专利名称：：特异性提高的转谷氨酰胺酶变体的制作方法
技术领域：
：本发日月^步及来自^立达卡l仓斗支链霍菌(5Vrepfove/Y/cz'〃/wm/"t/aA:a"ww)的新型转谷氨酰胺酶变体。所述变体可以用于以提高的选择性在指定的谷氨酰胺残基处位点特异性地修饰肽。
背景技术：
：通过在蛋白上缀合能恰当改变肽的性质的基团而改变所述肽的性质和特征是公知的。尤其是对于治疗用肽而言，可能期望甚至必要的是在所述肽上缀合基团，这可以延长所述肽的半衰期。典型地，这些缀合基团是聚乙二醇(PEG)、葡聚糖或脂肪酸-参见J.Biol.Chem.271,21969-21977(1996)。转谷氨酰胺酶(TGase)先前已用于改变肽的性质。在食品工业，尤其是在乳制品工业中，许多技术可供使用例如采用TGase使肽交叉结合(crossbind)。其它文献公开了TGase改变生理活性肽性质的应用。EP950665、EP785276和Sato,Adv.DrugDeliveryRev.M,487-504(2002)公开了在存在TGase时，含有至少一个Gin的肽和胺官能化PEG或者类似配体的肽之间的直接反应，Wada在Biotech.Lett.21,1367-1372(2001)中公开了利用TGase直接将P-乳球蛋白与脂肪酸缀合，以及Valdivia在J.Biotechnol.巡，326-333(2006)中才艮道了TGase催4b过氧化氬酶的位点特异性糖苦化。WO2005070468/>开了TGase可用于将官能团引入含有谷氨酰胺的肽从而形成官能化的肽，而该经过官能化的肽在随后的步骤中可与诸如能够与所述官能化的肽进行反应的PEG进行反应从而形成聚乙二醇化的肽。转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)也已知为蛋白质-谷氨酰胺-"谷氨酰转移酶，并催化以下通用反应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中Q-C(O)-NH2可表示含有谷氨酰胺的肽，而Q，-NH2则表示胺供体，在以上讨论的反应中提供将被引入到所述肽中的官能团。体内常见的胺供体是与肽结合的赖氨酸，而上述反应则提供了肽的交叉结合。凝血因子因子XIII(FactorXIII)是在受伤后能实现血液凝块的转谷氨酰胺酶。不同的TGase相互之间也存在差别，例如，在Gin周围什么氨基酸对于蛋白质成为底物是必需的方面存在差别，即根据邻近所述Gin残基的是什么氨基酸残基，不同的TGase将利用不同的含有Gln的肽作为底物。如果待修饰的肽含有多个Gin残基，则该方面可以得到利用。如果仅仅希望在所存在Gin残基中的一部分上选择性地缀合肽，则通过选择仅仅接受相关Gin残基作为底物的TGase可实现该选择性。人类生长激素(hGH)含有13个谷氨酰胺残基，因此任何TGase介导的hGH的缀合都潜在地受到低选择性的妨碍。以前已经描述，在hGH上的13个谷氨酰胺(Gln)残基中，2个(Q141和Q40)谷氨酰胺在TGase催化下是反应性的(W02006/134148)。因此需要鉴定TGase，其能够更特异性地介导hGH官能化。
发明内容现在已经确定，来自#立达卡4仑斗支链霉菌(S&e/tover"cz〃zww/"Ja^mww)的mTGase(术i吾mTGase用于表示樣吏生物表达的TGase,其中从所述微生物分离所述TGase)(来自拉达卡轮枝链霉菌(S./"t/"b聽w)的mTGase可以缩写为mTGase-SL)具有甚至更高的位点特异性(也称作选一奪性)，是来自茂原链霉菌(S^印fomyc^wM"rae似&)的mTGase的2倍。在一个实施方案中，本发明涉及分离的肽，其包含与SEQIDNo.1中的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，其中所述序列在与SEQIDNo.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250对应的一个或多个位置处被修饰。在一个实施方案中，本发明涉及构建体，其编码本发明的肽。在一个实施方案中，本发明涉及载体，其含有编码本发明的肽的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及含有载体的宿主，其中所述载体含有编码本发明的肽的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及组合物，其含有本发明的肽。在一个实施方案中，本发明涉及缀合hGH的方法，所述方法包括在存在本发明的肽时，使hGH与胺供体进行反应。图1显示了来自茂原链霉菌(5^，謹yces膨6arae腦j)的mTGase和来自拉达卡轮枝链霉菌(5Yr，oveW"'〃z'騰/at/a^m廳)的mTGase的序列的序列比对。图2A空白反应含有1,3-二氨基(dimanino1)丙醇的野生型hGH。没有加入mTGase。图2B.来自茂原链霉菌(S.OTo6"rae朋&)的AlaPro-mTGase。反应时间=30分钟；选择性=5.7;转化率=32%图2C.GlyPro-mTGase-SL;反应时间二15m;选择性=10.31;hGH转化率=55%。图2D.GlyPro-mTGase—Y75A-SL;反应时间二300m;选择性=17.33;hGH转化率=40%。图2E.GlyPro-mTGase—Y75F-SL;反应时间-75m;选择性=20.94;hGH转化率=33%。图2F.GlyPro-mTGase—Y75N-SL;反应时间二90m;选择性=15.66;hGH转化率=50%。图2G.GlyPro-mTGase—Y62H—Y75N-SL;反应时间二75m;选择性=26.33;hGH转4匕率=38%。图2H.GlyPro-mTGase—Y62H—Y75F-SL;反应时间^20m;选择性=36.21;hGH转化率=49.4%图3.通过HPLC分析由拉达卡轮枝链霉菌(S./^/d"鼎m)TGase催化的hGH突变体的反应混合物。上面hGH-Q40N。第一个峰(26.5mm,面积1238)是产物-Q141,第二个峰(29.7min,面积375)是剩余的hGH-Q40N。下面hGH-Q141N。第一个峰(19.2mm,面积127)是产物-Q40,第二个峰(30.3mm,面积1158)是剩余的hGH-Q141N。图4.通过HPLC分析由茂原链霉菌(Xwok/rae朋&)TGase催化的hGH突变体的反应混合物。上面hGH-Q40N。第一个峰(26.9mm,面7积1283)是产物-Q141，第二个峰(30.1min,面积519)是剩余的hGH-Q40N。下面hGH-Q141N。第一个峰(19.5mm,面积296)是产物-Q40,第二个峰(30.6min,面积1291)是剩余的hGH-Q141N。图5:来自表5的转氨基混合物3和4的CIEHPLC。峰1=hGH,峰2-在位置40转氨基，峰3=在位置141转氨基，峰4=在位置40/141转氨基。发明的描述本发明提供了具有TGase活性的肽，该肽比对hGH中的Gln40对hGH中的Glnl41具有得到提高的选择性，更具体地，本发明涉及与hGH的Gln-40相比，对hGH的Gln-141具有特异性的转谷氨酰胺酶肽，这高于具有SEQIDNo.1所示氨基酸序列的肽与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性。术语"多肽"和"肽"在本文中可互换使用，用于指由通过肽键连接的至少5个构成氨基酸组成的化合物。构成氨基酸可以来自由遗传密码编码的氨基酸，它们可以是非由遗传密码编码的天然氨基酸，以及合成氨基酸。非由遗传密码编码的天然氨基酸是例如羟脯氨酸，y-羧基谷氨酸盐，鸟氨酸，磷酸丝氨酸，D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包含通过化学合成生产的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸，Aib(a-氨基异丁酸)，Abu(a-氨基丁酸)，Tie(叔丁基甘氨酸)，P-丙氨酸，3-氨基甲基苯曱酸和邻氨基苯曱酸。术语"缀合"作为名词是指经修饰的肽，即含有与之结合以修饰所述肽性质的部分(moiety)的肽。作为动词，该术语指4吏部分(moiety)与肽结合以修饰所述肽性质的过程。在本文中，"具有TGase活性的肽"或"转谷氨酰胺酶"或类似术语的意思是能催化谷氨酰胺残基的Y-羧酰胺基团与作为胺供体的各种伯胺之间的酰基转移反应的肽。在本文中，"转氨基"，"转谷氨酰化"，"转谷氨酰胺酶反应"或类似术语是指这样的反应，其中来自蛋白质/肽的谷氨酰胺残基的r谷氨酰基被转移至伯胺或赖氨酸的s-氨基或水(此时释放出氨水分子)。在本文中，术语"特异性"和"选择性"可互换地用于描述与hGH中的其它特定谷氨酰胺残基相比，TGase与hGH中的一个或多个特定谷氨酰胺残基反应的偏好。为了本说明书的目的，根据实施例所述测试肽的结果，确定与hGH中的Glnl41相比本发明肽对Gln-40的特异性。本发明的肽可以用作用于对肽(诸如hGH)进行转谷氨酰化的转谷氨酰胺酶。肽的转谷氨酰化例如可以用于例如制备在WO2005/070468和WO2006/134148中描述的所述肽的缀合物。使用hGH作为实例制备缀合的肽的一种方法包括hGH和含有官能团的胺供体之间的第一步反应，以提供官能化的hGH,所述第一步反应由TGase介导(即催化)。在第二步反应步骤中，所述官能化的hGH进一步和例如能够与所述被引入的官能团进行反应的PEG或脂肪酸进行反应，从而提供缀合的hGH。所述第一步反应概述如下。X表示官能团或者潜在的官能团，即在进一步反应例如氧化或者水解之后被转变为官能团的基团。微生物茂原《连霉菌(S.wo6arae朋M)也^皮分类为茂原链霉菌(S/re/^oveWz.cz'〃z'wmmoZ^rae/we)。可以从"i玄生物分离TGase,且i亥TGase的特征在于相对低的分子量(38kDa)和钓不依赖性。来自茂原链霉菌(S.mo^rae朋^)的TGase4皮相对充分地描述；例如已经分析了晶体结构(US156956;Appl.Microbiol.Biotech.447-454(2004》。当上述反应由源自茂原链霉菌(iSVr，om少cesw06(2rae腦'5)的TGase介导时，hGH和H2N-X(胺供体)之间的反应主要发生在Gln-40和Gln-141。