抗fgf23抗体和含有该抗体的药物组合物的制作方法

专利名称：抗fgf23抗体和含有该抗体的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可以与FGF23抗原特异性结合的抗FGF23抗体。而且， 本发明还涉及一种可用于预防或治疗FGF23过量引起的或其他原因引起的 矿物质代谢紊乱的药物，其包含抗FGF23抗体作为活性成分。尤其是，本 发明涉及一种用于治疗低血磷症性询偻病(hypophosphatemic ricket)和软骨 病(osteomalachia)的药物。
背景技术：
作为一种可以刺激成纤维细胞系NIH3T3细胞增长的物质，成纤维细胞 生长因子首次分离纯化自牛垂体。然后，从不同组织中分离出多种类似的蛋 白质，这些蛋白质产物组成了一个多肽家族(FGF家族)。到目前为止，在 脊推动物中，得到分离纯化的FGF家族成员已有22种蛋白质。关于这些蛋 白质的生物学活性，目前已知，其不仅具有成纤维细胞生长活性，还具有多 种其它不同功能如中胚层和神经外胚层生长活性，血管生成活性，特定发育 阶段肢芽形成活性等。FGF的基因表达也具有位置和时间差异性。它通常仅 仅表达于特定发育阶段或成人的某些位点。目前已知，至少有四个编码FGF 受体的基因，FGFR1,FGFR2， FGFR3，和FGFR4。另夕卜，关于FGFR1, FGFR2， FGFR3,已知的是，对于每一种受体，由于不同的剪切方式，产生的受体蛋 白具有不同的胞外结构域。另外，目前已知，肝素和疏酸乙酰肝素蛋白聚糖 通过与FGF和FGF受体的相互作用而控制其活性。另外，还有很多虽因具 有与FGF相似的结构，而属于FGF家族，但其生物学活性和受体结合特性 等几乎不明。有一篇综述(详情请看文献Ornitz, D.等，Genome biology, 2: 3005.1-3005.12， 2001)总结了这些FGF家族成员的特性。
FGF23 ( —般来讲，有时候也被记作FGF-23 )的首次克隆是利用FGF15 同源性的数据库搜索和PCR方法自小鼠获得的。随后，利用小鼠FGF23同 源序列，人FGF23也得到克隆。人FGF23是一条由251个氨基酸残基组成 的多肽。另外，预计，作为分泌信号序列，在蛋白质分泌时，多肽N-末端由多达24个氨基酸组成的氨基酸序列被剪切(详情请看文献Yamashita, T 等，Biochem.Biophy. Res. Commun.， 277: 494-498, 2000)。然后，对常染色体 显性型低血磷症性询偻病/软骨病(以下称作ADHR)的研究发现，ADHR 病人的基因突变区域变窄(narrow down)，随着相关基因鉴定的进展，发 现ADHR病人的FGF23基因发生了 一个导致此现象的特有的错义突变(详情 请看文献White, K.E.等，Nature Genet.， 26: 345-348， 2000)。这些发现强烈 表明，FGF23在体内具有重要的生理学意义。另一方面，是什么在决定FGF23 的生物学活性，这通过低血磷症性佝偻病和软骨病的一种类型-肿瘤性软骨 病(neoplastic osteomalacia)得到了研究。在这些疾病中，恶性肿瘤产生和 分泌一种液态疾病起始因子，正如所想的那样，像低血磷症性钩偻病和软骨 病等疾病是由此疾病起始因子导致的。
在对所述由恶性肺瘤产生的疾病起始因子的研究中，FGF23作为一种在 肿瘤中过量表达的基因被克隆。此外，通过给予这种因子，低血磷症性佝偻 病/软骨病被重现(详情请看文献Shimada， T.等，Proc. Natl. Acad. Sci., 98: 6500-6505, 2001 以及 International Publication Number WO02/14504 pamphlet)。基于以上研究表明，在体内，FGF23表现出与磷和钙元素相关的 的代谢控制有关的生物学功能。另外，由此表明，作为系统性因子，FGF23 通过体内循环来实现自己功能。此外，最近的研究显示与健康人相比，肺瘤 性软骨病患者血管中FGF23浓度更高(详情请看文献Yamazaki, Y.等，J. Clin. Endocrinol. Metab.， 87: 4957-4960， 2002以及Jonsson， K. B.,等，N. Engl. J. Med" 348: 1656-1663, 2003)。
