专利名称：干燥转谷氨酰胺酶组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及转谷氨酰胺酶组合物，具体地讲是凝血因子XIII的稳定的冻干或喷 雾干燥组合物，而且还涉及制备所述组合物的方法、复溶溶液、药物组合物以及治疗方法。
背景技术：
转谷氨酰胺酶是Ca2+依赖性酶，该酶催化蛋白质中的谷氨酰胺侧链Y -甲酰胺基 与赖氨酸侧链ε-氨基之间形成异肽键。转谷氨酰胺酶存在于细胞外和细胞内。转谷氨酰 胺酶的实例包括因子XIII、表皮转谷氨酰胺酶、II型转谷氨酰胺酶(组织型转谷氨酰胺酶、 肝转谷氨酰胺酶)和I型转谷氨酰胺酶(角质形成细胞转谷氨酰胺酶)。凝血因子XIII (FXIII)是血浆转谷氨酰胺酶，亦称为“血纤维连接酶”和“血纤蛋 白稳定因子”，其在血浆中的循环浓度为20微克/ml。该蛋白质在血浆中以由两个A亚基和 两个B亚基组成的四聚体(A2B2)存在。每个亚基的分子量约为SOOOODa，整个蛋白质的分 子量约为330000Da。A亚基含有转谷氨酰胺酶催化部位，而B亚基没有催化活性，但是却起 着结构蛋白的作用，保护A亚基不被清除。因子XIII的活化取决于凝血酶和Ca2+。凝血酶在A亚基Arg37的C端侧切割，从 而释放出活化肽(A亚基的残基1-37)和B亚基，留下活性形式的A2 二聚体。活化的FXIII A2亚基(FXIIIa)是FXIII的催化活性形式。FXIII酶是凝血级联中被激活的最后一个酶，其作用是使α -血纤蛋白链与γ-血 纤蛋白链交联，形成对血纤蛋白溶解的抗性提高的更牢固的凝块。此外，多种抗纤维蛋白溶 解、促止血和黏附蛋白交联成凝块，因此提供牢固的血纤蛋白结构，该结构对纤维蛋白溶酶 和其它蛋白水解酶溶解的机械阻力增强。在许多情况下，市售可得的纯或部分纯的转谷氨酰胺酶或因子XIII制品含有添 加的稳定剂，例如人血清白蛋白(HSA)。蛋白质稳定剂的使用尚有疑问，因为当给予患者时， 其降低蛋白质比活，增加蛋白质负荷，并且可能干扰纯度评价。还可能使蛋白质制品产生免 疫原性。蛋白质稳定剂的这些缺点使得它们特别不利于稳定非常纯的蛋白质(例如重组蛋 白)。另外，当加入例如白蛋白时，蛋白质稳定剂的使用可能会造成被病毒抗原污染。自胎盘或血浆分离FXIII或者新鲜冰冻血浆形式的FXIII多年来一直被用来治疗 因子XIII缺陷症。然而，这些制剂受含有外源蛋白质的缺点以及与之相连的所有问题(例 如不利的免疫原性)所困。目前可采用重组DNA技术来制备转谷氨酰胺酶和因子XIII。本文所使用的rFXIII 是指重组因子XIII。然而迄今为止，市场上尚无市售的rFXIII产品。用于治疗的蛋白质制品中的组合物和活性必须在相对较长的时间内处于稳定。在 溶液中几乎不能达到这种稳定性，因此，这类产品通常以干燥状态销售。适度的冷冻干燥 (冻干)是将这类产品干燥的精选方法之一。然而，即使当采用这种方法时，也难以得到满 足完整性和持久性需要的稳定制品。例如，转谷氨酰胺酶或因子XIII溶液的冷冻干燥可能导致活性明显下降以及纯 度损失。例如，冷冻干燥的因子XIII的另一个问题是由因子XIII的降解产物造成的，因子XIII的降解产物即所谓的非蛋白酶水解活化型(FXIIIa。)，亦称为前激活因子XIII。一般 认为FXIIIa。会出现严重的毒性风险，注射FXIIIa。可能引起潜在的不良副作用。因此， 需要使转谷氨酰胺酶或因子XIII制剂稳定以免形成非蛋白酶水解活化产物。本领域已知各种干燥FXIII组合物。下面公开的是冻干FXIII组合物的公开内 容的实例。W02002/36155披露了可以用ImM EDTA、IOmM甘氨酸、2%蔗糖的水溶液，或者用 20mM组氨酸、3% (重量/体积)蔗糖、2mM甘氨酸和0.01% (重量/体积)聚山梨醇酯(pH 8.0)来制备冻干FXIII组合物。US 6204036 (Aventis Behring)涉及稳定的冻干转谷氨酰 胺酶制剂，所述制剂包含至少一种选自D-氨基酸和L-氨基酸及其盐、衍生物、类似物和二 聚体、糖和糖醇、表面活性成分和还原剂的添加剂，前提条件是添加剂不是甘氨酸，也不是 精氨酸，其中所述制剂不含蛋白质稳定剂，且其中所述制剂在适用于胃肠外给药的含水溶 剂中是溶解的，并无任何浊度。