可采用上述反应用来例如聚乙二醇化hGH,以获得半衰期延长的治疗性生长激素产品。由于通常希望治疗性组合物为单化合物组合物，因此以上讨论的特异性的缺乏要求再一步的纯化步骤，其中将Gln-40官能化的hGH与Gln-141官能化的hGH和/或Gln-40/Gln-141双官能化的hGH彼此分离。转谷氨酰胺酶的用于缀合人生长激素的这种应用广泛描述在WO2005簡468、WO2006/134148、WO2007/020291和WO2007/020290中。除了2个序列之间的总共22个氨基酸差异以外，从拉达卡轮枝链霉菌(S./a^^mi/w)分离的TGase的序列具有与来自茂原链霉菌(mo6araem^)的序歹'J相同的氛基酸序歹寸(Yi-SinLin等，ProcessBiochemistry鹏)，591-598(2004)。在SEQIDNo.1中给出了来自拉达卡轮枝链霉菌(&/^faf^"wm)的mTGase的序列，在SEQIDNo.2中给出了来自茂原链霉菌(mo6araera^s")的mTGase的序歹寸。本发明的肽与hGH的Gln-40相比对Gln-141具有特异性，这显著高于具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的肽与Gln-40相比对Gln-141的特异性，其中按照实施例所述测量所述特异性。本发明的肽因而可以用于转谷氨酰化hGH的方法中，用于与使用具有SEQIDNo.2的氨基酸序列的TGase的反应相比，增加Gln-40官能化的hGH或Gln-141官能化的hGH的产量。因而，在一个实施方案中，本发明的转谷氨酰胺酶肽具有与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性，这高于具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的肽与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性。在一个实施方案中，本发明的肽与Gln-40相比对Gln-141的特异性是具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的肽与Gln-40相比对Gln-141的特异性的至少1.25倍，例如至少1.50倍，例如至少1.75,例如至少2.0倍，例如至少2.5倍，例如至少3.0倍，例如至少3.5倍，例如至少4.CM咅，例如至少4.5倍，例如至少5.(H咅，例如至少5.5^[咅，例如至少6.(H咅，例如至少6.5倍，例如至少7.0倍，例如至少7.5倍，例如至少8.0倍，例如至少8.5倍，例如至少9.0倍，例如至少9.5倍，例如至少10.0倍。在一个实施方案中，本发明的转谷氨酰胺酶肽具有与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性，这高于具有SEQIDNo.1所示氨基酸序列的肽或具有SEQIDNo.1所示氨基酸序列且在N-末端添加Ala-Pro10的肽与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性，因为具有SEQIDNo.1所示氨基酸序列且在N-末端添加Ala-Pro的肽具有与具有SEQIDNo.1所示氨基酸序列的肽相同的特异性(参见实施例)。在一个实施方案中，本发明的肽与Gln-40相比对Gln-141的特异性是具有SEQIDNo.1所示氨基酸序列的肽与Gln-40相比对Gln-141的特异性的至少1.25倍，例如至少1.50倍，例如至少1.75,例如至少2.0倍，例如至少2.5倍，例如至少3.0倍，例如至少3.54咅，例如至少4.0倍，例如至少4.5倍，例如至少5.0倍，例如至少5.5倍，例如至少6.0倍，例如至少6.5倍，例如至少7.(M咅，例如至少7.5倍，例如至少8.0倍，例如至少8.5倍，例如至少9.0倍，例如至少9.54咅，例如至少10.0倍。在一个实施方案中，本发明的肽包含基于来自拉达卡轮枝链霉菌(S./"^&憩m)的mTGase序列的序列，其携带在特定氨基酸残基中的突变和/或具有额外的N-末端添加的氨基酸残基。在一个实施方案中，本发明的肽包含基于来自茂原链霉菌(5".wo6arae朋w)的mTGase序列且具有额外的N-末端添加的氨基酸残基的序列。本发明具体涉及来自拉达卡轮枝链霉菌(5^ep"veWcz〃zwm/a&y^腦m)的转谷氨酰胺酶的新型变体。所述变体可以用于在指定的谷氨酰胺残基处以提高的选择性位点特异性地修饰肽。在本文中，术语"变体"是指给定多肽的天然存在的变异或给定肽或蛋白质的重组制备的或以其他方式修饰的变异，其中已经通过氨基酸置换、添加、缺失、插入或倒位(inversion:M奮饰了一个或多个氨基酸残基。在一个实施方案中，本发明提供了分离的肽，其包含与与SEQIDNo.1的氨基酸序列具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%、例如100%同一性的氨基酸序列，其中所述序列在对应SEQIDNo.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250的一个或多个位置处祐:修饰。如本领域已知的，术语"同一性"是指通过对比序列确定的2个或更多个肽的序列之间的关系。在本领域中，"同一性"也指通过2个或更多度。"同一性"度量通过特定数学模型或计算机程序(即，"算法")解决的2个或更多个序列之间缺口(gap)比对较小(如果有的话)的同一匹配百々比。通过已知的方法可以容易地计算相关肽的同一性。这样的方法包括、但不限于，在下述文献中描述的那些ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork，1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987;SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.:M.StocktonPress,NewYork,1991;和Carillo等，SIAMJ.AppliedMath.近1073(1988)。优选的测定同一性的方法^皮设计成给出测试的序列之间的最大匹配。测定同一性的方法描述在可^HH寻到的计算机程序中。测定2个序列之间同一性的优选的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等，Nucl.Acid.Res.U,387(1984);GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.),BLASTP,BLASTN,和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.HI,403-410(1990))。BLASTX程序可从NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)和其它来源(BLASTManual,Altschul等NCB/NLM/NIHBethesda,Md.20894;Altschul等，同上)公开得到。众所周知的SmithWaterman算法也可以用于测定同一性。4列^(口,"f吏用i十算才几算';去GAP(GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.),比对要测定序列同一性百分比的2个肽它们各自氨基酸的最佳匹配(通过该算法测定的"匹配的跨度")。与该算法结合使用缺口开口罚分(它计算为平均对角线的3倍；"平均对角线"是使用的对比矩阵的对角线的平均值；"对角线"是由特定对比矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的评分或数值)和缺口延伸罚分(它通常是缺口开口罚分的{分数(1/10)}倍)、以及对比矩阵例如PAM250或BLOSUM62。所述算法也使用标准的对比矩阵(关于PAM250对比矩阵参见Dayhoff等，AtlasofProteinSequenceandStructure,vol.5,supp.3(1978);关于PAM62对比矩阵参见Hemkoff等，Proc.Natl.Acad.SciUSA祖10915-10919(1992))。肽序列对比的优选参数包括下述的算法Needl函n等，J.Mol.Biol.4^,443-453(1970);对比矩阵来自Henikoff等，PNASUSA10915-10919(1992)的BLOSUM62;缺口罚分12,缺口长度罚分4，相似性阈值0。GAP程序可使用上述参数。前述参数是使用GAP算法的肽对比的默认参数(末端缺口没有罚分)。在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的分离的肽，其中所述氨基酸序列在与Tyr62相对应的位置被修饰，其中所述修饰由用不同于Tyr的氨基酸残基置换原始酪氨酸残基构成。在一个实施方案中，在与Tyr62相对应的位置处的氨基酸残基的修饰由用选自下述的氨基酸残基置换原始酪氨酸残基构成Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gin,Glu,Gly,His,lieLeu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,和Val。在一个实施方案中，在与Tyr62相对应的位置处的Tyr被选自下述的氨基酸残基置换His,Met,Asn,Val,Thr,和Leu。在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的分离的肽，其中所述氨基酸序列在与Tyr75相对应的位置被修饰，其中所述修饰由用不同于Tyr的氨基酸残基置换原始酪氨酸残基构成。在一个实施方案中，在与Tyr75相对应的位置处的氨基酸残基的修饰由用选自下述的氨基酸残基置换原始酪氨酸残基构成Ala,Arg，Asn,Asp,Cys,Gin,Glu,Gly,His,Ile:Leu,Lys,Met,Phe，Pro,Ser,Thr,Trp,和Val。在一个实施方案中，在与Tyr75相对应的位置处的Tyr被选自下述的氨基酸残基置换Ala,Phe,Asn,Met,或Cys。