专利名称：猪羊血脾制抗人癌天然白细胞介素的制作方法
技术领域：
本发明是涉及以猪、羊血、脾制取IL-2为主协同剂抗人癌的生物药品的生产方法，该技术是属于高科技细胞工程技术。
白细胞介素-2(即IL-2)是80年代国际上开始研制的生物药品。它是继传统治疗肿瘤的三大疗法(手术、化学、放射疗法)之后的第四种疗法即生物疗法(BRM)的关键药物。其本身大剂量即可有抗癌活性;用IL-2在人体外培养人的淋巴细胞，使淋巴细胞具有杀伤肿瘤细胞，而不损伤正常细胞，其杀伤肿瘤细胞能力大为增强的特性，并使淋巴细胞的数量得到大量、快速的增殖(此种经IL-2激活的淋巴细胞称之为LAK细胞)。美国癌研究中心Rosenberg，SA用LAK细胞加IL-2治疗晚期恶性肿瘤，获得8例肿瘤完全消失的显著效果，该作者又报道(Rosenberg，SA.Science 2331318，1986)用IL-2在人体外培养从患者手术切除的肿瘤分离获得的“肿瘤浸润淋巴细胞”(称TIL细胞)，开始由105个细胞经80天培养可增至1026个。TIL细胞较LAK细胞杀伤肿瘤的疗效又提高50-100倍，此项成果震动了世界医务界。但是目前所使用的IL-2是来自人体的淋巴细胞，人的扁桃腺、人的脾，这些都得从车祸等死者身上及时采取或从活人身上采取，再是仅采用IL-2(而不用IL1-7等)，提取工艺复杂，设备昂贵，药物来源困难，所以价格极高。也有采用基因工程方法，将人的IL-2基因掺入大肠杆菌中，生产的IL-2称之为重组IL-2(即rIL-2)，其价格也未降下来多少，用Rosenbery SA的剂量，一人一疗程，需1000万元人民币，且含有大肠杆菌毒素无法完全消除，人体使用发高烧，有毒素反应。
本发明的目的在于提供一种具有多种抗癌因子协同作用的协同剂，疗效高，使用安全，价格极其低廉、药源广泛的制取抗癌药的方法。
为实现本发明的上述目的，采用了猪、羊的血和脾取代人的血和脾等淋巴组织为药源，再是取IL1-7及γ干扰素等与IL-2起协同作用，增强IL-2的作用。
取新鲜猪脾、羊脾，抑菌、无菌操作制成细胞悬液或新鲜猪、羊的抗凝血，抑菌;经分离淋巴细胞，加培养基、丝裂原，细胞培养24-96小时，细胞培养上清液，经纯化，取分子量1万-5万道尔顿蛋白质部分，除菌，制成水针剂或冻干粉针剂。
上述中的抗凝血、抑菌，分离淋巴细胞，加培养基、丝裂原，细胞培养，细胞培养上清液经纯化、除菌，制成水针剂或冻干粉针剂均是细胞工程技术及制药技术中的常规技术。
白细胞介素家族中的IL-1到IL-7以及γ-干扰素相互有协同增强抗肿瘤作用。IL-1可协同IL-2显著增强LAK细胞杀伤肿瘤细胞活性1.3-286倍(Crump，1989);IL-3增强LAK细胞杀伤肿瘤细胞活性132%;IL-4也能增强LAK的活性，也是杀肿瘤细胞的淋巴细胞的分化因子;IL-5能诱导淋巴细胞产生IL-2受体，增强IL-2作用;IL-6促进T淋巴细胞激活，产生对IL-2的应答能力;IL-7诱导T淋巴细胞表达IL-2受体并产生IL-2。干扰素与IL-2、IL-1、IL-4联合应用有协同相加抗癌作用。据此本发明采取1万至5万道尔顿的低分子量蛋白质，这就可取得包括IL-1到IL-7及干扰素等多种因子(这些因子分子量均在1万至5万分子量之间)的协同剂的剂型，达到协同增强抗肿瘤作用的效果。