此外，已知X染色体-连锁遗传的低血磷症性狗偻病(以下称为XLH) 是一种在临床上与ADHR和肿瘤性软骨病患者具有相似表现的疾病。患有 这种疾病的患者血液中也含有高水平的FGF23 (详情请看文献Yamazaki, Y. 等，J. Clin. Endocrinol. Metab.， 87: 4957-4960， 2002以及Jonsson, K. B.，等,N. Engl. J. Med., 348: 1656-1663， 2003)。
换句话说，在肿瘤性软骨病和XLH等疾病中发现的维生素D耐受性佝 偻病和软骨病的病因先前并不清楚，但而今表明此分泌性致病因子正是 FGF23。此外，在关于其它类型的矿物质代谢性疾病如骨纤维性结构不良、 麦-奥二氏综合征、常染色体隐性低血磷症性询偻病等疾病的研究中，也有 过有关血液中高浓度的FGF23与4氐血石辨症(hypophosphatemia)、佝4娄病和软骨病的相关性报道(详情请看文献Riminucci, M.等，J. Clin. Invest., 112: 683-692， 2003; Yamamoto, T.等，J. Bone Miner. Metab" 23: 231-237， 2005; Lorenz-Depiereux， B.等，Nat. Genet.， 38: 1248-1250， 2006)。
以上报道表明，体内过量表达FGF23会导致低血磷症、低血磷症伴随 性佝偻病和软骨病等疾病。此外，有报道表明，慢性肾功能不全性高血磷症 患者的血清中出现反常高水平FGF23。有证据证明FGF23的过量表达可能 与慢性肾功能不全时发生的部分矿物质代谢疾病有关(详情请看文献Gupta, A.等，J. Clin. Endocrinol. Metab.， 89: 4489-4492, 2004, Larsson, T.等，Kidney Int., 64: 2272-2279， 2003)。
由于引起这些疾病的原因是FGF23的过量表达，那么抑制FGF23的活 性或消除FGF23就可能成为治疗这些疾病的办法。到目前为止，已见有抗 -FGF23小鼠单克隆抗体用于抑制FGF23活性的研究报道(详情请看文献 Yamashita, T.等，Biochem. Biophy. Res. Commun.， 277: 494-498， 2000)。在这 篇报道中，当将抗-FGF23鼠单克隆抗体2C3B和3C1E给予正常小鼠时， 小鼠内源性FGF23功能被抑制，通过肾完成的磷排泄也被抑制。通过干扰 肾中维生素D代谢酶的表达，干扰结果表明血清中磷和la， 25-二羟维生素 D (以下记作1，25D)的浓度升高。此外，将抗-FGF23鼠单克隆抗体重复给 予Hyp小鼠，所述Hyp小鼠是一种具有高水平FGF23血清，低血磷症， 骨延长机能障碍和钾化机能障碍的XLH疾病的模型小鼠，其结果，可以看 到小鼠血液中磷浓度升高，而且，骨延长机能障碍和钙化机能障碍症状得到 改善。通过这些结果可以看到，FGF23活性抑制性抗体作为一种用于FGF23 过量表达型疾病的治疗药物是可行的。然而，在文献报道中所用到的2C3B 和3C1E抗体是鼠源抗体。鼠源抗体会被人宿主当做异物从而导致人宿主产 生一种所谓的"人抗鼠抗体"(也即是HAMA)反应，这可能会导致严重的副 作用(详情请看文献Van Kroonenbergh， M. J.等，Nucl. Med. Commun.9: 919-930， 1988)。
为避免产生这种问题， 一种解决方法是研制嵌合型抗体(详情请看欧洲 专利申请公告号120694说明书和欧洲专利申请公告号125023说明书)。
和人源抗体恒定区等)。这种类型的嵌合型抗体的优势是原鼠源抗体的对抗 原的结合特性得到保留。但是，另一方面，嵌合型抗体仍然会诱导人宿主产生"人抗嵌合型抗体，，(也即是"HACA")反应(详情请看文献Bruggemann， M. 等，J. Exp. Med.， 170: 2153-2157， 1989)。
此外，已经有重组型抗体被研制出来，其中，只有取代型抗体的一部分 是互补决定区(complementarity determining region ， CDR)(详情请看英国专 利号GB2188638 A专利说明书和美国专利号5585089专利说明书)。应用 CDR移植技术，制成一种由鼠CDR、人可变构架区和恒定区组成的抗体(也 即是人源化抗体)(详情请看文献Riechmann, L.等，Nature, 332: 323-327, 1988)。目前已经知道，使用上述方法，抗-FGF23鼠源抗体(如2C3B抗体 等)可通过人抗体序列取代鼠源抗体而被人源化。然而，在发生人源化时， 有可能导致对抗原的亲和性降低。