在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的分离的肽，其中所述氨基酸序列在与Ser250相对应的位置被修饰，其中所述修饰由用不同于Ser的氨基酸残基置换原始丝氨酸残基构成。在一个实施方案中，在与Ser250相对应的位置处的氨基酸残基的修饰由用选自下述的氨基酸残基置换原始酪氨酸残基构成Ala，Arg,Asn,Asp,Cys,Gin,Glu,Gly,His,lie,Leu,Lys,Met，Phe,Pro,Thr,Trp、Tyr,和Val。在一个实施方案中，通过在N-末端添加1个或多个、例如l-9个、例^口1-8个、例长口1-7个、侈'J长口1-6个、例长口1-5个、例长口1-4个、例^口1-3个、例如1-2个、例如1个氨基酸来修饰本发明的肽。在一个实施方案中，通过在N-末端添加Met来》多饰所述序列。在一个实施方案中，通过在N-末端添加1个或多个、例如2-9个、13<列^口2-8个、1列^口2画7个、<列3口2-6个、1"列^口2-5个、合J^口2-4个、侈'J^口2-3个、例如2个氨基酸来修饰本发明的肽。在一个实施方案中，添加的氨基酸残基是二肽基Gly-Pro-。在一个实施方案中，添加的氨基酸残基是二肽基Ala-Pro-。根据在US5,156,956中描述的分析检验进行测定，本发明的肽表现出TGase活性。简述之，指定肽的活性测量是通过进行以下过程进行的，即在不存在Ca^的情况下采用千氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸和羟胺作为底物进行反应，在存在三氯乙酸时形成与所得氧肟酸结合的铁复合物，测量525nm下的吸光度,并通过校准曲线测定氧坊酸的量,从而计算所述活性。为了本说明书的目的，在所述分析检验中表现出转谷氨酰胺酶活性的肽被认为是具有转谷氨酰胺酶活性。具体而言，本发明的肽表现出的活性是源自拉卡轮枝链霉菌(S./a^y^"wm)具有SEQIDNo.2的氨基酸序列的TGase的活性的30%以上，例如50%以上，例如70%以上，例如90%以上。在一个实施方案中，本发明提供了编码本发明的肽的核酸构建体。本文使用的术语"核酸构建体"是指任何cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA来源的核酸分子。术语"构建体"是指可以是单链或双链的核酸区段(segment),并且可以基于编码感兴趣蛋白质的完全或者部分天然核普酸序列。所述构建体可以任选地含有其它核酸区段。编码本发明的肽的本发明的核酸构建体可适宜地为基因组或cDNA来源，例如通过以下过程获得，即制备基因组或cDNA库，并通过根据标准技术采用合成寡聚核苷酸探针的杂交从而对编码全部或部分蛋白质的DNA(参见J.Sambrook等,1989,M/ecw/arC7證力g，爿Z^0rato7Mm認/,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)并通过引入本领域已知的突变来进行筛选。编码所述蛋白质的本发明的核酸构建体也可通过已建立的标准方法合成制备,例^口Beaucage禾口Caruthers,TetrahedronLetters22^,1859-1869(1981)所描述的亚磷酰胺(phosphoamidite)法,或者Matthes等，EMBOJournal2,801-805(1984)描述的方法。根据所述亚磷酰胺(phosphoamidite)法，在例如自动DNA合成仪中合成寡聚核苷酸，纯化，退火，连接，并在合适的载体中克隆。此外，所述核酸构建体可以是混合的合成和基因组、混合合成和cDNA或者混合基因组和cDNA来源，这是通过标准技术连接合成、基因组或cDNA来源(适当的)的片段制备而成的，所述片段对应于整个核酸构建体的各个部分。所述核酸构建体也可采用特定引物通过聚合酶链式反应制备，例如在US4,683,202或Saiki等，Science239,487-491(1988)中所描述的。在一个实施方案中，所述核酸构建体是DNA构建体。在一个实施方案中，本发明的核酸构建体包含核酸序列，该核酸序列编码蛋白酶底物氨基酸序列，该蛋白酶底物氨基酸序列表达为所述核酸构建体编码的肽的N-末端部分。在一个实施方案中，本发明的核酸构建体包含核酸序列，该核酸序列编码蛋白酶底物氨基酸序列，该蛋白酶底物氨基酸序列表达为所述核酸构建体编码的肽的C-末端部分。这样的蛋白酶和蛋白酶底物氨基酸序列是本领域众所周知的。如果在合适环境(这取决于蛋白酶的选择)下用适当的蛋白酶处理具有这种序列的肽，蛋白酶会在取决于蛋白酶和蛋白酶底物氨基酸序列的位置切割肽于。所述蛋白酶底物氨基酸序列的实际氨基酸序列因而随制备方案以及当然还随蛋白酶的选择而异。在某些情况下，蛋白酶处理会剩下一些氨基酸，它们可以被视作原始肽的N-或C-末端添加，原始肽是在添加编码蛋白酶底物氨基酸序列的核酸序列之前由核酸编码的肽。在一个实施方案中，所述蛋白酶是3C蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶是3C蛋白酶，蛋白酶底物氨基酸序列是在合适环境下可以被3C蛋白酶切割的序列。在一个实施方案中，所述3C蛋白酶底物氨基酸序列是LEVLFQGP。在另一个实施方案中，所述3C蛋白酶底物氨基酸序列LEVLFQGP结合在原始肽的N-末端，3C蛋白酶处理会剩下结合在原始肽N-末端的Gly-Pro二肽。在一个实施方案中，所述蛋白酶是肠激酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶是肠激酶，蛋白酶底物氨基酸序列是在合适环境下可以被肠激酶切割的序列。在另一个实施方案中，所述肠激酶底物氨基酸序列结合在原始肽的N-末端，肠激酶处理会剩下结合在原始肽N-末端的Ala-Pro二肽。这用于例如制备mTGase-SL变体，其中某些氨基酸已经添加在N-末端。在一个实施方案中，本发明提供了重组载体，其包含本发明的核酸构建体。在一个实施方案中，本发明提供了宿主，其包含本发明的载体。其中插入有本发明的DNA构建体的重组载体可以是任何能方便地进行重组DNA过程的载体，并且所述载体的选择通常取决于其将导入的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制载体，即以基因组外实体存在的载体，其复制不依赖基因组复制，例如质粒。或者，所述载体可以是整合到宿主细胞基因组中并与其整合入的染色体一起进行复制的载体。所述载体优选为表达载体，其中所述编码本发明的蛋白的DNA序列与DNA转录所必需的其它片段可操作地相连。术语"可操作地连接"指所述片段被设置成它们与其预期目的相一致地发挥功能，例如转录在启动子内启始并沿编码所述蛋白的DNA序列进行。所述启动子可以是在所选择的宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，并可来源于与所述宿主细胞同源或异源的编码蛋白的基因。如果必需，编码本发明的蛋白的DNA序列也可与适宜的终止子可操作地相连，诸如人类生长激素终止子(Palmiter等，在上述所引著作中)或(对真菌宿主而言)TPI1(AlberandKawasaki,在上述所引著作中)或ADH3(McKmght等，在上述所引著作中)终止子。所述载体可进一步含有元件诸如聚腺苷酸化信号(例如来自SV40或腺病毒5Elb区域)，转录增强子序列(例如SV40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VARNA的翻译增强子序列)。本发明的重组载体可进一步含有能使所述载体在^L讨论的宿主细月包中复制的DNA序列。所述载体还可以含有可选择的标记，例如基因，其产物与宿主细胞中的缺陷互补，诸如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)或栗酒裂殖酵母(Sc/n'zosacc/an9，ce《/cw6e)TPI基因(P.R.Russell,Gene125-130(1985)所描述)，或者能赋予对药物，例如氨千青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或曱氨蝶呤的抗性的基因。对于丝状真菌，可选4奪的才示i己包4舌amdS、pvrG、argB、niaD详口sC。为将本发明的蛋白质知道进入所述宿主细^9包的分泌途径，在所述重组载体中可提供分泌信号序列(也一皮称作前导序列(leadersequence)、前序歹11(preprosequence或presequence))。戶斤述分〉必4言号序歹寸在正确的阅读框内连接到编码所述蛋白质的DNA序列上。分泌信号序列通常位于编码所述蛋白质的DNA序列的5'端。所述分泌信号序列可与所述蛋白正常联合或者来自编码其它分泌蛋白质的基因。用于分别连接编码本发明的蛋白质的DNA序列、所述启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列，并将它们插入含有复制必需信息的合适载体中的过程，对于本领域技术人员是公知的(参见，例如Sambrook等，在上述所引著作中)。将本发明的DNA构建体或重组载体导入其中的宿主细胞可以是任何能产生本发明的蛋白质的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高级真核细胞。接着将以上描述的被转化或者转染的宿主细胞在合适的营养培养基中，在允许本发明的肽表达的条件下进行培养，之后从所述培养基中收集所得蛋白。用于培养所述细胞的培养基可以是任何适合于所述宿主细胞生长的常规培养基，诸如含有适当补充物的最小或复合培养基。合适的培养基可由商业供应商提供或者根据公开的配方制备(例如在美国典型培养物j呆藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的目录中)。然后可通过常规手段从所述培养基中回收由所述细胞产生的蛋白，包括通过离心或过滤从所述培养基中分离所述宿主细胞，通过盐例如石克酸4妄沉淀所述上清液或滤液中的蛋白质成分，通过各种层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲合层析等进行纯化，这取决于所讨论的蛋白的类型。本发明的肽可按照不同方法进行制备。所述肽可通过本领域内已知的蛋白质合成方法进行制备。