受体，其主要在内皮细胞中表达。哺乳动物 VEGFR-2配体包括VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D。除VEGFR-2以夕卜，VEGF-C和VEGF-D也是介导 淋巴管发生并因此参与到淋巴脉管系统形成的受体VEGFR-3的配体，。VEGF-A还与在胚胎 发生过程中主要作为非信号传递的诱骗受体VEGFR-1结合。已知这种受体在成年有机体中 调节炎性细胞例如巨噬细胞和单核细胞的迁移，但其在血管发生中的作用仍然存在争议。
由于VEGF家族成为血管发生调节因子的重要性，它们已被建议作为可能的治疗 剂以调节不同病理状态的血管发生过程(Y投-Herttuala2003)。通过将VEGF直接作为重 组蛋白或使用基因治疗载体而引入组织以诱导血管发生，从而进行了体内研究(Markkanen 2005)。若干研究的发现表明，VEGF家族成员在体内具有强血管发生活性，并且它们可 用于治疗疾病如下肢缺血和冠状动脉疾病。除了这些因素以外，还已发现成熟形式的 VEGF-D (VEGF-DANAG，见下)和VEGF-A最有希望诱导治疗性血管发生。
VEGF与血小板衍生生长因子(PDGF)结构相似并同属于VEGF/PDGF家族，后者属于 更大的半胱氨酸结生长因子超家族。家族成员分都具有在许多细胞外蛋白中发现的并在许 多物种中保守的半胱氨酸结基序。半胱氨酸结蛋白的性质是它们包含一个通过3个二硫键 连接的反平行P折叠的保守结构。半胱氨酸结生长因子通常形成二聚体，其在VEGF/PDGF 家族中经常通过亚基间二硫键连接。 VEGF受体属于被二聚化激活的受体蛋白酪氨酸激酶。配体的二聚化对VEGFR的 激活是必需的。 一个VEGF-A二聚体从其两端分别与两个受体单体结合，从而诱导受体二聚 化，继而诱导细胞内酪氨酸激酶活性。基于若干种通过实验得到的游离或与VEGF受体形成 复合体的VEGF家族成员的3D结构，它们具有极其相似的三级结构并因此很可能通过相似 的机制诱导受体激活。 在所述VEGF家族中，VEGF-C和VEGF-D可再被细分为其各自的子家族，这表现在 其与其它VEGF相比时具有更高的一级序列结构相似性。存在若干特征性性质，包括l)它们是结合VEGFR-3-淋巴管发生介导受体的唯一 VEGF ;2)与VEGF-A、 VEGF-B和PLGF相
比，VEGF-C和VEGF-D以长前体蛋白的形式表达。这些形式的受体结合亲和性很弱，并且， 为转变为更有活性的生长因子，VEGF-C和VEGF-D的N末端和C末端都历经蛋白水解处理； 3)与所述家族的其他成员相比，历经蛋白水解处理的VEGF-D的成熟形式VEGF-DANAG已被 发现主要以非共价结合的二聚体或单体的形式存在，只有一小部分是以共价结合的二硫键 连接的二聚体的形式存在。这些研究还显示VEGF-DAWAG的单体与其二聚体相比也只有非常 微弱的活性。所述二聚体主要为非共价的性质有点令人惊讶，因为在其他VEGF家族生长因 子中形成所述亚基间连接的半胱氨酸残基在VEGF-D蛋白中是保守的。
以前的研究已经诱变过半胱氨酸结结构中包含的VEGF-A的半胱氨酸，以研究它 们对所述蛋白结构和功能的重要性。研究发现亚基间二硫键对VEGF-A的生物学功能是必 需的，因为在这些半胱氨酸被突变为丙氨酸时的VEGF-A丧失了其生物学活性。在其中保守 的半胱氨酸之一 (Cysl56)转变为丝氨酸时，VEGF-C突变体完全丧失了其对VEGFR-2的激 活能力，但仍能够激活VEGFR-3。 VEGF-C和VEGF-D两者的成熟形式也都包含一个不成对的 半胱氨酸残基，其位置接近于预想的形成亚基间二硫键的半胱氨酸残基。最近研究表明线 虫(C. elegans)的pvf-1基因编码一种可激活人类VEGFR-1和VEGFR-2且也是仅部分共价 结合的二聚体的VEGF/PDGF同源物。这种蛋白也像VEGF-C和VEGF-D —样，在其二聚体界 面上具有一个不成对的半胱氨酸。

发明内容