然而，上述这些制剂可能受上述高水平非蛋白酶水解活化的因子XIII的缺点所 困，一般认为这有碍于这些制剂的临床和商业可行性。因此显而易见的是，非常需要具有低 水平非蛋白酶水解活化产物的稳定的干燥转谷氨酰胺酶和因子XIII制剂。而且，这类制剂 不需要添加蛋白质稳定剂，例如HSA。发明概述本发明基于出乎意料的发现，即就纯度和前激活转谷氨酰胺酶的形成而言，盐 (例如一价盐)对干燥转谷氨酰胺酶(例如因子XIII)组合物具有明显的稳定效应或作用。 这种效应是干燥状态特有的，并且对于生产稳定的商品特别重要。在一个方面，本发明提供干燥转谷氨酰胺酶组合物，所述组合物可通过将含水组 合物冻干或喷雾干燥而获得，所述含水组合物包含转谷氨酰胺酶、盐和至少一种另外的选 自糖、氨基酸和缓冲液的组分，其中含水组合物中盐的浓度范围为5-100mM。在又一个方面，本发明提供制备所述干燥转谷氨酰胺酶组合物、复溶溶液、药物组 合物的方法以及治疗方法。本发明的其它目的、特征和优势从下面的发明详述来看是显而易见的。然而，应当 了解的是，发明详述和具体实施例虽然提供本发明的优选实施方案，但只是通过实例给出， 因为从发明详述来看，本发明的精神和范围内的各种变动和修改对于本领域技术人员是显 而易见的。附图描述
图1 蔗糖和NaCl水平的评价。25mM NaCl对保存于40°C的样品的AIE-HPLC纯 度的作用的Modde分析。图2 =NaCl和组氨酸水平的全析因研究。25°C rFXIIIa。数据的Modde分析。图3 =NaCl和组氨酸水平的全析因研究。AIE-HPLC纯度数据的Modde分柝。定义本发明的术语“前激活”或“非蛋白酶水解活化”转谷氨酰胺酶是指不是蛋白 酶水解激活的转谷氨酰胺酶，例如当因子XIII在凝血酶(凝血酶具有蛋白水解切割 FXIII的能力)不存在时被激活，便被称为非蛋白酶水解活化；有关参考文献可参见例 如 Polgar J.等，Biochem J 1990;267:557-60。 Muszbek L.等，Thrombosis Research 94(1999)271-305。作为FXIII的降解产物的非蛋白酶水解活化因子XIII (FXIII。)不利于FXIII药物组合物的效力(viability)，因为一般认为这种降解产物会出现严重的毒性 风险。本文使用的术语“生物活性”是指在生物中具有活性，例如医学活性、农业活性或 美容活性。本发明的术语“含水组合物”是指包含液体水分的组合物。这类组合物通常是溶 液或悬浮液。用于本发明内容的术语“含水组合物”是指包含以重量计至少50% (重量/ 重量)的水的制剂。本发明的术语“稀释剂”是指液体溶液或悬浮液。用于本发明内容的术语“稀释剂” 是指包含以重量计至少50% (重量/重量)水的溶液或悬浮液。在本发明的情况下，稀释 剂用于干燥转谷氨酰胺酶组合物的复溶。所有参考文献，包括本文引用的出版物、专利申请和专利都通过引用其整体特此 结合，其程度与每个参考文献单独而具体指明通过引用结合一样，并以其整体列举在本文 中(至法律允许的最大程度)。所有标题和副标题在本文中仅出于方便而使用，不应解释为以任何方式限制本发 明。本文提供的任何和全部实例或示例性语言(诸如“例如”)的使用，仅仅是为了更 好地说明本发明，并非对本发明的范围提出限制，除非另有要求。本说明书中的任何语言都 不应解释为表示任何非要求保护的要素是实施本发明必需的。本文对专利文件的引用和结合只是出于方便，并不反映对这类专利文件的有效 性、专利性和/或可实施性有任何观点。本发明包括适用法律所允许的随附权利要求书中所述主题的所有修改和等同内容。发明详述本发明提供转谷氨酰胺酶组合物，具体地讲是稳定的冻干或喷雾干燥的转谷氨酰 胺酶(例如凝血因子XIII (FXIII))组合物。本发明还提供制备所述干燥转谷氨酰胺酶组 合物、复溶溶液、药物组合物的方法及治疗方法。本发明提供包含转谷氨酰胺酶(例如因子XIII)的产品，其具有在整个转谷氨酰 胺酶产品的制备过程、贮存和使用期间均可接受的纯度水平和前激活水平。