如果所述肽相当大，更方便的是通过合成所述肽的几个片段，然后将它们连接成本发明的肽。然而，在一个具体实施方案中，通过发酵含有编码本发明肽的核酸构建体或编码可#^奮饰成本发明肽的肽的核酸构建体的适宜宿主而制备本发明的肽。在一个实施方案中，本发明提供了制备本发明的肽的方法，其中i)在允许表达所述肽的条件下，发酵能重组表达所述肽的宿主细胞，和ii)对包含在步骤i)中表达的肽的组合物进行阳离子交换层析，作为第一个离子交换层析步骤。与类似的阴离子交换层析步骤作为发酵后第一个层析步骤相比，阳离子交换层析的应用会提供更大的选择性和产量。17任选地，在每个步骤之前和之后，可以对包含来自步骤ll)的肽的组合物进行其它纯化步骤，条件是，步骤ll)的阳离子层析是第一个层析步骤。它也可以是唯一的层析步骤。例如，在进行阳离子交换之前可以对来自步骤l)中的发酵的上清液进行一些处理，例如稀释和pH调节。上清液可以例如稀释1,2,3,4,5,6,7,8,9或IO倍或更多倍，可以根据阳离子交换材料的选择或根据本领域技术人员认为适当，而调节pH。在一个实施方案中，在基于琼脂糖的树脂例如SPBigBeads(GEHealthcare)或基于聚合物的冲对月旨例如ToyopearlMegacap2(TosoBioscience)上进行步骤ii)中所述的阳离子交换。两种示例性的树脂是强阳离子交换树脂。在另一个实施方案中，要进行步骤ii)的阳离子交:換的组合物具有5.2的pH。在一个实施方案中，本发明提供了制备本发明肽的方法，其中a)在允许表达所述肽的条件下，发酵能重组表达所述肽的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含载体，所述载体包含编码本发明肽的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含核酸序列，该核酸序列编码蛋白酶底物氨基酸序列，该蛋白酶底物氨基酸序列表达为由核酸构建体编码的原始肽的N-或C-末端部分，和b)用能切割蛋白酶底物氨基酸序列的蛋白酶处理包含来自a)下的发酵的重组肽的组合物。在本文别处已经描述了这样的包含核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列编码蛋白酶底物氨基酸序列。在一个实施方案中，在进行上述蛋白酶处理之前，对来自a)下的发酵的重组肽进行阳离子交换层析，作为第一个层析步骤。在一个实施方案中，在步骤b)后，对包含已经进行步骤b)中的蛋白酶处理的肽的组合物进行第二个阳离子交换层析。在一个实施方案中，将乙二醇加入得到的包含本发明肽的组合物中，至终浓度20%。在一个实施方案中，本发明提供了缀合肽的方法，其中所述方法包含，在存在本发明的肽时，4吏所述肽与胺供体反应。在一个实施方案中，要缀合的肽是生长激素。在一个实施方案中，所述肽是hGH或其变体或书t生物。在本文中，术语"衍生物"是指被修饰的多肽或其变体或片段，即通过向母本多肽(parentpolypeptide)共价结合优选具有生物活性的任意类型的分子。典型的修饰是酰胺，碳水化合物，烷基，酰基，酯，聚乙二醇化等。在一个实施方案中，本发明提供了缀合如上所述的生长激素的方法，其中，与在对应于hGH的位置Gln-141的位置处缀合的hGH的量(相对于在对应于位置Gln-40的位置处缀合的hGH的量)相比，与在具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的肽用于所述方法中替代本发明的肽时在对应于hGH的位置Gln-141的位置处缀合的生长激素的量(相对于在对应于hGH的位置Gln-40的位置处缀合的hGH的量)相比显著增加。在一个实施方案中，本发明提供了缀合hGH的方法，其中，与在对应于hGH的位置Gln-141的位置处缀合的hGH的量(相对于在对应于位置Gln-40的位置处缀合的hGH的量)相比，与当具有SEQIDNo.l所示氨基酸序列的肽用于所述方法中替代本发明的肽时在对应于hGH的位置Gln-141的位置处缀合的生长激素的量(相对于在对应于hGH的位置Gln-40的位置处缀合的hGH的量)相比显著增加。在一个实施方案中，本发明提供了制备在对应于位置141的位置处缀合的hGH的方法，其中所述方法包含，在存在本发明的肽时，使所述hGH与胺供体反应。在本发明方法的一个实施方案中，将缀合的hGH用于制备聚乙二醇化的hGH,其中所述聚乙二醇化发生在缀合的位置。在一个实施方案中，本发明提供了制备缀合的生长激素的药物制剂的方法，该方法包含下述步骤，在存在本发明的肽时，使所述hGH或其变体或衍生物与胺供体反应。在一个实施方案中，所述生长激素是hGH或其变体或衍生物。在一个实施方案中，本发明提供了制备聚乙二醇化的生长激素的药物制剂的方法，该方法包含下述步骤，在存在本发明的肽时，^f吏所述hGH或其变体或衍生物与胺供体反应，和使用得到的缀合的生长激素肽制备聚乙二醇化的生长激素，其中所述聚乙二醇化发生在缀合的位置。在一个实施方案中，所述生长激素是hGH或其变体或衍生物。在一个实施方案中，所述聚乙二醇化的生长激素是在位置Glnl41处聚乙二醇化的hGH。在一个实施方案中，所述聚乙二醇化的生长激素是在WO2006/134148中所述的聚乙二醇化的生长激素。在一个实施方案中，本发明提供了本发明的肽在制备缀合的生长激素中的应用。在一个实施方案中，所述生长激素是hGH或其变体或衍生物。在一个实施方案中，所述生长激素在与hGH中的位置Glnl41相对应的位置处被缀合。在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者中与生长激素缺乏有关的疾病或障碍的方法，该方法包含，为有此需要的患者给药使用本发明方法制备的药物制剂，其中要缀合的肽是生长激素。在一个实施方案中，患者中与生长激素缺乏有关的疾病或障碍选自生长激素缺乏(GHD);特纳综合征(turnersyndrome);普4i德画威利综合征(Prader-Willisyndrome)(PWS);努南综合4正(Noonansyndrome);唐氏综合4正；慢性肾病，幼年型类风湿关节炎；嚢性纤维化病，接受HAART处理的儿童的HIV感染(HIV/HALS儿童);小于胎龄(SGA)初生的矮小儿童；除了SGA以外的初生时极低出生体重(VLBW)的儿童的身材矮小症；骨骼发育异常；软骨发育不良；软骨发育不全；自发性身材矮小症(ISS);成年人的GHD;长骨骨折，例如胫骨，腓骨，股骨，肱骨，桡骨，尺骨，锁骨,matacarpea,matatarsea,禾口3止；木>质骨(spongiousbone)中的骨4斤或+>质骨骨折，例如颅骨(scull),手底,和足底;腱或韧带手术(例如手、膝盖或肩中的)后的患者；接受或经历牵拉骨生成(distractionoteogenesis)的患者；髋或盘(discus)置换、半月面修复、脊柱融合术或假体固定(例如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中)后的患者；其中已经固定骨接合术材料(例如钉、螺杆和平板)的患者；骨不连接或骨折愈合不良的患者；骨切除术后的患者，例如胫骨或第一趾；移植物植入后的患者；创伤或关节炎造成的膝关节软骨退化;特纳综合征患者的骨质疏松症;男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD);APCD中与心血管疾病有关的营养不良；APCD中恶病质的逆转；APCD中的癌症；APCD中的f曼性阻塞性肺病；APCD中的HIV;晚期APCD;APCD中的t曼性肝病，APCD中的疲劳综合征；克罗恩病；受损的肝功能；HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV-相关脂肪营养不良综合征(HALS);男性不育症；重大选择性手术后的患者，酒精/药物解毒或神经创伤；衰老；老年虚弱；骨关节炎；创伤损害的软骨；勃起机能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁症；创伤性脑损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病;或儿童中由于糖皮质激素治疗导致的身材矮小症。下面是本发明实施方案的列表，该列表不应解释为限制性的实施方案l:分离的肽，其包含与SEQIDNo.1中的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，其中所述序列在对应SEQIDNo.1'的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250中的一个或多个位置处被修饰。实施方案2:#4居实施方案1的分离的肽，其包含与SEQIDNo.1中的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列，其中所述序列在与SEQIDNo.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250相对应的一个或多个位置处一皮修饰。实施方案3:根据实施方案2的分离的肽，其包含与SEQIDNo.1中的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述序列在与SEQIDNo.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250相对应的一个或多个位置处被修饰。实施方案4:根据实施方案3的分离的肽，其包含与SEQIDNo.1中的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述序列在与SEQIDNo.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250相对应的一个或多个位置处被修饰。实施方案5:冲艮据实施方案4的分离的肽，其包含在SEQIDNo.1中定义的氨基酸序列，其中所述序列在与SEQIDNo.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250相对应的一个或多个位置处^皮修饰。实施方案6:根据实施方案1-5中任一项的分离的肽，其中所述氨基酸序列在与Tyr62相对应的位置被修饰，其中所述修饰由用不同于Tyr的氨基酸残基置换原始酪氨酸残基构成。