本发明基于以下研究将在其他VEGF中负责形成亚基间二硫键的半胱氨酸 和VEGF-D中不成对的半胱氨酸残基每一个均分别诱变为丙氨酸，作为成熟VEGF-D形式 VEGF-DANAC的蛋白支架(Achen 1998， Stacker1999)。对VEGF-D进行蛋白水解处理从而使 其更具有活性，但这种蛋白水解处理形式主要以非共价结合的二聚体或单体的形式存在。 已经发现，通过诱变改变VEGF-D的二聚体形成界面可增加成熟VEGF-D即VEGF_DANAG的共 价二聚化。还发现，用多种不同氨基酸替换VEGF-DANAe蛋白的Cys25增加了共价二聚体的 形成，并且还显著增加了所述蛋白对VEGF受体的活性。本发明基于以下发现VEGF配体的 共价二聚化更有利于VEGF受体的激活。因此本发明是一种VEGF-D蛋白，所述蛋白通过一 个或多个氨基酸被其他氨基酸所替换而得以修饰，从而改变了其二聚体界面。


图1示出了 VEGF-DAWAG氨基酸序列与哺乳动物VEGF家族成员的VEGF同源结构域 序列的比对。VEGF-DAw"序列中的半胱氨酸残基和突变的半胱氨酸残基以高亮标出。
图2示出了VEGF-DAWAG的同源模型上突变半胱氨酸残基的位置。所述突变的半胱 氨酸氨基酸残基根据它们在VEGF-DANAe序列上的位置被命名。
具体实施例方式
因此本发明是一种VEGF-D蛋白，所述蛋白通过一个或多个氨基酸被其他氨基酸 所替换而得以修饰，从而改变了其二聚体界面。这一限定包括任何影响VEGF-D蛋白的二聚 体界面的氨基酸突变，即所述氨基酸对VEGF-D 二聚体形成具有重要作用。所述二聚体界面是二聚化时VEGF-D蛋白上与另一个VEGF-D蛋白结合的区域。优选地，所述二聚体界面的构象被改变。这一现象的出现可能是由于所述突变影响了蛋白三维结构。突变的氨基酸可以是当所述蛋白二聚化时与另一个氨基酸结合的氨基酸。可改变所述二聚体界面的一个氨基酸实例是VEGF-DANAG的Cys25。 本发明的VEGF-D蛋白包含突变从而所述蛋白的二聚化性质与野生型蛋白相比发生了改变。优选地，本发明的VEGF-D突变体比野生型VEGF-D具有更高的二聚体对单体的比例。因此，在本发明中，所述VEGF-D蛋白可以单体、二聚体或其混合物的形式存在。优选地，所述VEGF-D蛋白基本上以二聚体的形式存在。 经蛋白水解处理的VEGF-D即VEGF-DANAC的序列作为SEQ ID NO :1给出。在一个优选的实施方案中，本发明包括一个VEGF-DAWAG(SEQ IDNO :1)蛋白，其中一个或多个Cys残基被其他氨基酸所替换。与野生型VEGF-DAWAG相比，这种突变可增加二聚体对单体的比例。在一个优选的实施方案中，该序列的第25个氨基酸(Cys25)被另一个氨基酸所替代。优选地，所述氨基酸选自Leu、 11e、Val、Ala、Ser、Phe、Trp和Asn。更优选地，所述氨基酸选自Leu、 lie和Val。 本发明的VEGF-D蛋白，或包含编码本发明VEGF蛋白的核苷酸序列的表达载体，可用于制备促进血管发生的药剂。所述促进血管发生可用于治疗或预防体组织的若干疾病。所述体组织可以是血管例如冠状动脉或静脉，或淋巴管。所述体组织也可为器官如眼睛、耳朵、肺、肾、肌肉、心肌、脑、卵巢、前列腺、子宫、胎盘和皮肤。所述器官和其他组织也可能已被移植到患者体内；例如，所述患者可能已经接受了移植的肾、动脉或静脉。
本发明的VEGF-D蛋白，或如上面所定义的表达载体可用于治疗创伤。在另一个实施方案中，它们可用于治疗或预防缺血或冠状动脉疾病。在另一个实施方案中，它们可用于治疗神经障碍。 为用于治疗，本发明的肽可通过本领域技术人员所知的方法并使用各组分来制备和给药。本领域技术人员可根据待治疗对象的身体状况、所述化合物的效力、给药途径等常见因素来选择所述肽的合适剂量。合适的给药途径包括口服给药、静脉内给药、腹膜内给药、肌内给药、鼻内给药和皮下给药。
以下研究举例说明了本发明。
构建体的克隆和病毒生成 本研究所用的VEGF-DANAG基因包括野生型VEGF-D序列上对应第93-201位氨基酸的第277-603位核苷酸。本文所用编号基于图1所示的VEGF-Dawag序列。将编码N末端IL-3信号序列和Flag-tag的序列和编码C末端6xHis的序列融合为所述VEGF-DANAG序列。以pEntry-VEGF-DAWAG质粒为模板，用快速转换定点突变产生编码突变体VEGF-DAWAG蛋白的质粒。用BP-反应将人类VEGF-A121 cDNA克隆到pDonr201载体中(Invitrogen)。然后用LR反应(Laitinen 2005)将所述Entry克隆的编码序列克隆到pBVboostFG系统载体中。重组杆状病毒的生成如前所述。
