一种猪脾转移因子制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪脾转移因子制备方法，该方法包括组织绞碎、均质破碎、微滤、超滤等步骤，本发明采用高压均质机快速破碎细胞，能更有效的保持转移因子活性；此外和现有技术相比本发明的技术方案无需冻融步骤，缩短了生产周期；使用微滤-超滤技术截留适宜分子量的有效成分，获得转移因子原液，相比于传统的透析技术效率更高。本工艺大大缩短生产周期，适用于规模化生产的需求；用健康猪脾脏为原料，经去脂肪、细胞破碎、微滤、超滤制备的转移因子溶液，为非特异性免疫调节剂，用于增强动物机体免疫功能。
【专利说明】一种猪脾转移因子制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽用生物制品领域，尤其涉及一种猪脾转移因子制备方法。
【背景技术】
[0002]转移因子(Transfer factor,简称TF)是淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的物质，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体，从而增强受体的免疫功能，目前其在国外已成为一种应用广泛的增强免疫制剂。 [0003]转移因子存在于脾脏的淋巴细胞中，现有技术的转移因子制备方法普遍是将动物脾脏进行绞碎、破坏细胞结构使胞内转移因子释放到浆液中，再将浆液中的转移因子进行分离精制最终得到转移因子产品。
[0004]动物脾脏浆液成分复杂，因此动物TF不易分离纯化；动物TF分子量一般在3~15KD，属于小分子多肽，不含蛋白质，含6种以上氨基酸；不同动物和不同抗原特异性TF的分子量、肽分子大小和氨基酸种类略有差别；TF无热原；TF的活性不被胰酶所破坏；TF的活性对热不稳定，在冷冻条件下稳定。
[0005]鉴于以上特点，目前制备转移因子的现有技术主要采用透析法(Laurence法)或过滤法。
[0006]朱天新等先将组织绞碎,再冻融破碎,分别用Lanrence法和pH调节-超滤法提取转移因子，结果显示匀浆液冻融次数对转移因子的得率和质量有较大的影响，PH调节-超滤法适合于转移因子的大规模生产；顾平和陈德有先将脾脏组织研磨破碎，再冻融破碎，之后，使用絮凝剂和助滤剂作用微滤、超滤，该工艺操作简单，生产周期短，操作费用低，产量高，可以大规模工业化生产的新工艺。
[0007]中国专利申请“口服转移因子”(专利申请号:93121184.0)公开生产方法:将新鲜健康猪脾脏匀浆、冻融、透析、过滤除菌，制成转移因子原液；“一种抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法”(专利申请号:201210136306.0)公开一种制备特异性转移因子的方法:将免疫后的猪脾脏进行清洗、匀浆、冻融破碎，经过滤、超滤后获得原液；“一种猪脾转移因子注射液的生产方法”(专利申请号:201110126248.9)中使用匀浆、低温超声破碎、离心、超滤工艺提取转移因子；“制备转移因子的工艺方法-全滤法”(专利申请号:200310118439.6)则采用压滤、超滤、纳滤几种方法连续过滤的制备工艺；“制备转移因子的工艺方法-加热法”(专利申请号:200410039444.2)连续采用多种过滤法，增加加热处理的步骤；“一种抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法”(专利申请号:200810053541.5)用组织捣碎机、冻融、离心、超滤法制备工艺；“抗流感病毒转移因子的制备”(专利申请号:200610035059.X)用组织捣碎机捣碎、低温冻融、离心、中空纤维管超过滤的制备工艺；“静脉注射用转移因子制备工艺流程”(专利申请号:200410046404.0)使用冻融法和全滤法生产注射液，下游亦使用超滤进行截留筛分。
[0008]通过以上现有技术的技术方案可以发现，透析法是指对动物脾脏匀浆的上清液进行若干次透析，实现对转移因子的分离纯化，此法操作简单，但生产周期长，操作费用高，难以进行工业化大规模生产；过滤法是先对脾脏组织进行破碎匀浆，再离心取上清液进行过滤，实现对转移因子的分离纯化，此方法的破碎步骤普遍分为组织初步破碎和冻融破碎，其中冻融破碎步骤耗费时间较长，而初步破碎由于破碎设备的限制常存在细胞破碎不完全的现象。因此，为了在最大限度保持产物活性、提高得率同时适应规模化生产需求，有必要开发一种周期更短、得率更高的转移因子制备方法。
【发明内容】