实施方案7:根据实施方案6的分离的肽，其中在与Tyr62相对应的位置的氨基酸残基的修饰由用选自下述的氨基酸残基置换原始酪氨酸残基构成Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gin,Glu,Gly,His,lie,Leu,Lys,MetPhe,Pro,Ser,Thr,Trp,和Val。实施方案8:才艮据实施方案7的分离的肽，其中在与Tyr62相对应的位置的Tyr被选自下述的氨基酸残基置换His,Met,Asn,Val,Thr,和Leu。实施方案9:才艮据实施方案8的分离的肽，其中在与Tyr62相对应的位置的Tyr被置换为His。21实施方案10:根据实施方案8的分离的肽，其中在与Tyr62相对应的位置的Tyr被置换为Val。实施方案ll:根据实施方案8的分离的肽，其中在与Tyr62相对应的位置的Tyr被选自下述的氨基酸残基置换Met,Asn,Thr,和Leu。实施方案12:根据实施方案8的分离的肽，其中在与Tyr62相对应的位置的Tyr一皮置换为Met。实施方案13:根据实施方案8的分离的肽，其中在与Tyr62相对应的位置的Tyd皮置换为Asn。实施方案14:才艮据实施方案8的分离的肽，其中在与Tyr62相对应的位置的Tyr被置换为Thr。实施方案15:根据实施方案8的分离的肽，其中在与Tyr62相对应的位置的Tyr,皮置换为Leu。实施方案16:根据实施方案1-15中任一项的分离的肽，其中所述氨基酸序列在与Tyr75相对应的位置被修饰，其中所述修饰由用不同于Tyr的氨基酸残基置换原始酪氨酸残基构成。实施方案17:根据实施方案16的分离的肽，其中在与Tyr75相对应的位置的氨基酸残基的修饰由用选自下述的氨基酸残基置换原始酪氨酸残基构成Ala,Arg,Asn，Asp,Cys,Gin,Glu,Gly,His,lie,Leu,Lys,Met,Phe,Pro，Ser，Thr,Trp,和Val。实施方案18:才艮据实施方案17的分离的肽，其中在与Tyr75相对应的位置的Tyr被置换为Ala,Phe,Asn,Met,Leu,或Cys。实施方案19:根据实施方案18的分离的肽，其中在与Tyr75相对应的位置的Tyr被置换为Phe。实施方案20:才艮据实施方案18的分离的肽，其中在与Tyr75相对应的位置的Tyr一皮置换为Asn。实施方案21:才艮据实施方案18的分离的肽，其中在与Tyr75相对应的位置的Tyr被置换为Ala,Met,Leu,或Cys。实施方案22:才艮据实施方案21的分离的肽，其中在与Tyr75相对应的位置的TyH皮置换为Ala。实施方案23:根据实施方案21的分离的肽，其中在与Tyr75相对应的位置的Tyr被置换为Met。实施方案24:根据实施方案21的分离的肽，其中在与Tyr75相对应的位置的Tyr纟皮置^:为Leu。实施方案25:根据实施方案21的分离的肽，其中在与Tyr75相对应的位置的Tyr被置换为Cys。实施方案26:才艮据实施方案1-25中任一项的分离的肽，其中所述氨基酸序列在与Ser250相对应的位置被修饰，其中所述修饰由用不同于Ser的氨基酸残基置换原始丝氨酸残基构成。实施方案27:根据实施方案26的分离的肽，其中在与Ser250相对应的位置的氨基酸残基的修饰由用选自下述的氨基酸残基置换原始丝氨酸残基构成Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Gin,Glu,Gly，His,He,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Thr,Trp、Tyr,和Val。实施方案28:根据实施方案27的分离的肽，其中在与Ser250相对应的位置的氨基酸残基的修饰由用选自下述的氨基酸残基置换原始丝氨酸残基构成Ala,Arg,Asp,Cys,Gin,Gly，His,Leu,Met,Phe,Pro,Thr，Trp、Tyr,和Val。实施方案29:根据实施方案27的分离的肽，其中在与Ser250相对应的位置的氨基酸残基的修饰由将原始丝氨酸残基置换为Gly构成。实施方案30:根据实施方案27或实施方案29的分离的肽，其中在与Ser250相对应的位置的氨基酸残基的修饰由将原始丝氨酸残基置换为选自下述的氨基酸残基构成Cys,Leu,Pro,Trp、Tyr,和Val。实施方案31:根据实施方案30的分离的肽，其中所述Ser250被置换为Cys。实施方案32:换为Leu。实施方案33:换为Pro。实施方案34:换为Trp。实施方案35:换为Tyr。实施方案36:换为Val。实施方案37:根据实施方案30的分离的肽，其中所述Ser250被置根据实施方案30的分离的肽，其中所述Ser250被置根据实施方案30的分离的肽，其中所述Ser250一皮置根据实施方案30的分离的肽，其中所述Ser25(H皮置根据实施方案30的分离的肽，其中所述Ser250一皮置根据实施方案1-36中任一项的分离的肽，其中通过在N-末端添加1-10个氨基酸残基来修饰所述氨基酸序列。实施方案38:才艮据实施方案37的分离的肽，其中通过在N-末端添加1_9个氨基酸来修饰所述氨基酸序列。实施方案39:才艮据实施方案38的分离的肽，其中通过在N-末端添加1-8个氨基酸来^f奮饰所述序列。实施方案40:才艮据实施方案39的分离的肽，其中通过在N-末端添加1_7个氨基酸来修饰所述序列。实施方案41:才艮据实施方案40的分离的肽，其中通过在N-末端添加1_6个氨基酸来修饰所述序列。实施方案42:根据实施方案41的分离的肽，其中通过在N-末端添加1_5个氨基酸来修饰所述序列。实施方案43:根据实施方案42的分离的肽，其中通过在N-末端添加1_4个氨基酸来修饰所述序列。实施方案44:才艮据实施方案43的分离的肽，其中通过在N-末端添加1_3个氨基酸来修饰所述序列。实施方案45:才艮据实施方案44的分离的肽，其中通过在N-末端添加1-2个氨基酸来修饰所述序列。实施方案46:根据实施方案45的分离的肽，其中通过在N-末端添加1个氨基酸来修饰所述序列。实施方案47:才艮据实施方案46的分离的肽，其中通过在N-末端添加Met来^f'多饰所述序列。实施方案48:才艮据实施方案37的分离的肽，其中通过在N-末端添加2-9个氨基酸来修饰所述序列。实施方案49:根据实施方案48的分离的肽，其中通过在N-末端添加2-8个氨基酸来修饰所述序列。实施方案50:根据实施方案49的分离的肽，其中通过在N-末端添加2-7个氨基酸来修饰所述序列。实施方案51:根据实施方案50的分离的肽，其中通过在N-末端添加2-6个氨基酸来修饰所述序列。实施方案52:根据实施方案51的分离的肽，其中通过在N-末端添加2-5个氨基酸来修饰所述序列。实施方案53:根据实施方案52的分离的肽，其中通过在N-末端添加2-4个氨基酸来修饰所述序列。实施方案54:根据实施方案53的分离的肽，其中通过在N-末端添加2-3个氨基酸来修饰所述序列。实施方案55:根据实施方案54的分离的肽，其中通过在N-末端添加2个氨基酸来修饰所述序列。实施方案56:根据实施方案55的分离的肽，其中所述添加的二肽基是Gly-Pro-。实施方案57:根据实施方案55的分离的肽，其中所述添加的二肽基是Ala-Pro-。实施方案58:根据实施方案1-55中任一项的分离的肽，该肽具有转谷氨酰胺酶活性。实施方案59:根据实施方案58的分离的肽，该肽具有与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性，这高于具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的肽与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性。实施方案60:才艮据实施方案58的分离的肽，该肽具有与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性，这高于具有SEQIDNo.1所示氨基酸序列的肽与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性。实施方案61:才艮据实施方案56或实施方案57的分离的肽，该肽具有转谷氨酰胺酶活性。实施方案62:才艮据实施方案61的分离的肽，该肽具有与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性，这高于具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的肽与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性。实施方案63:根据实施方案61的分离的肽，该肽具有与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性，这高于具有SEQIDNo.1所示氨基酸序列的肽与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性。实施方案64:核酸构建体，其编码根据实施方案1-63中任一项的肽。实施方案65:根据实施方案64的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含核酸序列，该核酸序列编码蛋白酶底物氨基酸序列，该蛋白酶底物氨基酸序列表达为所述核酸构建体编码的实施方案1-63中任一项的肽的N-末端部分。实施方案66:根据实施方案64的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含核酸序列，该核酸序列编码蛋白酶底物氨基酸序列，该蛋白酶底25物氨基酸序列表达为所述核酸构建体编码的实施方案1-63中任一项的肽的C-末端部分。实施方案67:根据实施方案65或实施方案66的核酸构建体，其中所述蛋白酶底物氨基酸序列在合适条件下可以被3C蛋白酶切割。实施方案68:根据实施方案67的核酸构建体，所述蛋白酶底物氨基酸序列是LEVLFQGP。实施方案69:根据实施方案65的核酸构建体，其中所述蛋白酶底物氨基酸序列在合适条件下能够被肠激酶切割。实施方案70:载体，其包含根据实施方案64的核酸。实施方案71:载体，其包含根据实施方案65-69中任一项的核酸。实施方案72:宿主细月包，其包含实施方案70的载体。实施方案73:组合物，其包含根据实施方案1-63中任一项的肽。