蛋白在昆虫细胞培养物中的表达及纯化 重组蛋白在振荡培养72小时的重组杆状病毒(MOI 5)感染的HighFive细胞中表达。用BD Talon金属亲和树脂(BD Biosciences Clontech)从澄清的培养基中纯化蛋白。在室温下将3ml树脂在培养基中摇动2小时，然后收集所述树脂并转移到色谱柱中。用30ml的含300mM NaCl的50mM磷酸钠(pH 7.0)进行洗涤。用50mM HEPES、20mM NaCl、200mM咪唑(pH7. 4)洗脱重组蛋白。用50mM HEPES、20mMNaCl (pH7. 4)对蛋白进行透析以除去咪唑。以BSA为标准品用DC蛋白检测试剂盒(BioRad)测量蛋白浓度，并通过SDS-PAGE确认所测得的蛋白浓度。重组人类VEGF-A165购自R&D System。
蛋白在哺乳动物细胞中的表达 使用Roche的FugeneHD转染试剂，按照厂商说明书用pBVboostFG系统载体瞬时转染293T细胞。转染后52-72小时收集条件培养基。用R&DSystems的人类VEGF-D免疫测定对所述培养基中VEGF-D蛋白的水平进行定量。
SDS-PAGE和蛋白印迹 将纯化蛋白在变性和非变性条件下进行SDS-PAGE分析，然后用Silver SnapStain KitII (Pierce)或Page Blue Protein Staining Solution (Fermentas)将凝胶染色，以分析纯化蛋白。或者，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上并用VEGF-D单克隆抗体(廳286，R&D Systems)检测。
体外研究 将细胞以每孔18000个细胞置于96孔板中，并加入连续稀释的来自瞬时转染293T细胞的重组蛋白或条件培养基，进行Ba/F3-R2(Achen1998)和Ba/F3-R3 (Achen 2000)细胞存活测定。在48小时后对细胞存活率进行定量。在每孔中加入20iU Cell Titer BlueReagent (Promega);在37。C下将96孔板培育2小时。用Wallac Victor2 1420 MultilabelCounter (Perkin Elmer Biosystems)读取荧光。
结果 重组VEGF-DANAG蛋白的生产VEGF-D的成熟形式VEGF_DANAG上可能形成分子间二硫键的半胱氨酸(Cys44和Cys53)和不成对的半胱氨酸残基(Cys25)中的每一个都分别被丙氨酸残基替换。构建体被命名为VEGF-Danag25A、VEGF-Danag44A和VEGF-DANAG53A。用BvboostFG杆状病毒表达系统在High Five昆虫细胞系中生产所述重组蛋白，并用固定化金属亲和色谱从培养基中纯化该蛋白。经蛋白印迹检测，所有构建体都被成功表达和纯化。然而，VEGF-DANAe44A蛋白在随后的透析中反复丢失，很可能是由于降解或聚合以及与透析盒的非特异性结合。同时，这种蛋白的表达水平也比其他VEGF蛋白低，这可能是由于这种突变阻碍蛋白折叠或降低了稳定性。以类似方式生产和纯化人类VEGF-A121重组蛋白以作为对照。 共价二聚体的形成在非还原条件下用SDS-PAGE评估VEGF-DANAG、VEGF_DANAG25A和VEGF-Dawag53A形成共价二聚体的能力。VEGF-DAWAG被发现只有部分为共价二聚体，而VEGF-DAWAG25A形成的共价结合二聚体的量与其天然形式相比有所增加。如预测的，VEGF-DANAG53A的共价二聚体的形成被阻碍。 VEGF-D蛋白包含突变Gly51 —Cys或Cys25 —Leu ;VEGF-D包含突变Arg 22 —Leu和Cys25 — Leu ;并且VEGF-D包含突变Arg22 — lie和Cys25 — Leu，这些突变体的二聚体和单体的比例与VEGF-DAWAG相比都有所增加。如预测的，VEGF-D二聚体界面上的某些修饰可明显地改变所述蛋白的多聚化状态。 体外活性检测用表达VEGFR-2/EpoR或VEGFR-3/EpoR嵌合受体的细胞，通过Ba/F3细胞存活测定法测测量纯化的VEGF-DANAG、 VEGF_DANAG25A和VEGF_DANAG53A的生物学活性。