就前激活水平和总纯度而论，提供稳定性改进的本发明的组合物包含干燥转谷氨 酰胺酶组合物，所述组合物可通过将包含转谷氨酰胺酶、盐和至少一种另外选自糖、氨基酸 和缓冲液的组分的含水组合物冻干或喷雾干燥而获得，其中含水组合物中盐的浓度范围为 5-100mM。在一个实施方案中，本发明的干燥组合物包含干燥转谷氨酰胺酶组合物，所述组 合物可通过将包含转谷氨酰胺酶、盐和至少一种另外选自糖、氨基酸和缓冲液的组分的含 水组合物冻干或喷雾干燥而获得，其中含水组合物中盐的浓度范围为5-100mM，前提条件是 组合物不是通过将含有0. 5% NaCl和2. 25%甘氨酸的因子XIII溶液冻干而获得的干燥因 子XIII组合物。在一个实施方案中，本发明的干燥组合物不含任何蛋白质稳定剂，例如白蛋白。下述实施方案和实施例主要描述和公开了重组FXIII (rFXIII)的组合物，但是本
5发明并不限于这些实施方案和实施例，而是可适用于目前已知的或未来开发的任何转谷氨 酰胺酶的组合物。组合物的组分本发明的组合物包含转谷氨酰胺酶。可通过本发明的制剂稳定的转谷氨酰胺酶的 实例包括但不限于因子XIII、表皮转谷氨酰胺酶、II型转谷氨酰胺酶(组织型转谷氨酰胺 酶、肝转谷氨酰胺酶)和I型转谷氨酰胺酶(角质形成细胞转谷氨酰胺酶)。因子 XIII在一个实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物包含因子XIII化合物。因子 XIII化合物可以是例如天然野生型因子XIII和因子XIII的天然等位变异体。这些FXIII 化合物可以来源于例如人或其它动物源，例如人FXIII、猪FXIII和牛FXIII。人因子XIII 的野生型序列可参见例如EP沈8772和EP 236978。本发明的因子XIII化合物，包括完整 的因子XIII酶原四聚体(A2B2)和因子XIIIa及其亚基，包括A亚基和A2 二聚体。本发明的因子XIII化合物可以是例如保持至少部分野生型因子XIII特有的交联 活性的因子XIII的生物活性片段、衍生物或变体。这种交联活性可通过本领域已知方法测 定。在一些实施方案中，因子XIII的生物活性片段、衍生物或变体保持lO^JO^i、 30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^ 100%的野生型因子 XIII 的交联活性。因子XIII的片段、衍生物和变体包括取代、插入和缺失变体。插入变体包含氨基 端和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。例如，可将插入残基引入 野生型因子XIII蛋白的成熟编码序列内。缺失变体的特征在于从野生型因子XIII蛋白除 去一个或多个氨基酸残基。一般在编码蛋白质的DNA的核苷酸中通过位点专一诱变来制备 这些变体，从而产生编码变体的DNA，之后在重组细胞培养物中表达所述DNA。然而，还可以 通过体外合成制备变体蛋白质片段。虽然引入氨基酸序列变异的位点通常是预先确定的， 但是突变本身不是预先确定的。例如，为了使在指定位点的突变性能最优化，可以在目标密 码子或目标区进行随机诱变，并筛选表达蛋白质变体所需活性的最优组合。在具有已知序 列的DNA的预定位点上进行取代突变的技术是众所周知的，例如M13引物诱变。取代变体是 其中除去至少一个残基序列并在其位置上插入不同残基的变体。氨基酸取代通常为单一残 基的取代；插入一般约为1-10个氨基酸残基；缺失的范围可约为1-30个残基。例如，缺失 或插入可以相邻的一对进行，即2个残基的缺失或2个残基的插入。可以结合取代、缺失、 插入或其任何组合以得到最终的构建体。显然，将在编码变体蛋白质的DNA中产生的突变 不必把该序列置于读框外，且优选将不会产生可形成二级mRNA结构的互补区。经遗传工程 改造的因子XIII的变体的一个实例是野生型人因子XIII的Val34Leu变体(即其中野生 型人因子XIII氨基酸序列第34位的Val残基被亮氨酸残基置换的变体)。本发明的因子XIII可从多种生物材料中提纯，包括天然产生因子XIII的细胞的 裂解物、勻浆物或提取物，而且还包括通过遗传工程修饰以产生因子XIII的细胞，例如用 因子XIII编码DNA转化的酵母细胞。提纯因子XIII的方法的实例可参见W0/2006/021584。