实施方案74:制备根据实施方案1-63中任一项的肽的方法，其中i)在允许表达所述肽的条件下，发酵能重组表达所述肽的宿主细胞，和ii)在任何其它离子交换层析之前，对包含来自步骤i)下的发酵的重组肽的组合物进行阳离子交换层析。实施方案75:根据实施方案74的方法，其中交换层析在选自SPBigBeads或ToyopearlMegacap2的树脂上进行步骤ii)中的所述阳离子。实施方案76:制备根据实施方案1-63中任一项的肽的方法，其中a)在允许表达所述肽的条件下，发酵能重组表达所述肽的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含根据实施方案71的载体，和b)用能切割蛋白酶底物氨基酸序列的蛋白酶处理包含来自a)下的发酵的重组肽的组合物。实施方案77:根据实施方案76的方法，其中在如步骤b)所述用蛋白酶处理之前，对来自a)下的发酵的重组肽进行阳离子交换层析。实施方案78:4艮据实施方案77的方法，其中在选自SPBigBeads或ToyopearlMegacap2的树脂上进行步骤ii)中的所述阳离子交换层析。实施方案79:才艮据实施方案76或实施方案78的方法，其中在步骤b)后，对包含已经进行步骤b)中的蛋白酶处理的肽的组合物进行第二个阳离子交换层析。实施方案80:根据实施方案74-79中任一项的方法，其中将乙二醇加入所得到的包含肽的组合物中至总量为20%。实施方案81:缀合肽的方法，其中所述方法包含，在存在实施方案l-63中任一项的肽时，使所述肽与胺供体反应。实施方案82:根据实施方案81的缀合肽的方法，其中要缀合的肽是生长激素。实施方案83:根据实施方案82的方法，其中所述生长激素是hGH或其变体或衍生物。实施方案84:根据实施方案83的缀合生长激素的方法，其中，在对应于hGH的位置Gln-141的位置处缀合的生长激素的量(相对于在对应于hGH的位置Gln-40的位置处缀合的hGH的量)，与当具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的肽用于所述方法中替代实施方案1-63中任一项的肽时，在对应于hGH的位置Gln-141的位置处缀合的hGH的量(相对于在对应于位置Gln-40的位置处缀合的hGH的量)相比显著增加。实施方案85:才艮据实施方案81的缀合hGH的方法，其中，在对应于hGH的位置Gln-141的位置处缀合的生长激素的量(相对于在对应于hGH的位置Gln-40的位置处缀合的hGH的量)，与当具有SEQIDNo.1所示氨基酸序列的肽用于所述方法中替代实施方案1-63中任一项的肽时，在对应于hGH的位置Gln-141的位置处缀合的hGH的量(相对于在对应于位置Gln-40的位置处缀合的hGH的量)相比显著增加。实施方案86:制备在对应于位置141的位置缀合的hGH的方法，其中所述方法包含，在存在实施方案1-63中任一项的肽时，使所述hGH与胺供体反应。实施方案87:根据实施方案81-86中任一项的方法，其中将缀合的hGH用于制备聚乙二醇化的hGH,其中所述聚乙二醇化发生在缀合的位置。实施方案88:制备缀合的生长激素的药物制剂的方法，该方法包含下述步骤，在存在实施方案1-63中任一项的肽时，使所述hGH或其变体或书f生物与胺供体反应。实施方案89:根据实施方案的方法88,其中所述生长激素是hGH或其变体或衍生物。实施方案90:制备聚乙二醇化的生长激素的药物制剂的方法，该方法包含下述步骤，在有实施方案1-63中任一项的肽存在下，使所述hGH27或其变体或衍生物与胺供体反应，和使用所得到的缀合的生长激素肽制备聚乙二醇化的生长激素，其中所述聚乙二醇化发生在缀合的位置。实施方案91:根据实施方案90的方法，其中所述生长激素是hGH或其变体或衍生物。实施方案92:根据实施方案91的方法，其中所述聚乙二醇化的生长激素是在位置Glnl41处聚乙二醇化的hGH。实施方案93:根据实施方案1-63中任一项的肽在制备缀合的生长激素中的应用。实施方案94:根据实施方案93的应用，其中所述生长激素是hGH或其变体或衍生物。实施方案95:根据实施方案93或实施方案94的应用，其中所述生长激素在与hGH中的位置Glnl41相对应的位置处一皮缀合。实施方案96:治疗患者中与生长激素缺乏有关的疾病或障碍的方法，该方法包含，为有此需要的患者给药使用根据实施方案88-92中任一项的方法制备的药物制剂。实施方案97:根据实施方案96的方法，其中患者中与生长激素缺乏有关的疾病或障碍选自生长激素缺乏(GHD);特纳综合征(turnersyndrome);普拉德-威利综合征(Prader-Willisyndrome)(PWS);努南综合征(Noonansyndrome);唐氏综合征；慢性肾病，幼年型类风湿关节炎；嚢性纤维化病，接受HAART处理的儿童的HIV感染(HIV/HALS儿童);小于胎龄(SGA)初生的矮小儿童；除了SGA以外的初生时极低出生体重(VLBW)的儿童的身材矮小症；骨骼发育异常；软骨发育不良；软骨发育不全；自发性身材矮小症(ISS);成年人的GHD;长骨骨折，例如胫骨，腓骨，股骨，肱骨，桡骨，尺骨，锁骨，matacarpea，matatarsea,和趾；松质骨(spongiousbone)中的骨折或松质骨骨折，例如颅骨(scull),手底,和足底；腱或韧带手术(例如手、膝盖或肩中的)后的患者；接受或经历牵拉骨生成(distractionoteogenesis)的患者；髋或盘(discus)置换、半月面修复、脊柱融合术或假体固定(例如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中)后的患者；其中已经固定骨接合术材料(例如钉、螺杆和平板)的患者；骨不连接或骨折愈合不良的患者；骨切除术后的患者，例如胫骨或第一趾；移植物植入后的患者；创伤或关节炎造成的膝关节软骨退化;特纳综合征患者的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD);APCD中与心血管疾病有关的营养不良；APCD中恶病质的逆转;APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV;晚期APCD;APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合征；克罗恩病；受损的肝功能；HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV-相关脂肪营养不良综合征(HALS);男性不育症；重大选择性手术后的患者，酒精/药物解毒或神经创伤；衰老；老年虚弱；骨关节炎；创伤损害的软骨；勃起机能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁症；创伤性脑损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病;或儿童中由于糖皮质激素治疗导致的身材矮小症。所有参考文献，包括此处引用的出版物、专利申请和专利在此以参照的方式整体并入本文，并达到如同每篇参考文献在此一皮个别地、具体地指明以参照的方式并入本文并阐明其全部内容的相同的程度(至法律所允许的最大范围)，即使在本说明书的其它地方存在任何单独提供的具体文献的并入。在描述本发明中使用的术语"一个"、"一种"和"所述"以及类似词语应解释为涵盖单数和复数，除非另外指出或者与内容明显相抵触。例如，短语"所述化合物"应被理解为指代本发明的各种"化合物"或者具体描述的方面，除非另外指明。除非另外指明，所有在此提供的精确数值是对应的近似数值的代表(例如，关于特定因子或者测量而提供的所有精确示例性数值可被视为还提供了相应的近似测量结果，在适当时，可以用"大约"进行修饰)。本文中，使用诸如"包含"、"具有"、"包括"、"含有"等术语的关于一个或多个要素的本发明的任何方面的描述旨在提供对"由该特定要素构成的"、"基本由该特定要素构成的"或"基本包含该特定要素的"本发明的相似方面的支持，除非另外说明或者明显与上下文相抵触(例如，此处描述为包含特定要素的组合物应当理解为描述由该要素构成的组合物，除非另外说明或者明显与上下文相抵触)。实施例实施例1GlyPro-TGase形式的前肽-mTGase的克隆和突变体产生^《在^古發炎遂,萝"^^oveW"〃mm/"^^mwm^JTUC""/^来自拉达卡轮枝链霉菌(S./^/ay^mw2)的前肽-mTGase的序列(前肽-mTGase是肽，它是来自拉达卡4仑枝链霉菌(S.丄aJ"^mw)的编码TGase的DNA在另一种生物体例如大肠杆菌(co/O中表达的结果)如SEQIDNo.3所示。前肽部分是SEQIDNo.3的氨基酸1-49,剩余的序列是SEQIDNo.1所示的成熟的mTGase。如图1所示，成熟的mTGase部分(SEQIDNo.l)与来自茂原链霉菌(w^araew")的mTGase(SEQIDNo.2)具有93.4%的同一性。将3C-蛋白酶序列LEVLFQGP(3C)克隆在前肽-结构域(SEQIDNo.3的氨基酸l-49)和拉达卡轮枝链霉菌(51./a^^wwm)的前肽-TGase的成熟的mTGase结构域之间。3C-蛋白酶特异性地切割LEVLFQGP的Q和G位点之间，这产生2个另外的氨基酸残基，即要添加到成熟的mTGase(如SEQIDNo.1所示)的N末端的Gly-Pro。为了在大肠杆菌(Eco")中表达，将编码Met画前肽-(3C)-mTGase的DNA克隆在pET39b(Novagen)表达载体的AWel和5awHI位点之间，并转入大肠杆菌(五.co/z')BL21(DE3)中进行表达。来自拉达卡轮枝链霉菌(S./aJ"b"Mw)的前肽-(3C)-mTGase的序列如SEQIDNo.6所示。使用QmkChange定位i秀变试剂盒(Stratagene)进4亍定位诱变。例如，Y75F,Y62H—Y75N和Y62H_Y75F(使用SEQIDNo.1的编号)的突变。实施例2使用阴离子层析制备具有添加的N-末端氨基酸残基的TGase突变体G/卢歸rG騰W教务在30°C下在补充30pg/ml卡那霉素的LB培养基中培养pET39b—Met-前肽-(3C)-mTGase-SL/大肠杆菌(五.co")BL21(DE3)细胞至0.4的光密度，用0.1mMIPTG诱导细胞另夕卜4h。通过离心收集细月包沉淀。