另外，目前对由XLH等类似疾病引起的低血症性佝偻病的主要治疗方 法是定期口服给药维生素D制剂和磷酸。但是，这种治疗手段会导致一个 问题，也即是这会导致患者及其家庭要承受由每天用药次数和剂量决定的相 当大的负担。因此，为减轻患者及其家庭承受的这种负担，需要对血清磷酸 盐浓度和血清1，25D浓度有长时间持续性增长作用的(sustained raising action)低血磷症治疗性药物，从而延长给药之间的间隔时间。

发明内容
本发明的目的是提供人抗FGF23抗体及其药物组合物，所述药物组合 物例如用于预防或治疗等作用并且几乎没有副作用的药物，其通过利用所述 抗体抑制FGF23作用并由此预防和治疗疾病。
此外，本发明的目的是提供一种抗体，所述抗体是能用作低血磷症治疗 药物的抗-FGF23抗体，与现有的抗-FGF23抗体相比，它仅使用单一剂量即 可产生对血清磷酸盐(phosphate)浓度和血清1，25D浓度的更长时间的持续增 长作用。本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，例如使用所述抗体用 于预防和治疗FGF23相关性疾病的药物。
目前，低血磷症性佝偻病的主流治疗手段是每天数次定期口服维生素E 和磷酸盐的给药方式。然而，每天数次的大剂量口服药物，产生一个问题， 也即病人被迫承受一个大的负担。本发明荻得的抗-FGF23人单克隆抗体， C10抗体，被证实具有对血清磷酸盐浓度和血清1,25D浓度的更长时间持续 增长作用。这些表明，与目前已有的低血磷症治疗性药物相比，C10抗体可望在治疗上具有明显的优越性。
本发明如下 一种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有杂交瘤细胞 CIO(索取号FERMBP-10772)产生的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。 —种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有SEQ ID NO: 12 的从第20位Q到第136位S的氨基酸序列所示的重链氨基酸序列和/或SEQ ID NO:14的从第23位A到第128位K的氨基酸序列所示的轻链氨基酸序 列。 —种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其中，所述抗人FGF23 抗体或此抗体的功能性片段含有重链可变区和/或轻链可变区氨基酸序列； 且此重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12的从第20位Q到第136位S 的氨基酸序列所示，此轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:14的从第23 位A到第128位K的氨基酸序列所示。由杂交瘤细胞C10 (索取号FERM BP-10772)产生的抗人FGF23 抗体或此抗体的功能性片段。 —种抗体或此抗体的功能性片段，其结合于人FGF23上的全部或部 分表位，所述人FGF23上的全部或部分表位结合由杂交瘤细胞C10 (索取 号FERMBP-10772)产生的抗体。 —种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有在上述[3]中 所述的重链可变区，该重链可变区具有任何一个或所有以下互补决定区 (CDR):由SEQIDNO:40的氨基酸序列所示的互补决定区(CDR) 1，由 SEQIDNO:41的氨基酸序列所示的CDR2,以及由SEQIDNO:42的氨基酸 序列所示的CDR3。 —种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有在上述[3]中 所述的轻链可变区，该轻链可变区具有任何一个或所有以下互补决定区 (CDR):由SEQIDNO:43的氨基酸序列所示的互补决定区(CDR) 1,由 SEQ ID NO:44的氨基酸序列所示的CDR2，以及由SEQ ID NO:45的氨基酸 序列所示的CDR3。 —种抗人FGF23抗体或该抗体的功能性片段，所述抗人FGF23抗 体或该抗体的功能性片段含有重链可变区，该重链可变区具有任何一个或所 有以下互补决定区(CDR):由SEQIDNO:40的氨基酸序列所示的互补决定区(CDR)l，由SEQIDNO:41的氨基酸序列所示的CDR2,以及由SEQ ID NO:42的氨基酸序列所示的CDR3;所述抗人FGF23抗体或该抗体的功 能性片段还含有轻链可变区，该轻链可变区具有任何一个或所有以下互^^卜决 定区(CDR):由SEQIDNO:43的氨基酸序列所示的互补决定区(CDR ) 1, 由SEQIDNO:44的氨基酸序列所示的CDR2,以及由SEQIDNO:45的氨 基酸序列所示的CDR3。