本发明的因子XIII可以通过例如重组DNA技术来制备。制备重组因子XIII的 方法是本领域已知的。参见例如Davie等，EP 268, 772 ；Grundmann等，AU-A-69896/87 ； Bishop 等,Biochemistry 1990,29 :1861-1869 ；Board 等,Thromb.Haemost. 1990,63 235-240 Jagadeeswaran 等，Gene 1990,86 :279-283 ；以及 Broker 等，FEBS Lett. 1989， 248 :105-110o在一个实施方案中，因子XIII A2 二聚体在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞质中制备，参见美国专利申请顺序号07/74U63。收获细胞后裂解，制 备澄清的裂解液。在中性到略微碱性的PH下，使用衍生化琼脂糖柱，例如DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia)等，通过阴离子交换层析法对裂解液进行分级分离。然后将洗脱 液浓缩，并通过例如用琥珀酸铵缓冲液渗滤调节PH至5. 2-5. 5，从而使因子XIII从柱洗脱 液中沉淀出。然后将沉淀物溶解，并采用常用层析技术(例如凝胶过滤和疏水相互作用层 析法)进一步纯化。在本发明的一个实施方案中，因子XIII是重组因子XIII。在本发明的一个实施 方案中，因子XIII是人因子XIII。在本发明的一个实施方案中，因子XIII是重组人因子 XIII。在本发明的一个实施方案中，因子XIII是A亚基的二聚体。在待冻干或喷雾干燥的含水组合物中，因子XIII的浓度可在例如一个大的范 围内变化，在一个实施方案中范围为0. 003-100mg/ml，在进一步的实施方案中范围为 l-30mg/ml，在更进一步的实施方案中范围为2-15mg/ml。盐本发明的含水组合物包含盐或盐的混合物。盐用来改进干燥组合物在前激活以及 总纯度方面的稳定性。本发明的稀释剂可包含例如盐或盐的混合物。在一些实施方案中，盐 为一价盐。例如，可以使用的一价盐的实例包括但不限于氯化钠、氯化钾、乙酸钠、硫酸钠、 葡糖酸钠及其混合物。在一些实施方案中，盐为二价盐。在一些实施方案中，盐为二价盐， 前提条件是二价盐不是Ca(II)盐。例如，所采用的盐(例如NaCl)的浓度可在一定范围内变化，在一个实施方案 中，范围为5-100mM，在进一步的实施方案中，范围为5-99mM、7-95mM、8-90mM、10-80mM、 15-70mM、25-75mM和20_60mM，在更进一步的实施方案中，范围为25_50mM。糖和糖醇在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物包含一种或多种糖 或糖醇。例如，用于干燥组合物复溶的稀释剂可包含一种或多种糖或糖醇。在本发明的干 燥组合物中，糖或糖醇可用于在冷冻干燥期间通过防止物理/化学失稳效应(例如解折叠) 而使蛋白质稳定。例如，可以使用的糖或糖醇的实例包括但不限于蔗糖、甘露糖、海藻糖、乳 糖、麦牙糖、山梨醇、棉子糖、糊精、环糊精及其衍生物、类似物和混合物。所使用的糖和糖醇的浓度范围可在例如大的范围变化，在一个实施方案中的范围 为0. 1-15% (重量/重量)，在进一步的实施方案中的范围为0. 1-8. 5% (重量/重量)， 在更进一步的实施方案中的范围为0. 5-5. 0% (重量/重量)。氨基酸在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物包含一种或多种氨 基酸。在本发明的一些实施方案中，用于干燥组合物复溶的稀释剂可包含一种或多种氨基 酸。例如，可以使用氨基酸以改进冻干或喷雾干燥组合物的稳定性。在一个实施方案中，使 用一种或多种氨基酸来降低组合物贮存期间转谷氨酰胺酶(例如FXIII)聚集体的形成。可 以使用的氨基酸的实例包括但不限于甘氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、 赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和半胱氨酸(Gly、HiS、Arg、Glu、Met、Thr、LyS、Ala、Ile和Cys)及其盐、衍生物、类似物、二聚体、寡聚体和混合物。