从细胞沉淀提取可溶级分，用阴离子交换Q-sepharoseHP柱纯化，以得到纯的前肽-(3C)-mTGase蛋白质。然后在20°C下以相对于前肽-(3C)-mTGase蛋白质的1:100(w/w)比用3C-蛋白酶(来自脊髓灰质炎病毒)消化该蛋白过夜。通过阳离子-交换柱SPSepharoseHP/Source30S进一步纯化消化混合物得到通过TGase活性测定鉴别的有活性的mTGase。i尸ra-w7U騰^賴务除了用肠激酶(EK)替代3C蛋白酶来消化前肽以外，以与GlyPro-mTGase类似的方式生产AlaPro-mTGase。简而言之，在大肠杆菌(i.co/z')中表达来自茂原链霉菌(5^印fo附少ce《mo6arae"w'《)的前肽-mTGase,发现存在于可溶级分中。通过QSepharoseHP离子交换层析纯化前肽-mTGase,用EK消化，以产生AlaPro-mTGase。然后，在SPSepharoseHP离子交换柱上进一步纯化AlaPro-mTGase。为了对比不同的N-末端附加序列对来自拉达卡轮枝链霉菌/"J"^m/w)的mTGase的选择性的影响，分别克隆、表达和纯化了Met-mTGase、AlaPro-mTGase和来自拉达卡轮枝链霉菌(/adaA:""ww)的野生型mTGase形式的mTGase。对比如上所述从EK制备的来自茂原链霉菌(S.的AlaPro-mTGase,通过3C-蛋白酶(来自脊髓灰质炎病毒)消化而从前肽-3001丁0&36-31^制备0^1"0-111丁0&56-31^比使用EK消化具有更高的特异性，且具有提高的回收产量。实施例3使用阳离子层析纯化具有添加的N-末端氨基酸残基的TGase突变体使用来自GEHealthcare的AKTA技术，在阳离子交换柱上纯化GlyPro-mTGase(Tyr62His,Tyr75Phe)制品。4吏用的柱是ToyoPearlMegaCap2和SPSepharoseBB,直径11mm,高度200mm,体积19.0ml，在室温下<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>实施例4使用阳离子层析制备具有添加的N-末端氨基酸残基的TGase突变体G/卢關rG騰(7>^2^,7y75尸/ze」W賴务在30°C下在补充30pg/ml卡那霉素的LB培养基中培养pET39b—Met-前肽-(3C)-mTGase-SLTyr62His,Tyr75Phe/大肠杆菌(Eco")BL21(DE3)细胞至0.4的光密度，用0.1mMIPTG诱导细胞另外4h。通过离心收集细l包沉淀。如在实施例中所述，从细胞沉淀提取可溶级分，用阳离子交换纯化，以得到纯的前肽-(3C)-mTGase蛋白质。然后在20°C下以相对于前肽-(3C)-mTGase蛋白质的1:100(w/w)比用3C-蛋白酶(来自脊髓灰质炎病毒)消化该蛋白质过夜。通过阳离子-交换柱SPSepharoseHP/Source30S进一步纯化消化混合物，得到有活性的mTGase,并将乙二醇加入纯化的mTGase至20%的浓度。实施例5高选择性变体的筛选实验一用于评价N-末端附加序列对来自拉达卡轮枝链霉菌(S./^^y^丽m)的mTGase的选择性影响的动力学方法/zG//^^W^^G//Q/4/A^^對务通过定位诱变构建hGH突变体hGHQ40N和hGHQ141N。它们在(Eco/z)中表达为在N末端具有4个额外的氨基酸残基的MEAE-hGHQ40N和MEAE-hGHQ141N,以与野生型重组hGH相同的方式进行纯化。简而言之，使用QSepharoseXL层析从大肠杆菌大肠杆菌(￡.co/z')粗裂解物回收可溶的MEAE-hGH突变体，然后用苯基琼脂糖FF进一步纯化。在42°下用DAP-1酶消化部分纯化的MEAE-hGH突变体l小时，以去除N末端的MEAE。最后，用38。/Q冷乙醇沉淀hGH突变体，然后用7M脲溶解，用Source30Q柱纯化。在含有200mMNaCl,50uMhGHQ141N或hGHQ40N,100uM丹酰尸胺(DNC,Fluka)的200plTris國HCl緩冲液，20mM,pH7.4中进行动力学反应。通过加入2figmTGase来启动反应，在26。C下运行。每20sec在Ex/Em:340/520nm监控荧光，持续1小时。使用在0-2000s之间收集的数据，用第2级多项式拟合进展曲线，以得到斜率。拟合计算是基于在早期时间范围(0-2000sec)采集的数据，这时进展曲线(progresscurve)的斜率是线性的，反向反应相对最小。实施例6用于验证TGase突变体的高选择性的毛细管电泳使用1,3-二氨基-丙醇作为胺供体，进行转谷氨酰胺反应。通过添加TGase蛋白质来启动反应，在室温温育2h。以时间间隔(15-30m)收集样品，用液氮冷冻，在-20。C下保存，用于通过CE分析转化率和选择性。如表1所示制备反应混合物。表1使用野生型hGH和1,3-二氨基丙醇，制备转谷氨酰胺的反应混合物。首先从其储备溶液制备hGH工作溶液，然后用于反应，其中所述储备溶液是在TrisHCl,5mM,pH7.0中。野生型hGH工作溶液1,3-dapmTGase储备溶液4.0mg/ml反应320nl终浓度-60nM(1.28mg/ml)H20280(al1M90pl90mM*1,3-dap:1,3-二氨基-丙醇变化10|Lll0.2-0.3nM(10-15pg/ml)H20TrisHCl总体积pH8.01M290nl10pi1ml10mMC￡为Vf首先用H201:10稀释来自转谷氨酰胺反应的冷冻样品，使用来自BeckmanCoulter的具有30.5cmx50um内径的毛细管的P/ACEMDQ进行CE,在20。C下在214nm处进行紫外;险测。由于转氨基的(tra歸mincated)hGH的pi是约5.80-6.20，因此在TrisHCl，50mM,pH8.0中进行CE分析。首先用0.1MHCl调节毛细管0.5m，用蒸馏水冲洗1.5m,注射样品0.5m，最后在+15kV运行25m，用于样品分离。从CE图谱，野生型hGH、在Q141单置换的hGH和在Q40单置换的hGH的保留时间分别是6.5,7.9和10m。实施例7高选4奪性mTGase突变体的评价将突变体选择性的提高与来自茂原链霉菌(S.wo^rae朋&)的野生型mTGase(AlaPro-mTGase形式)进行对比。通过筛选实'睑，评价N-末端变体的选择性。使用野生型hGH作为底物，使用1,3-二氨基丙醇作为胺供体，通过CE分析所有突变体对转谷氨酰胺反应的选择性。实施例8不同N-末端序列对来自拉达卡轮枝链霉菌/a&^肌附)的mTGase的选择性的影响使用实施例5中所述的实验，对比具有不同N-末端附加序列的来自拉达卡轮枝链霉(S./^/"^mwm)的mTGase的变体相对于hGHQ40(使用hGHQ141作为底物)对hGHQ141(使用hGHQ40N作为底物)的选择性。在表2中显示的结果指出，来自拉达卡轮枝链霉菌(S./a^y^m/w)的mTGase的整体选择性高于来自茂原链霉菌(&mo6"rae朋&)的AlaPro-mTGase。在具有不同N-末端序列的来自拉达卡轮枝链霉菌(S./^/a^mww)的mTGase的4种不同形式中，GlyPro-mTGase突出地以2.7的RS具有最高选择性。尽管不能得到来自拉达卡轮技链霉菌(S./aJfl^薦m)的mTGase的晶体结构，但在表2中显示的结果指出，mTGase的N-末端也可能参与mTGase的结合袋(bindingpocket)对它的底物例如hGH的构象变化。提高的选择性可能是由于mTGase的结合袋的向下挤压，这使得在底物的某些位点处的Gin残基例如hGH的Q141成为mTGase催化的转谷氨酰胺所更偏好的。通过CE测量的转谷氨酰胺反应，进一步证实了来自拉达卡轮枝链霉菌(5"./aJay^腦m)的野生型GlyPro-mTGase的选择性。基于上述结果，在拉达卡轮枝链霉菌(S./^fo^mww)的GlyPro-mTGase上建立其它突变。由于没有发现来自茂原链霉菌moZ^rae朋M)的mTGase的不同N-末端形式的选择性差异，因此l吏用来自茂原链霉菌(/w^arae"w》)的AlaPro-mTGase作为参照，通过RS(相对选择性)评价选择性的提高，其中从实施例5所述的筛选实验中计算所述RS(相对选择性)。36表2具有不同N-末端序列的来自拉达卡轮枝链霉菌(S./^fey^薦w)的mTGase变体的选择性对比。使用来自茂原链霉菌(S.wo^rae朋&)的AlaPro-mTGase作为参照。所计算的选择性是相对于hGH40(4吏用hGHQ141mTGase的来源mTGase变体对hGHQ40N的活性(RFU/sec/|ug)对hGHQ權的活性(RFU/sec/吗)选择性(Q141/Q40)RS1茂原链霉菌2(S.wo6araem7's)mTGas63.350.983.41.0Met-mTGase5.441.244.41.3AlaPro-m丁Gas65.051.563.21.0GlyPro-mTGase4.281.133.81.2拉达卡轮枝链霉菌(jS"./at/i3Aa"w/w)成熟的mTGase3.550.635.61.7Met-mTGase4.740.806.01.8AlaPro-m丁Gase6.911.026.82.1GlyPro-mTGase4.250.488.82.7AS:相对选择性，突变体的选择性与来自茂原链霉菌(S.moMrae朋&)的野生型mTGase的选l奪性的比。实施例9基于来自拉达卡轮枝链霉菌/aJ^:amw2)的GlyPro-mTGase通过定位突变产生的mTGase突变体使用GlyPro-mTGase进行转谷氨酰胺反应，其中使用野生型hGH作为底物，使用1,3-二氨基丙醇作为胺供体。通过CE评价转谷氨酰胺在hGH的Q141相对于Q40的选择性。使用来自茂原链霉菌(S.)的AlaPro-mTGase作为参照，使用来自拉达卡轮枝链霉菌(S./a^ybmww)的GlyPro-mTGase作为基准，评价选择性的提高。结果如表3所示。每个突变体的CE图如图2B至图2H所示。在表3中列出的结果显示，包括Y75A,Y75F,Y75N,Y62H—Y75N和Y62H—Y75F在内的所有突变体具有比GlyPro-mTGase-SL高的选冲奪性。最高选择性的突变体是GlyPro-mTGase—Y62H—Y75F，当hGH转化率是49.2%时选择性是36.2,这是来自茂原链霉菌(S.wo^rae朋w)的AlaPro-mTGase的6.4倍。