[9]如[1]-[8]中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段， 其中所述功能性片段是选自Fab、 Fab'、 F (ab')2、 二硫键稳定的Fv (dsFv)、 二聚化的V区域(双体)、单链Fv (scFv)和CDR的肽段。[10〗如[1]-[8]中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段， 其包含重链和/或轻链，所述重链和/或轻链具有的氨基酸序列中一个或几个 氨基酸残基被缺失、取代或添加。[11]如[1]-[10]中任何一项所述抗人FGF23抗体，其中，所述抗体的种 类是IgG、 IgA、 IgE或IgM。[12]如[ll]所述抗人FGF23抗体，其中，所述抗体的亚类是IgGl、 IgG2、 IgG3、或IgG4。[13] —种药物组合物，其含有如[1]-[12]中任何一项所述抗人FGF23抗 体或此抗体的功能性片段作为活性成分。[14] 一种药物组合物，其可通过FGF23控制磷代谢和/或维生素D4戈谢 并含有如[1]-[12]中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片4殳作 为活性成分。[15] —种用于矿物质代谢紊乱相关性疾病的预防或治疗的药物組合物， 其含有如[1]-[12]中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片^:作 为活性成分。[16]如[15]所迷药物组合物，其中，所述矿物质代谢紊乱相关性疾病选 自肿瘤性软骨病、ADHR、 XLH、骨纤维性结构不良、麦-奥二氏综合征和常 染色体隐性低血磷症。[17] —种药物组合物，其用于预防或治疗选自骨质疏松症、佝偻病、 高钙血症、低钙血症、异位钙化症、骨硬化、派杰病、曱状旁腺机能亢进症、 曱状旁腺机能减退症和搔痒症的疾病，此药物组合物含有如[1]-[12]中任何 一项所述的抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段作为活性成分，[18〗杂交瘤细胞CIO (索取号FERM BP-10772)。[19] 一种编码重链可变区氨基酸序列的核酸，其中，此重链可变区氨 基酸序列由SEQ ID NO:ll所示从第58位C到第408位A的义威基序列编码。[20] —种编码轻链可变区氨基酸序列的核酸，其中，此轻链可变区氨 基酸序列由SEQ IDNO:13所示从第67位G到第384位A的碱基序列编码。[21] —种载体，其含有如[19]或[20]中所述核酸。[22] —种宿主细胞，其含有如[21]中所述载体。[23] —种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段的制造方法，包^^步 :段。 、 ' 、 -、 、 -附图简要说明

图1为C10表达载体构建过程示意2显示的是N5KG1—C10—LH中抗体重链基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:30)和氨基酸序列(SEQIDNO:31)。图中矩形框标记的氨基酸序列为分泌 信号序列(前导序列)。图3显示的是N5KG1—C10—LH中抗体轻链基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:32)和氨基酸序列(SEQ IDNO:33)。图中矩形框标记的氨基酸序列为分泌 信号序列(前导序列)。图4显示的是C10表达载体的结构。图5A显示的是用夹心酶联免疫分析法(ELISA法)对纯化得到的全长人 FGF23蛋白进行检测所得到的测定结果，其中利用2C3B抗体或C10抗体作 为固定抗体，3C1E抗体为冲企测抗体。图5B显示的是用夹心酶联免疫分析法(ELISA法)对表达FGF23的猕猴 (cynomolgus monkey)细胞培养物上清液检测后所得到的测定结果，其中 利用2C3B抗体或C10抗体作为固定抗体，3C1E抗体为检测抗体。图6中图表所显示的是对猕猴作2C3B抗体或C10抗体给药时，随时间 推移在不同时间点猕猴血清磷浓度的检测结果。测定值以平均值+/-标准误差 表示。