合适的衍生物和类似物是众所周知的。合适的衍生物包括但不限于羧基的酯、 硫酯和酰胺；氨基的酰化衍生物，包括氨基甲酸酯衍生物；及侧链官能团的酯、酰胺和酯。 合适的类似物包括例如鸟氨酸(赖氨酸的类似物)、高丝氨酸和α-氨基丁酸。生理上可 接受的盐也是本领域众所周知的，可参见例如Remington’ s Pharmaceutical Science Drug Receptors and Receptor Theory,(第十八版.)，Mack Publishing Co. , Easton Pa. (1990)。使用的氨基酸的浓度可在例如0.01-10% (重量/重量)的范围或在0. 1-3% (重 量/重量)的范围变化。缓冲液在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于干燥组 合物复溶的稀释剂包含缓冲液。缓冲液是包含某一物质的溶液，当向该溶液中加入少量酸 或碱时，所述物质能够防止溶液的PH发生明显变化，从而在很大程度上保持溶液的原酸度 或碱度。缓冲液通常包含弱酸或弱碱及其盐。含水组合物的pH的范围可为2-10，特别介于7和8之间。上述氨基酸或pH范围 为2-10的缓冲液可用来促进缓冲效果。例如可以使用的缓冲液的实例包括但不限于乙酸 盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、甘氨酰甘氨酸缓冲液、组氨酸缓冲液、甘氨酸缓 冲液、赖氨酸缓冲液、精氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液(含有例如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠或 磷酸三钠)、TRIS [三(羟甲基)氨基甲烷]缓冲液、N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液、N-三 (羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液、苹果酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液、富马酸 盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、天冬氨酸盐缓冲液及其混合物。在一些实施方案中，使用柠檬 酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸钠缓冲液、琥珀酸盐缓冲液和TRIS缓冲液。在一个实施方 案中，使用组氨酸。所使用的缓冲液的浓度可为例如0_50mM的范围，或0_25mM的范围。其它组分还可将一种或多种其它组分掺入待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于 复溶干燥组合物的稀释剂中。这类另外的成分包括但不限于非离子型表面活性剂、还原 剂、螯合剂、抗氧化剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、填充剂、张力调节剂(tonicity modifier/ tonicity-adjusting agents)、油性溶媒、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或其它蛋白 质)和两性离子物质(例如甜菜碱、牛磺酸或氨基酸例如精氨酸、甘氨酸、赖氨酸或组氨 酸)。当然，这类另外的成分不应对本发明的含水组合物或干燥组合物的总体稳定性产生 不利景i响。在这方面，可参照 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。非离子型表g活+ 牛齐Il在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶干 燥组合物的稀释剂包含非离子型表面活性剂。