低分子(分子量7万道尔顿以下)异种蛋白质具有人体可耐受的作用，例如猪、牛的低分子量的血浆蛋白质(分子量在7万道尔顿以下)免疫原性很低，输入人体1000ml以上，不会引起过敏反应，又如，不同人的白蛋白(分子量为7万道尔顿)人体可以互相输注而不需验血型。同样，胰岛素、降钙素、ACTH(促肾上腺皮质激素)等都是来自动物可输入人体治疗人体疾病的常用药。抗癌药门冬酰胺酶也来源于动物等都是证明。
本发明的主要优点1、廉价、经济效益高西德进口重组IL-2、10，000单位为360马克，折合人民币1200元;现国内用人脾、扁桃体少量生产天然IL-2，10，000单位为500元人民币;本发明的方法10，000单位售价约为10元，本法的价格为进口的1/120，是国内价的1/50。
成本低廉若生产500万单位，按一万单位10元人民币计算，共5000元人民币，而成本仅300元。而且取料主要是经济动物，取料极为方便。
故本法将创造极高的经济效益和社会效益。
2、多因子协同作用，提高疗效该制剂中含有IL-1到IL-7及干扰素等多种淋巴因子，其在生理条件下是相辅相成协同起作用的，可以提高本剂治癌的疗效。不仅如此，本剂同时具有抗病毒、抗细菌、抗寄生虫病，治疗肝炎作用。
3、药源丰富，便于批量生产旧法药源来自人体，限制产量，供不应求。基因重组法，细菌毒素难除，且其分子只含IL-2单体，不含天然产品的糖蛋白部分，疗效不佳，影响大量推广。本法产品为天然白细胞介素系列产品含糖蛋白，质量高，可大量生产，满足供应。
4、疗效高、使用安全IL-2及其协同因子的抗癌效果，国内外承认。本药安全性已为临床使用证明。经美国进口贝克曼高压液相色谱分析，以西德标准rIL-2作对照，证明本产品含有明显IL-2峰(见
图1、图2)。
实施例1猪脾细胞制备IL-2为主的协同剂具体制备过程如下经检疫新鲜的猪脾600g，立即放入抗菌素(每1000ml生理盐水含40000单位庆大霉素及0.3g红霉素，0.3g红霉素先用2ml5%葡萄糖溶解)溶液浸泡2小时;在超净台中无菌操作，于大平皿上，用20ml注射器针芯在不锈钢网上将脾研碎制成细胞悬液。按0.5ml/g比例加生理盐水稀释。100目不锈钢网过滤，滤液以13比例加淋巴细胞分离液，先将淋巴细胞分离液放离心管下部，然后小心沿管壁将细胞悬液重层其上，2000转/分离心30分钟;取梯度离心的淋巴细胞层，加5倍体积的生理盐水，2000转/分，离心15分钟，弃上清，取淋巴细胞沉渣，计数细胞数，按5×106/ml浓度以RPMI1640培养基稀释细胞，按100u/ml庆大霉素，1mg/ml红霉素，(红霉素每支先以2ml5%葡萄糖溶解)加入抗菌素，加植物血凝素PHA-M1μg/ml，PHA-P1μg/ml，ConA(刀豆蛋白)20μg/ml。培养瓶中培养，5-7%CO2，37℃，CO2培养箱中培养48小时。取培养上清，2000转/分，离心30分钟，弃沉渣，取上清，获500ml液体。用CTLL细胞测该上清IL-2治性为800u/ml。在超滤器中经分子量5万道尔顿超滤膜超滤，取5万道尔顿以下部分，再经1万道尔顿超滤膜超滤，取1万道尔顿以上部分，得25ml浓缩液。过SephadexG75层析柱，美国贝克曼Du6分光光度计280nm波长，检测，取蛋白质部分，得100mlIL-2协同剂，CTLL细胞MTT法测IL-2活性为4000u/ml，除菌分4℃保存。