两个测定都显示，VEGF-DAw"53A突变体完全丧失了其激活VEGF受体的能力，而 VEGF-DAWAG25A突变体的活性比天然VEGF-DAWAG高约10倍。从昆虫细胞培养基和瞬时转染 的293T细胞的条件培养基中纯化的所述蛋白被发现具有相似的活性，表明VEGF-DANAe25A 突变体活性的增加不依赖其生产系统。 为研究哪个氨基酸最适合替换VEGF_DANAG的Cys25，用不同的氨基酸替换Cys25 得到若干突变体形式。选择氨基酸以涵盖不同的化学性质。通过293T细胞的瞬时转染得 到条件培养基，并用表达VEGFR-2/EpoR或VEGFR-3/EpoR嵌合受体的Ba/F3细胞进行细胞 存活测定来测量蛋白活性。每种蛋白都在三种不同浓度下进行分析10、100和1000ng/ml。 研究发现疏水氨基酸(Leu、Ile、Val)替换Cys25的突变体形式是VEGFR-2和VEGFR-3 二聚 化活性最高的突变体。用下列氨基酸替换Cys25也发现了比天然VEGF-DANAG更高的活性 Ala、 Ser、 Phe、 Trp和Asn。用Gly替换Cys25导致生长因子的失活。 结果显示，在VEGF家族的其他成员中形成二硫键的保守的半胱氨酸对于 VEGF-DANAG的功能是必需的。更重要的，还发现从VEGF-DAWAG二聚体界面上除去不成对的 半胱氨酸(Cys25)有效地提高了 VEGF-DAWAG蛋白在激活血管内皮生长因子受体2和受体3 层面上的活性。因此，这些新VEGF-DANAG的Cys25突变体可被证明，不管是作为重组蛋白还 是通过基因治疗给药，均是比以前使用的野生型蛋白更有效的治疗性血管发生的介质。例 如，包括编码本发明VEGF-D蛋白的核苷酸序列的表达载体可用于基因治疗。
参考文献 Achen et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95,548—553
Markka體et al (2005) Cardiovasc. Res. 65， 656-664
Laiti體et al (2005) Nucleic Acids Res. 33， e42
Aire騰et al (2003) Nucleic Acids Res. 31， elOl
Stacker et al(1999)J. Biol. Chem. 274(45) :32127-3213权利要求
一种VEGF-D蛋白，所述蛋白通过一个或多个氨基酸被其他氨基酸所替换而得以修饰，从而改变了其二聚体界面。
2. 根据权利要求1的蛋白，其中所述一个或多个氨基酸包括Cys。
3. 根据权利要求1或2的蛋白，其是经修饰的VEGF-DANAG(SEQ IDN0:1)。
4. 根据权利要求3的蛋白，其中VEGF-DANAG的Cys25残基被另一种氨基酸替换。
5 根据前述权利要求任一项的蛋白，其中所述其他氨基酸为Leu、 Ile、 Val、Ala、 Ser、 Phe、 Trp或Asn。
6. 根据权利要求5的蛋白，其中所述其他氨基酸为Leu、Ile或Val。
7. 根据前述权利要求任一项的VEGF-D蛋白，其基本以二聚体的形式存在。
8. 根据前述权利要求任一项的蛋白，用于治疗。
9. 根据前述权利要求任一项的蛋白，用于促进血管发生。
10. 根据权利要求8或9的蛋白，用于预防或治疗缺血或冠状动脉疾病。
11. 根据前述权利要求1-8任一项的蛋白用于制备促进血管发生的药剂的用途。
12. 根据权利要求ll的用途，用于预防或治疗缺血或冠状动脉疾病。
13. —种包含编码权利要求1-7任一项VEGF蛋白的核苷酸序列的表达载体，用于基因 治疗。
14. 根据权利要求13的表达载体，用于促进血管发生。
全文摘要
本发明是一种VEGF-D蛋白，其包含在二聚体界面上的一个或多个氨基酸突变；以及其在治疗中尤其是在促进血管发生中的用途。
文档编号C07K14/52GK101730710SQ200880018138
公开日2010年6月9日 申请日期2008年6月2日 优先权日2007年5月31日
发明者K·J·埃润尼, P·图埃瓦恩, S·埃拉-赫图阿拉 申请人:Ark治疗学有限公司