离子型表面活性剂是通过屏蔽蛋白质的临界 面(例如包裹、固体(solids))而起作用的表面活性剂，可以使用离子型表面活性剂例如改 进冻干或喷雾干燥组合物的稳定性。例如，可以使用的非离子型表面活性剂的实例包括但 不限于吐温80、吐温20、PEG、鲸蜡醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、失水山梨醇单油酸酯、泊洛沙姆和聚氧乙烯烷基醚。在一个实施方案中，使用吐温20。例如，所使用的非离子型表面活性剂的浓度可为0.00001-5% (重量/重量)的范 围，或0.0002%和0. (重量/重量)的范围。还原布丨在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶干 燥组合物的稀释剂包含还原剂。使用还原剂(例如抗氧化剂)以除去可破坏蛋白质稳定的 自由基。可以使用的还原剂的实例包括但不限于半胱氨酸、N-乙酰基-半胱氨酸、硫代甘 油、硫化钠、生育酚和谷胱甘肽。螯合剂在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶干 燥组合物的稀释剂包含螯合剂。螯合剂用于除去制剂中的金属(铁、铜)，并且通常有助于 保护蛋白质免受金属催化的反应。例如，可以使用的螯合剂的实例包括但不限于EDTA的 盐、柠檬酸和天冬氨酸及其混合物。在本发明的一个实施方案中，螯合剂的浓度为0. lmg/ml 到5mg/ml。在本发明的一个实施方案中，螯合剂的浓度为0. lmg/ml到ang/ml。在本发明 进一步的实施方案中，螯合剂的浓度为ang/ml到5mg/ml。抗氧化剂在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶干 燥组合物的稀释剂包含抗氧化剂。在一个实施方案中，含水组合物包含甲硫氨酸(或另一 种含硫氨基酸或氨基酸类似物)，当转谷氨酰胺酶(例如FXIII)是包含至少一个易于氧化 成其亚砜形式的甲硫氨酸残基的多肽时，抑制甲硫氨酸残基的这类氧化。术语“抑制氧化” 是指氧化类物质(甲硫氨酸)随时间的积累最小化。甲硫氨酸氧化的抑制导致多肽更多地 保持其适当的分子形式。例如，可以使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L、D或DL异构体) 或其组合。待添加的量应为足以抑制甲硫氨酸残基氧化的量，使得甲硫氨酸的亚砜形式的 量是管理机构可接受的。这通常意味着组合物含有约10% -约30%以内的甲硫氨酸亚砜 形式。这一般可通过例如按致使加入的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的摩尔比为约1 ι-约 1000 1、例如10 1-约100 1的范围的量加入甲硫氨酸来实现。防腐剂在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶干 燥组合物的稀释剂包含防腐剂。可按管理机构对多剂量容器内容物的要求加入防腐剂。防 腐剂被用作抗微生物剂，以免在从小瓶中抽取多剂量时受微生物污染。例如，可使用的防腐 剂的实例包括但不限于苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、氯甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基 苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯氧乙醇、2-苯基乙醇、苯甲醇、三 氯叔丁醇、硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑烷脲、氯己定(chlorohexidine)、脱氢醋酸钠、 苄索氯铵、氯苯甘醚(3-对氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)及其混合物。例如，防腐剂的浓度为 0. lmg/ml到20mg/ml。在本发明的一个实施方案中，防腐剂的浓度为0. lmg/ml到5mg/ml。 在本发明进一步的实施方案中，防腐剂的浓度为5mg/ml到10mg/ml。在本发明另一个实施 方案中，防腐剂的浓度为10mg/ml到20mg/ml。本领域的技术人员能够使用下述方法，仅用常规实验方法便能分析本发明的干燥 组合物或含水组合物中一种或多种添加组分对稳定性、前激活和纯度的作用。