临床使用病例赫××，男，48岁，住院号35465临床诊断右肩部肿物切术后(转移腺癌)，多发性骨转移肝硬化腹水，肝转移。患者已处肿瘤晚期(Ⅳ期)，卧床不起不能自动翻身，黄疸。骨ECT检查为多发性骨转移。经三周CMFA化疗无效。化疗中出现腹水，腹围110cm，衰竭尿少，不能进行任何化疗，病人危在旦夕。仅用腹腔注射IL-2协同剂12000单位3次，异体LAK细胞三次总量2.0×109。二个月腹水不仅未增加而且减少为腹围92.5cm。维持生命近半年，延长生存期2个月，注药后无皮诊，无发烧，无急性或迟发性过敏反应，无肝肾功能障碍。
实施例2猪血细胞制备IL-2为主协同剂的具体实施过程如下采取新鲜猪血1000ml，0.01%肝素抗凝，庆大霉素100u/ml，红霉素1mg/ml(先用2ml5%葡萄糖溶解)。2000转/分，离心30分钟，其血浆层加5倍生理盐水，2000转/分，离心30分钟，收集淋巴细胞待用。其白细胞层，以13加淋巴细胞分离液，先将淋巴细胞分离液放于离心杯下部，白细胞液重层于其上，2000转/分，30分钟，取梯度离心的淋巴细胞层，加5倍体积生理盐水2000转/分，离心15分钟，取淋巴细胞沉渣，与前述梯度离心的淋巴细胞合并，加一倍生理盐水洗一次，计数细胞数，以RPMI1640培养基稀释淋巴细胞为5×106/ml，加庆大霉素100u/ml，红霉素1mg/ml，(先用5%葡萄糖2ml溶解/支)加ConA(刀豆蛋白)20μg/ml，PHA-M1μg/ml，PHA-P1μg/ml，注入培养瓶中，在CO2培养箱中，5-7%CO2，37℃培养8小时。取培养上清，2000转/分，离心30分钟，弃沉渣，取上清，获450ml，在超滤器中经分子量5万道尔顿滤膜超滤，取5万道尔顿以下部分，再经1万道尔顿滤膜超滤，取1万道尔顿以上部分，得30ml浓缩液，过SephadexG75层析柱，美国贝克曼Du-6紫外可见光分光光度计检测，280nm波长，取蛋白质部分。得97mlIL-2协同剂。CTLL细胞MTT法测IL-2活性为4100单位/ml。0.30μm孔径滤膜，除菌过滤，4000单位/支，分装，4℃保存。
临床使用病例254医院患者，赵××，男，66岁，胃癌术后，Ⅳ期，肝转移，胰腺转移，腹膜转移。左锁骨上窝肿大淋巴结4.0×2.5cm，淋巴结穿刺为转移腺癌。术后化疗、中药治疗4个月无效，病情恶化，出现腹水，腹围88cm。消瘦、贫血。放腹水，提取淋巴细胞以辽宁省肿瘤研究所制的IL-2协同剂进行体外培养、制TIL细胞，于1990年6月12日回输1.1×109加IL-2协同剂(猪血)16000单位腹腔输注。注前试敏(-)。并行左锁骨上肿大转移淋巴结内IL-2协同剂注射。结果转移淋巴结显著缩小为2.2×2.2cm(肿块二最大径乘积由10缩小为4.84。缩小超过50%)，疗效显著，并连续肌注IL-2协同剂七天。注本药前腹水迅速增涨，注药后腹水不仅没涨，反而腹围由88cm减为84cm。用药后患者无发疹，无发烧，无肝肾功能障碍，无急性或迟发性过敏反应。