此外，用斯氏T检验法(Student-test)检验其与溶剂给药组的显著差 异，对有显著差异(p0.05)的测定值在图表中标上*号。图7中图表所示为以对猕猴溶剂给药5天后，猕猴血清磷浓度为基准，对猕猴作可溶性2C3B抗体或C10抗体给药5天后，猕猴血清磷浓度的升高。图8中图表所示为对猕猴作溶剂、2C3B抗体或C10抗体给药时，随 时间推移在不同时间点猕猴血清1,25D浓度的检测结果。测定值以平均值+A 标准误差表示。此外，用斯氏T检验法在同一天进行测试组与溶剂给药组之 间的显著性差异测试时，对有显著差异^<0.05)的测定值在图表中标上*号。图9中图片显示的是用C15抗体和蛋白质杂交(Western blotting )技术， 检测非强制性表达的细胞培养物上清液(作为对照)、表达FGF23的人细 胞培养物上清液和表达FGF23的猕猴细胞培养物上清液。图10显示的是pPSsFGF23载体的结构。图11显示的是pUSFGF23KI载体的结构。图12所示为3种等位基因结构 一种等位基因结构为其中的药物抗性 基因(loxp-peo，被定向， 一种等位基因结构为其中的人FGF23 (-SP) +药 物抗性基因(loxp-pecO通过pUS hFGF23 KI载体被定向， 一种等位基因结 构为其中的药物抗性基因Uoxp-pec/、 loxpv-puro")被敲除，以及DNA印迹 分析用探针的位置。对图中出现的专有名词的详细解释如下hFGF23(-SP》缺少特定的信号肽编码区的人FGF23基因。CK:小鼠Ig, 基因恒定区。loxpv-puro:其两端带有loxpv序列的嘌呤霉素抗性基因，所 述loxpv序列是具有部分突变的loxp序列。loxp-neo"":其两端带有loxp序列的新霉素磷酸转移酶抗性基因。Ck3'探针DNA印迹(Southern blotting )分析探针，用于筛选hFGF23 (-Sf + loxpv-puror基因的转入和1oxpv-puro'基因的敲除克隆。3'KO-探针DNA 印迹分析探针，用于筛选1oxp-ne(/基因的转入和敲除克隆。E: EcoRI限制酶切位点。图13中图表显示的是对照抗体或C10抗体给药处理前7天的血清 FGF23浓度的检测结果。测定值以平均值+A标准误差表示。此外，用斯氏1 检验法(Student's t-test)检验测试组与野生型小鼠组的显著差异，对有显著 差异(p0.001)的组在图表中标上***号。图14中图表显示的是对照抗体或C10抗体给药处理前7天和对照抗伟 或C10抗体首次给药处理3天后的血清磷酸盐浓度检测结果。测定值以平均 值+/-标准误差表示。此外，用斯氏T检验法检验测试组与野生型小鼠组的 显著差异，对有显著差异(p0.001)的组在图表中标上***号。另外， 一天中检验hFGF23KI型小鼠对照抗体给药组与测试组之间的显著差异时，对有显 著差异(pO.OOl)的hFGF23KI型小鼠C10抗体给药组在图表中标上并# #号。图15中图表显示的是第五次对照抗体或C10抗体给药处理1天后血清 磷浓度检测结果。测定值以平均值+A标准误差表示。此外，用斯氏T^r验 法检验测试组与野生型小鼠组的显著差异，对有显著差异(pO.OOl)的组在 图表中标上***号。另外，检验hFGF23KI型小鼠对照抗体给药组与测试组 之间的显著差异时，对有显著差异(pO.OOl)的hFGF23KI型小鼠C10抗体 给药组在图表中标上# # #号。图16中图表显示的是第四次对照抗体或C10抗体给药处理1天后动物 握力试验检测结果。测定值以平均值+A标准误差表示。此外，用斯氏T检 验法检验测试组与野生型小鼠组的显著差异，对有显著差异(pO.OOl )的组 在图表中标上***号。此外，检验hFGF23KI型小鼠对照抗体给药组与测试 组之间的显著差异时，对有显著差异(pO.OOl)的hFGF23KI型小鼠C10抗 体给药组在图表中标上# # #号。图17所示的是小鼠股骨组织染色图像，所用的股骨来自于第五次对照 抗体或C10抗体给药处理1天后的小鼠，其中使用的染色方法为 Villanueva-Goldner染色法。图18中图表显示的是小鼠胫骨灰烬重量占胫骨干重的比值测定结果， 其中所用的股骨来自于第五次对照抗体或C10抗体给药处理1天后的小鼠。 测定值以平均值+/-标准误差表示。此外，用斯氏T 4企验法4企验测试组与野 生型小鼠组的显著差异，对有显著差异(pO.OOl)的组在图表中标上***号。 另外，检验hFGF23KI型小鼠对照抗体给药组与测试组之间的显著差异时， 对有显著差异(pO.OOl)的hFGF23KI型小鼠C10抗体给药组在图表中标上 # # #号。