干燥组合物-粉末在冻干或喷雾干燥后，本发明的组合物为干燥形式。例如，本发明的干燥组合物可 以为固体、粉末或粒状物。在一个实施方案中，本发明的干燥组合物为粉末。在贮存期间，该 干燥组合物中残留水分的水平对干燥转谷氨酰胺酶(例如FXIII)的稳定性十分重要。在 本发明的一个实施方案中，干燥组合物含有3%以下的残留水分。在进一步的实施方案中， 干燥组合物含有以下的残留水分。干燥技术和复溶本发明的含水组合物的冻干和喷雾干燥可以采用本领域技术人员熟知的冻干和 喷雾干燥方法进行有关冻干法参见例如Williams和Polli (1984)，J. Parenteral Sci. Technol. 38 :48_59。有关喷雾干燥法参见例如Masters，载于 Spray-Drying Handbook (第 5 版；Longman Scientific and Technical,Essex,U. K. , 1991),第 491-676 页；Broadhead等 (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18 :1169-1206 ；以及 Mumenthaler 等(1994) Pharm. Res. 11 12-20。还可采用其它干燥技术，例如风干,参见Carpenter和Crowe (1988)，Cryobiology 25 :459-470 ；以及 Roser (1991) Biopharm. 4 :47_53。至于本发明，当提及冻干和喷雾干燥时，还包括可以采用的其它干燥技术。例如， 本发明的表述“待冻干或喷雾干燥的含水组合物”也包括“待用其它干燥技术干燥的含水组 合物”。在一个实施方案中，本发明的干燥组合物通过冻干获得。冻干方法通常包括下列 步骤冷冻步骤、初步干燥步骤和再次干燥步骤。在冷冻步骤中，使含水组合物冷却。选择 这类冷冻步骤的温度和持续时间，使得组合物中的所有组分完全冻结。例如，合适的冷冻温 度约为-40°C。在初步干燥步骤中，在低温下真空升华除去冷冻期间结的冰。例如，用于升 华的内腔压力可为例如约40mTorr-400mTorr，温度可为例如_30°C至_5°C之间。在初步干 燥后，未能通过升华除去的任何残留量的液体都通过再次干燥(即解吸)除去。在再次干 燥期间，温度接近或大于环境温度。在本发明的一个实施方案中，在冻干期间的冷冻步骤中引入退火处理 (annealing)(加热步骤)。这种加热使得温度在制剂的冷冻点以下。这种退火(加热步 骤)可进一步使本发明的干燥组合物稳定。复溶在需要时，例如当给予患者转谷氨酰胺酶(例如FXIII)时，本发明的干燥组合物 可用稀释剂复溶。复溶一般在25°C左右的温度下进行，以确保完全水合，但是需要时可采用 其它温度。复溶所需时间将取决于例如稀释剂的类型以及转谷氨酰胺酶和其它组分的量。在本发明的一个实施方案中，稀释剂是蒸馏水。例如，使用蒸馏水可具有优势，因 为不需要制备单独定制的稀释剂。在本发明的一个实施方案中，稀释剂是乙醇。在本发明的一个实施方案中，稀释剂例如可包含一种或多种组分，例如盐、糖、氨 基酸、缓冲液、非离子型表面活性剂、还原剂、螯合剂、抗氧化剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、填 充剂、张力调节剂、油性溶媒、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或其它蛋白质)和两性离子 物质。稀释剂包括的组分和这些组分的量取决于通过这些组分要达到的理想效果。稀释剂 的实例包括但不限于注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸缓冲盐溶液)、无菌盐溶液和葡萄糖溶液。