实施例3羊脾细胞制备的IL-2为主的协同剂取新鲜羊脾500g，立即放大庆大霉素40u/ml，红霉素0.3mg/ml的生理盐水溶液中浸泡2小时，在超净台中无菌操作下，于大平皿上，用20ml注射器针芯在不锈钢网上将脾研碎制成细胞悬液。按0.5ml/g比例加生理盐水稀释。100目不锈钢网过滤，滤液以13比例加淋巴细胞分离液，先将淋巴细胞分离液放离心管下部，然后小心将细胞悬液重层其上。2000转/分，离心30分钟。取梯度离心的淋巴细胞层，加五倍体积的生理盐水，2000转/分离心15分钟，取淋巴细胞沉渣，计数淋巴细胞数，按5×106/ml浓度以RPMI1640培养基稀释细胞。加100单位/ml庆大霉素，1mg/ml红霉素(先以5%葡萄糖2ml溶解)。加植物血凝素PHA-M1μ/ml、PHA-M1μg/ml，ConA(刀豆蛋白)20μg/ml。注入培养瓶，放CO2培养箱中，5%CO2，37℃培养48小时。取培养上清，2000转/分，离心30分钟，取上清获得450ml液。用CTLL细胞测该上清IL-2活性650单位/ml。在超滤器经分子量5万道尔顿滤膜超滤，取5万道尔顿以下部分，再经1万道尔顿滤膜超滤，取1万道尔顿以上部分，得20ml浓缩液，过SephadexG75层析柱，用美国贝克曼Du-6紫外可见光分光光度计检测，280nm波长，取蛋白质部分。得80mlIL-2协同剂。CTLL细胞MTT法测IL-2活性为3800单位/ml，除菌，4000单位/支，分装，4℃保存。
临床病例刘××，女，54岁，住院号35243。临床诊断卵巢癌术后Ⅲ期，盆腹腔广泛转移，腹水，左卵巢超新生儿头大，右卵巢鹅卵大。1990年2月8日行全宫双附件大网切除术。术前、后化疗三个疗程，疗效不佳。转移瘤及腹水有增无减。多次放腹水，每次4000-6000ml血性腹水，送省肿瘤研究所制备腹水TIL细胞。1990年6月23日回输IL-2协同剂体外培养的TIL细胞15ml。加IL-2协同剂20，000单位。1990年6月26日腹腔注射IL-2协同剂32，000单位，每日肌注IL-2协同剂4000单位共20次。疗效观察下腹部包块(转移瘤)由10×12cm减少为9×11cm(仅一次回输，IL-2协同剂培养的TIL细胞)。腹水增长速度明显减慢。用IL-2协同剂前16天，平均每天腹围增加0.75-1cm，用药后14天平均每天腹围增长减为0.67-0.68cm。此例证明IL-2协同剂(羊脾)仅一次回输TIL细胞，即能使转移瘤包块较明显缩小，减慢腹水增生速度，药物副作用观察腹腔注射及肌内注射无过敏反应，无发烧，无肝肾损伤。
实施例4羊血淋巴细胞制备IL-2为主的协同剂采取新鲜羊血(经严格检疫)500ml，0.01%肝素抗凝。庆大霉素100单位/ml，红霉素1mg/ml(先用5%葡萄糖溶解)。2000转/分，离心30分钟，其血浆层加5倍生理盐水，2000转/分，离心30分钟，收集淋巴细胞待用。其白细胞层，以13加淋巴细胞分离液，淋巴细胞分离液先放于离心杯下部，然后将白细胞液重层于其上，2000转/分，30分钟，取梯度离心的淋巴细胞层，加5倍体积生理盐水2000转/分，离心15分钟，取淋巴细胞沉渣，与前述梯度离心收获的淋巴细胞合并，加一倍生理盐水洗一次。计数淋巴细胞数。以RPMI1640培养基稀释淋巴细胞为5×106/ml，加庆大霉素100u/ml，红霉素1mg/ml(先用5%葡萄糖2ml溶解/支)，加ConA20μg/ml，PHA-M1μg/ml、PHA-P1μg/ml。