[0009]为克服现有技术的技术缺陷，本发明提供一种使用高压均质机快速破碎细胞、并结合膜过滤技术对转移因子实现分离纯化的猪脾转移因子制备方法。
[0010]为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案:
[0011]一种猪脾转移因子制备方法，包括以下步骤:
[0012]I)将猪脾脏经绞肉机绞碎，粗绞得到肉糜，向肉糜中加入肉糜总质量0.1~0.5倍质量的纯化水,经胶体磨充分研磨,而后继续加入纯化水直至本步骤所加入的纯化水总质量为肉糜总质量的1.4~1.6倍为止，混合均匀，即得到匀浆待用；
[0013]2)利用高压均质机对步骤I)得到的匀浆进行均质处理，待用；
[0014]3)将步骤2)均质处理后的匀浆与纯化水以1:0.2~1:0.6 (w:v)比例混合均匀，得到浆液混合物待用；
[0015]4)利用微滤系统，以0.005~0.5 y m孔径对步骤3)得到的浆液混合物进行微滤，收集滤液待用；
[0016]5)利用超滤系统，以4~ IOKD孔径对步骤4)得到的滤液进行超滤，收集滤液即为转移因子原液。
[0017]上述技术方案中，步骤I)所述的猪脾脏为新鲜的、去除了结缔组织和脂肪的猪脾脏；步骤2)所述的均质处理过程中浆液温度不高于40°C;步骤3)、步骤4)、步骤5)各组分温度以及操作温度均不高于35°C ;同时，对上述技术方案优选为以下步骤:
[0018]I)将猪脾脏经绞肉机绞碎，粗绞2遍得到肉糜，向肉糜中加入肉糜总质量0.25倍质量的纯化水,经胶体磨充分研磨,而后向其中加入肉糜总质量1.25倍质量的纯化水混合均匀，制成匀浆待用；
[0019]2)利用高压均质机对步骤I)得到的匀浆进行均质处理2遍，待用；
[0020]3)将步骤2)均质处理后的匀浆与纯化水以1:0.4 (w:v)比例混合均匀，得到浆液混合物待用；
[0021]4)利用微滤系统，以0.1 Pm孔径对步骤3)得到的浆液混合物进行微滤，收集滤液待用；
[0022]5)利用超滤系统，以6KD孔径对步骤4)得到的滤液进行超滤，收集滤液即为转移因子原液。
[0023]上述微滤系统和超滤系统均自市面购得，操作方法依照设备操作规程实施。纯化水标准参照《中华人民共和国兽药典》的规定。
[0024]本发明采用高压均质机快速破碎细胞，能更有效的保持转移因子活性；此外和现有技术相比本发明的技术方案无需冻融步骤，缩短了生产周期；使用微滤-超滤技术截留适宜分子量的有效成分，获得转移因子原液，相比于传统的透析技术效率更高。本工艺大大缩短生产周期，适用于规模化生产的需求；用健康猪脾脏为原料，经去脂肪、细胞破碎、微滤、超滤制备的转移因子溶液，为非特异性免疫调节剂，用于增强动物机体免疫功能。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
[0026]I)将冷冻的猪脾脏约65.0kg表面包装去掉，然后用纯化水过夜解冻；
[0027]2)第二天使用纯化水冲洗脾脏，挑拣出不合格脾脏，去除筋膜、脂肪等大块组织；
[0028]3)称量以6.0kg/份脾脏经绞肉机绞碎，粗绞2遍；
[0029]4)每2份混合，加入0.1倍质量(1.2kg)的纯化水，混匀，依次经斜行齿胶体磨研磨2遍，菱形齿胶体磨研磨I遍，放入洁净盛料桶，共装5桶；剩余脾脏回收冷冻保存；
[0030]5)再向每桶中补加1.3倍质量(15.6kg)的纯化水，搅拌制成匀浆；
[0031]6)匀浆经高压均质机进行破壁，均质I遍，在线控制浆液温度处于35~40°C ；
[0032]7)破壁后的浆液全部注入料液罐，以1:0.2 (w:v=144kg:28.8L)比例使用预冷纯化水稀释，最终温度控制在30~35°C ；
[0033]8)按照微滤系统(100KD,天津膜天膜工程技术有限公司)操作规程，进行微滤液收集，不断加入纯化水稀释，直至收集300L微滤液；
[0034]9)按照超滤系统(4KD，天津膜天膜工程技术有限公司)操作规程，微滤液浓缩，收集透过液为转移因子原液，共收集259kg原液；
[0035]10)留样检测，多肽为1.51mg/ml ;核糖为122.55 u g/ml ;其它项目均符合企业内控质量标准。
[0036]实施例2
[0037]I)将冷冻的猪脾脏约65.0kg表面包装去掉，然后用纯化水过夜解冻；
[0038]2)第二天使用纯化水冲洗脾脏，挑拣出不合格脾脏，去除筋膜、脂肪等大块组织；
[0039]3)称量以6.0kg/份脾脏经绞肉机绞碎，粗绞2遍；
[0040]4)每2份混合，加入0.25倍质量(3.0kg)的纯化水，混匀，依次经斜行齿胶体磨研磨2遍，菱形齿胶体磨研磨I遍，放入洁净盛料桶，共装5桶；剩余脾脏回收冷冻保存；