复溶溶液中蛋白质浓度为至少5mg/ml，例如约10mg/ml-约400mg/ml、约20mg/ ml-约200mg/ml或约30mg/ml_约150mg/ml。如果从皮下递送复溶溶液，则复溶溶液中的 高蛋白质浓度被视为是特别有益的。然而，对于其它给药途径，例如静脉内给药，在复溶溶 液中可能需要较低的蛋白质浓度(例如复溶溶液中的蛋白质约5-50mg/ml或约10_40mg/ ml)。在某些实施方案中，复溶溶液中的蛋白质浓度比预干燥制剂中的显著较高。例如，复 溶溶液中的蛋白质浓度可以是预干燥含水组合物的约2-40倍、3-10倍和/或3-6倍(例如 至少3倍或至少4倍)。在本发明的一个实施方案中，例如包含因子XIII的干燥转谷氨酰胺酶组合物贮 存3年以上是稳定的，且复溶溶液使用6周以上是稳定的。在本发明的一个实施方案中，例 如包含因子XIII的干燥转谷氨酰胺酶组合物贮存2年以上是稳定的，且复溶溶液使用4周 以上是稳定的。在本发明的一个实施方案中，例如包含因子XIII的干燥转谷氨酰胺酶组合 物贮存1年以上是稳定的，且复溶溶液使用2周以上是稳定的。在本发明的一个实施方案 中，不超过的复溶因子XIII组合物是非蛋白酶水解活化因子XIII。在本发明的一个实 施方案中，不超过0.5%的复溶因子XIII组合物是非蛋白酶水解活化因子XIII。示例件变化方案表1和表2是本发明的示例性变化的非限制性表。表1 示例性变化的非限制性列表
1权利要求
1.一种干燥转谷氨酰胺酶组合物，所述组合物可通过将含水组合物冻干或喷雾干燥获 得，所述含水组合物包含转谷氨酰胺酶、盐和至少一种选自糖、氨基酸和缓冲液的另外的组 分，其中含水组合物中的盐浓度为5-100mM。
2.权利要求1的组合物，其中因子XIII化合物是人因子XIII。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述盐是一价盐。
4.权利要求3的组合物，其中所述一价盐是氯化钠盐。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中含水组合物中所述盐的浓度为10-75mM。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述组合物为粉末形式。
7.一种制备权利要求1-6中任一项的干燥组合物的方法，所述方法包括将包含转谷氨 酰胺酶、盐和至少一种选自糖、氨基酸和缓冲液的另外的组分的含水组合物干燥，其中含水 组合物中的盐浓度为5-1 OOmM。
8.权利要求7的方法，其中所述方法用于生产因子XIII组合物，所述组合物在复溶后 包含不超过的非蛋白酶水解活化的因子XIII。
9.包含转谷氨酰胺酶的复溶溶液，其中所述溶液通过将权利要求1-6项中任一项的干 燥组合物用稀释剂复溶制得。
10.权利要求9的溶液，其中不超过的所述因子XIII化合物是非蛋白酶水解活化 的因子XIII。
11.一种药物组合物，其包含权利要求10-11中任一项的溶液或权利要求1-6中任一项 的干燥组合物。
12.—种以干燥形式贮存使转谷氨酰胺酶组合物稳定的方法，使得非蛋白酶水解活化 的转谷氨酰胺酶的水平占在复溶后立即测得的转谷氨酰胺酶总含量的1 %以下，其中所述 稳定效果的实现在于将包含转谷氨酰胺酶、盐和至少一种选自糖、氨基酸和缓冲液的另外 的组分的含水组合物干燥，其中含水组合物中的盐浓度为5-100mM。
13.权利要求12的方法，其中所述转谷氨酰胺酶组合物是一种因子XIII组合物。
全文摘要
本发明涉及干燥转谷氨酰胺酶组合物，所述组合物可通过将包含转谷氨酰胺酶、盐和至少一种另外的选自糖、氨基酸和缓冲液的组分的含水组合物冻干或喷雾干燥而获得，其中含水组合物中盐的浓度范围为5-100mM。在进一步的方面，本发明涉及制备所述干燥转谷氨酰胺酶组合物的方法、复溶溶液、药物组合物以及治疗方法。
文档编号C12N9/10GK102065844SQ200980124151
公开日2011年5月18日 申请日期2009年4月20日 优先权日2008年4月21日
发明者G·K·克里斯琴森, M·布拉德, T·法尔克 申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司