进行其它测量，在38.1%的更低的hGH转化率下，选择性提高至7.6倍。当突变体和参照mTGase的hGH转化率是约40%时，使用GlyPro-mTGase—Y62H一Y75F变体的重复的转谷氨酰胺反应产生与来自茂原链霉菌(5".mo^raew^)的AlaPro-mTGase相比提高至7.6倍的选择性。表3mTGase变体的选择性对比<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>U人CE图谱，野生型hGH、在Q141单置换的hGH和在Q40单置换的hGH的保留时间分别是6.5,7.9和10m。2单独进行该实验，其中参照物AlaPro-mTGase具有10.1的选择性，hGH转化率是38.1。来自拉达卡轮枝链霉菌(S./a^/6^朋wm)的GlyPro-mTGase—Y62H—Y75F的序列如SEQIDNo.4所示。来自拉达卡轮枝链霉菌(S./a^^朋wm)的肽前肽-(3C)-MTGase的序列如SEQIDNo.5所示。实施例10测试来自拉达卡轮枝链霉菌(/"^A:朋"m)和茂原链霉菌(mo6ame朋e)的mTGase对hGH中的Gin-141相对于Gln-40的选择性该实验使用2种hGH突变体，各自用天冬酰胺残基替代在位置Gln-40和Gln-141之一处的谷氨酰胺，剩下Y又一个谷氨酰胺进^f亍反应。所述突变体的制备描述在KunkelTA等，MethodsinEnzymologyHi,367-382(1987),和ChungNanChang等，Cell189-196(1987)。hGH突变体Q40N是hGH中Gln-141的模型底物，Q141N是Gln-40的模型底物。向含有225mM1,3-二氨基-2-丙醇和35mMTris的400pl緩冲溶液(已经通过加入浓HCl将pH调节至8.0)中，加入600pi突变体hGH(1.5mg/ml)和5piTGase(1.6mg/ml),在25。C温育反应混合物30分钟。随后使用MonoQ5/5GL1ml(GEHealth)柱和280nm紫外检测，通过FPLC进行分析。緩冲液A:20mM三乙醇胺pH8.5;緩冲液B:20mM三乙醇胺0.2MNaClpH8.5;流速0.8ml/mm。洗脱梯度定义如下步骤时间/min%A%B12.00100.00.024.0070.030.035.0070.030.0435.0050.050.0然后从2种产物Q141和Q40的2个曲线下的面积(取任意单位)(如图3和4所示)的比，计算选择性比。当使用来自拉达卡轮枝链霉菌/twb^mw附)的TGase(SEQIDNo.1)和茂原《连霉菌(mo6arae朋e)的TGase(SEQIDNo.2)时，得到的结果如表4所示。Q40N+它的产物-Q141二Q141N+它的产物-Q40,并标准化至100。39<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>hGH溶解在三乙醇胺緩沖液(20mM,pH8.5,40%v/v乙二醇)中。该溶液与溶解在三乙醇胺緩冲液(20mM,pH8.5,40%v/v乙二醇，溶解胺供体后用稀盐酸调节pH至8.6)中的胺供体例如1,3-二氨基-丙-2-醇的溶液相混合。最后，加入溶解在20mMPB,pH6.0中的来自茂原链霉菌(S.的AlaPro-mTGase(AlaPro-mTGase-SM)或来自4i达卡4仑枝链霉菌/^fo^mwm)的GlyPro-mTGaseY62H—Y75F(GlyPro-mTGaseY62H_Y75F-SL)(~0.5-7mg/ghGH)的溶液，调节体积达到5-15mg/mlhGH(20mM,pH8.5)。将合并的混合物在室温温育1-25小时。如表5和图5所示，通过CIEHPLC分析反应混合物。TA40是指在位置40转氨基，TA141是指在位置141转氨基，TA40/141是指在位置40和141转氨基。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>Y62H—Y75F-SL515*原料中的75y。hGH#濕1如果在所述胺供体中存在潜在的官能团，则由步骤a)所得的转氨基化的hGH可任选地进一步反应，以活化该官能团。由步骤a)或b)所得到的官能化的hGH然后和能够与被引入到hGH的官能团进行反应的适当官能化的PEG进行反应。作为例子，可通过使羰基部分(醛或酮)与烷氧胺进行反应形成肟键。实施例13拉达卡轮枝链霉菌(S./a^y^肌m)的TGase突变体的选择性在室温下在含有100pM单丹酰基尸胺(通过溶解醋酸粉末，并用1MTns-HCl,pH8.5緩冲来制备)和50pMQ141N或Q40N人生长激素的20mMTns-HCl,pH7.4和200mMNaCl緩沖液中进行每个反应。将TGase加入混合物来启动反应。每30秒，在ext/em.340/520nm测量荧光。估计Q40N和Q141N的初始反应速率，并用于计算选择性。该实验中几种拉达卡轮枝链霉菌(S./ad"^mwOGlyPro-TGase突变体的结果如表6所示。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>权利要求1.分离的肽，其包含与SEQIDNo.1中的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在与SEQIDNo.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250对应的一个或多个位置处被修饰。2.根据权利要求1的分离的肽，其包含与SEQIDNo.1中的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述序列在与SEQIDNo.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250相对应的一个或多个位置处被修饰。3.根据权利要求2的分离的肽，其包含在SEQIDNo.1中定义的氨基酸序列，其中所述序列在与SEQIDNo.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250相对应的一个或多个位置处一皮-修饰。4.根据权利要求l-3中任一项的分离的肽，其中通过在N-末端添加1-10个氨基酸残基来修饰所述氨基酸序列。5.根据权利要求4的分离的肽，其中添加的二肽基是Gly-Pro-。6.根据权利要求4的分离的肽，其中添加的二肽基是Ala-Pro-。7.根据权利要求1-4中任一项的分离的肽，该肽具有转谷氨酰胺酶活性。8.根据权利要求5或权利要求6的分离的肽，该肽具有转谷氨酰胺酶活性。9.根据权利要求7或权利要求8的分离的肽，该肽具有与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141的特异性，该特异性高于具有SEQIDNo.1所示氨基酸序列的肽与hGH的Gln-40相比对hGH的Gln-141所具有的特异性。10.核酸构建体，其编码根据权利要求1-9中任一项的肽。11.根据权利要求10的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含核酸序列，该核酸序列编码蛋白酶底物氨基酸序列，该蛋白酶底物氨基酸序列被表达为所述核酸构建体编码的根据权利要求1-9中任一项的肽的N-末端部分或C-末端部分。12.载体，其包含根据权利要求IO或权利要求11的核酸。13.载体，其包含根据权利要求IO或权利要求11的核酸。14.宿主细胞，其包含4又利要求12的载体。15.组合物，其包含根据权利要求1-9中任一项的肽。16.制备根据权利要求1-9中任一项的肽的方法，其中I)在允许表达所述肽的条件下，发酵能够重组表达所述肽的宿主细胞；和II)在任何其它离子交换层析之前，对包含来自步骤l)下的发酵的重组肽的组合物进行阳离子交换层析。17.制备根据权利要求1-9中任一项的肽的方法，其中a)在允许表达所述肽的条件下，发酵能够重组表达所述肽的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含根据权利要求13的载体；和b)用能切割蛋白酶底物氨基酸序列的蛋白酶对包含来自a)下的发酵的重组肽的组合物进4亍处理。18.缀合肽的方法，其中所述方法包括，在存在根据权利要求1-9中任一项的肽时，使所述肽与胺供体反应。19.根据权利要求18的缀合肽的方法，其中要缀合的肽是生长激素。20.根据权利要求19的缀合生长激素的方法，其中所述生长激素是hGH或其变体或衍生物，其中相对于在对应于hGH的位置Gln-40的位置处缀合的hGH的量，在对应于hGH的位置Gln-141的位置处缀合的生长激素的量，与在所述方法中使用具有SEQIDNO.l所示氨基酸序列的肽替代根据权利要求1~9中任一项的肽时，相对于在对应于hGH的位置Gln-40的位置处缀合的hGH的量，在对应于hGH的位置Gln-141的位置处缀合的hGH的量相比显著增加。21.制备在对应于位置141的位置缀合的hGH的方法，其中所述方法包括，在存在根据权利要求1-9中任一项的肽时，使所述hGH与胺供体反应。22.制备缀合的生长激素药物制剂的方法，该方法包含下述步骤在存在根据权利要求1-9中任一项的肽时，使所述hGH或其变体或右f生物与胺供体反应。23.制备聚乙二醇化的生长激素药物制剂的方法，该方法包含下述步骤在存在根据权利要求1-9中任一项的肽时，使所述hGH或其变体或衍生物与胺供体反应；和使用所得到的缀合的生长激素肽制备聚乙二醇化的生长激素，其中所述聚乙二醇化发生在缀合的位置。24.权利要求1-9中任一项的肽在制备缀合的生长激素中的应用。25.治疗患者中与生长激素缺乏有关的疾病或障碍的方法，该方法包括，为有此需要的患者给药使用根据权利要求22或权利要求23的方法制备的药物制剂。全文摘要提供了来自拉达卡轮枝链霉菌(Streptoverticilliumladakanum)的转谷氨酰胺酶变体，所述变体具有提高的对人生长激素的Gln-141的选择性。文档编号C12N9/10GK101679503SQ200880005249公开日2010年3月24日申请日期2008年2月22日优先权日2007年2月22日发明者C·常,J·苏,L·诺斯科夫-劳里特森,S·胡,王建华,昕赵申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司