注入培养瓶，在CO2培养箱中5%CO2，37℃培养96小时。取培养上清，2000转/分，离心30分钟，取上清获220ml液体，用CTLL细胞MTT法测上清IL-2活性为700单位/ml。在超滤器中经分子量5万道尔顿滤膜超滤，取5万道尔顿以下部分，再经1万道尔顿滤膜超滤，取1万道尔顿以上部分，得17ml浓缩液，过SephadexG75层析柱，美国贝克曼紫外可见光分光光度计检测，280nm波长，取蛋白质部分。得47mlIL-2协同剂。CTLL细胞MTT法测IL-2活性为3900单位/ml。0.30μm滤膜除菌过滤，分装4000单位/支，4℃保存。
图1的箭头所指是本申请人作的天然白细胞介素活性峰部分;图2的上部箭头所指是牛血清的蛋白峰(分子量7万道尔顿)，下部箭头所指是德国进口标准重组白细胞介素-2峰。
权利要求
1.猪羊血脾制抗人癌天然白细胞介素，取新鲜经检疫的猪脾、羊脾，抑菌、无菌操作制成细胞悬液或新鲜经检疫的猪、羊的抗凝血，抑菌；经分离淋巴细胞，加培养基、丝裂原，细胞培养24-96小时，细胞培养上清液，经纯化、取分子量1万-5万道尔顿蛋白质部分，除菌，制成水针剂或冻干粉针剂。
2.根据权利要求1所述的猪羊血脾制抗人癌天然白细胞介素，其特征在于经检疫新鲜的猪脾立即放入抗菌素溶液中;分离淋巴细胞按5×106/ml浓度以RPMI1640培养基稀释细胞，加植物血凝素PHA-M1μg/ml，PHA-P1μg/ml，ConA(刀豆蛋白)20μg/ml;细胞培养48小时，培养上清经纯化，取5万道尔顿以下，1万道尔顿以上的分子量的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的猪羊血脾制抗人癌天然白细胞介素，其特征在于采取新鲜猪血，分离淋巴细胞，加ConA(刀豆蛋白)20μg/ml，PHA-M1μg/m，PHA-P1μg/ml，细胞培养72小时，培养上清经纯化，取分子量1万道尔顿至5万道尔顿的蛋白质。
4.根据权利要求1所述的猪羊血脾制抗人癌天然白细胞介素，其特征在于取新鲜羊脾，分离淋巴细胞，加植物血凝素PHA-M1μg/ml、PHA-P1μg/ml、ConA(刀豆蛋白)20μg/ml，细胞培养48小时，培养上清经纯化，取分子量1万道尔顿至5万道尔顿的蛋白质。
5.根据权利要求1所述的猪羊血脾制抗人癌天然白细胞介素，其特征在于取新鲜羊血，分离淋巴细胞，加ConA20μg/ml、PHA-M1μg/ml、PHA-P1μg/ml，细胞培养96小时，培养上清经纯化，取分子量1万道尔顿至5万道尔顿的蛋白质。
全文摘要
猪羊血脾制抗人癌天然白细胞介素是涉及以猪羊血、脾制取IL-2为主协同剂抗人癌的生物药品的生产方法，本发明的要点是取新鲜猪脾、羊脾无菌操作制成细胞悬液或新鲜猪、羊的抗凝血，抑菌，再经分离淋巴细胞，加丝裂原、细胞培养、纯化，取分子量1万—5万道尔顿蛋白质部分，制成水针剂或冻干粉剂。本发明系用高科技细胞工程方法生产高效抗癌剂，具有廉价、经济效益高，多因子协同作用，药源丰富，便于批量生产的特点。
文档编号C07K19/00GK1060785SQ90106410
公开日1992年5月6日 申请日期1990年10月26日 优先权日1990年10月26日
发明者张启明, 梁伟, 孙铁民 申请人:辽宁省肿瘤研究所