[0041]5)再向每桶中补加1.25倍质量的纯化水(15.0kg)，搅拌制成匀浆；
[0042]6)匀浆经高压均质机进行破壁，均质2遍，在线控制浆液温度处于30~35°C ;
[0043]7)破壁后的浆液注入料液罐，以1:0.4 (w:v=150.0kg:60.0L)比例使用预冷纯化水稀释，最终温度控制在25~30°C ；
[0044]8)按照微滤系统(0.1 U m，天津膜天膜工程技术有限公司)操作规程，进行微滤液收集，不断加入纯化水稀释，直至收集300L微滤液；
[0045]9)按照超滤系统(6KD，天津膜天膜工程技术有限公司)操作规程，微滤液浓缩，收集透过液为转移因子原液，共收集308.0kg原液；
[0046]10)留样检测，多肽为1.llmg/ml ;核糖为125.17 U g/ml ;其它项目均符合企业内控质量标准。
[0047]实施例3
[0048]I)将冷冻的猪脾脏约65.0kg表面包装去掉，然后用纯化水过夜解冻；
[0049]2)第二天使用纯化水冲洗脾脏，挑拣出不合格脾脏，去除筋膜、脂肪等大块组织；[0050]3)称量以6.0kg/份脾脏经绞肉机绞碎，粗绞3遍；[0051]4)每2份混合，加入0.5倍质量(6.0kg)的纯化水，混匀，依次经斜行齿胶体磨研磨2遍，菱形齿胶体磨研磨I遍，放入洁净盛料桶，共分5桶；剩余脾脏回收冷冻保存；
[0052]5)再向每桶中补加1.1倍质量(13.2kg)的纯化水，搅拌制成匀浆；
[0053]6)匀浆经高压均质机进行破壁，均质3遍，在线控制浆液温度处于25~30°C ;
[0054]7)破壁后的浆液注入料液罐，以1:0.6 (w:v=156kg:93.6L)比例使用预冷纯化水稀释，最终温度控制在20~25°C ；
[0055]8)按照微滤系统(0.5 Pm，上海立昌环境工程有限公司)操作规程，进行微滤液收集，不断加入纯化水稀释，直至收集300L微滤液；
[0056]9)按照超滤系统(10KD,天津膜天膜工程技术有限公司)操作规程，微滤液浓缩，收集透过液为转移因子原液，共收集316.0kg原液；
[0057]10)留样检测，多肽为1.28mg/ml ;核糖为118.60iig/ml ;其它项目均符合企业内
控质量标准。
[0058]以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种猪脾转移因子制备方法，包括以下步骤: 1)将猪脾脏经绞肉机绞碎，粗绞得到肉糜，向肉糜中加入肉糜总质量0.1~0.5倍质量的纯化水，经胶体磨充分研磨，而后继续加入纯化水直至本步骤所加入的纯化水总质量为肉糜总质量的1.4~1.6倍为止，混合均匀，即得到匀浆待用； 2)利用高压均质机对步骤I)得到的匀浆进行均质处理，待用； 3)将步骤2)均质处理后的匀浆与纯化水以1:0.2~1:0.6 (w:v)比例混合均匀，得到浆液混合物待用； 4)利用微滤系统，以0.005~0.5 y m孔径对步骤3)得到的浆液混合物进行微滤，收集滤液待用； 5)利用超滤系统，以4~IOKD孔径对步骤4)得到的滤液进行超滤，收集滤液即为转移因子原液。
2.根据权利要求1所述的一种猪脾转移因子制备方法，其特征在于步骤I)所述的猪脾脏为新鲜的、去除了结缔组织和脂肪的猪脾脏。
3.根据权利要求1所述的一种猪脾转移因子制备方法，其特征在于步骤2)所述的均质处理过程中浆液温度不高于40°C。
4.根据权利要求1所述的一种猪脾转移因子制备方法，其特征在于步骤3)、步骤4)、步骤5)各组分温度以及操作温度均不高于35°C。
5.根据权利要求1~4任一项所述的一种猪脾转移因子制备方法，其特征在于包括以下步骤:· 1)将猪脾脏经绞肉机绞碎,粗绞2遍得到肉糜，向肉糜中加入肉糜总质量0.25倍质量的纯化水,经胶体磨充分研磨,而后向其中加入肉糜总质量1.25倍质量的纯化水混合均匀，制成匀浆待用； 2)利用高压均质机对步骤I)得到的匀浆进行均质处理2遍，待用； 3)将步骤2)均质处理后的匀浆与纯化水以1:0.4(w:v)比例混合均匀，得到浆液混合物待用； 4)利用微滤系统，以0.1 y m孔径对步骤3)得到的浆液混合物进行微滤，收集滤液待用； 5)利用超滤系统，以6KD孔径对步骤4)得到的滤液进行超滤，收集滤液即为转移因子原液。
【文档编号】A61P37/04GK103705539SQ201310755932
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】王甜, 苏建东, 王尚尚, 杨燚, 田凤菊, 夏广欣, 李建丽, 吴全忠, 杨保收, 李守军 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司