[序列表纯文本]SEQIDNO: 1-3、 5-27、 30-33、 44-50 合成 优选实施方式详述下面，通过对本发明中所用到的专有名词定义的阐述，对本发明作详纟B说明。I、本发明中的抗体1.抗-FGF23抗体和它的功能性片段本发明所述抗体是抗-FGF23抗体，其是成纤维细胞生长因子(FGF) 家族的成员。在本发明中，抗FGF23抗体与FGF23或其部分相结合，对FGF23或其 部分具有反应活性，或识别FGF23或其部分。抗FGF23抗体也被称为抗 -FGF23抗体。在本发明中，抗体是免疫球蛋白，其中，组成该免疫球蛋白 的重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、轻链恒定区的所有结构区域均来 自于编码此免疫球蛋白的基因。此抗体优选单克隆抗体。在这里，FGF23的 部分表示SEQ ID N0:4所示的FGF 23全长氨基酸序列的一部分氨基酸序 列，且此部分是包括连续性氨基酸序列的FGF 23肽段。优选此抗体含有 SEQ ID NO:12中从第20位Q到第136位S的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:14中从第23位A到第128位K的氨基酸序列。此抗体更优选是由杂交 瘤细胞C10产生的抗体。SEQ ID NO:12是包含前导序列在内的抗FGF 23 抗体的重链可变区的氨基酸序列，SEQ ID NO:12中从第20位Q到第136 位S的氨基酸序列是此氨基酸序列被剪去前导序列后形成的成熟氨基酸序 列片段。另外，SEQIDNO:14是包含前导序列在内的抗FGF23抗体的轻链 可变区的氨基酸序列，SEQ ID NO:14中从第23位A到第128位K的氨基 酸序列是此氨基酸序列被剪去前导序列后形成的成熟氨基酸序列片段。关于 抗体类型，免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白A (IgA)、免疫球蛋白E (IgE) 和免疫球蛋白M(IgM)均可被使用。优选免疫球蛋白G(IgG)，进一步地， 对于免疫球蛋白G(IgG)的亚类，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4均可被使用，优 选IgGl、 IgG2和IgG4。更优选IgGl。本发明所述抗体也包括抗FGF23抗体，此抗体含有新型互补决定区 (CDR)氨基酸序列。CDR存在于抗体可变区，这部分结构提供抗原识別特异性。可变区的(framework region ， FR)。恒定区存在于重链和轻链的C-末端，且分别称 为重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)。出现在重链可变区的互补决定区是互补决定区1 (CDR1)、互补决定区 2 (CDR2)和互补决定区3 (CDR3)。在重链可变区的这3种互补决定区一起 被称为重链互补决定区。同样地，出现在轻链可变区的的3种互补决定区是 互补决定区1 (CDR1)、互补决定区2 (CDR2)和互补决定区3 ( CDR3)。在 轻链可变区中的这3种互补决定区一起被称为轻链互补决定区。这些互补决 定区的序列可利用在美国公共卫生和人类服务部(1991)的"具有免疫学重 要性的蛋白质序列"(Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Depl Health and Human Services (1991))等中所描述的方法获得。本发明所述抗体优选具有SEQIDNO:40中所示的CDRl、 SEQ ID NO: 41中所示的CDR2和SEQ ID NO:42中所示的CDR3中的至少任意一种或 所有互补决定区作为抗体的重链互补决定区。另外，本发明所述抗体优选具 有SEQ IDNO:43中所示的CDRl、 SEQ IDNO:44中所示的CDR2和SEQ ID NO:45中所示的CDR3中的至少任意一种或所有互补决定区作为抗体的 轻链互补决定区。本发明所述抗体优选是与FGF23结合的抗体，并具有SEQ IDNO:40中所示的CDR1、 SEQ ID NO:41中所示的CDR2和SEQ ID NO:42 中所示的CDR3作为抗体的重链互补决定区，且具有SEQIDNO:43中所示 的CDR1、 SEQIDNO:44中所示的CDR2和SEQ ID NO:45中所示的CDR3 作为抗体的轻链互补决定区。本发明所述抗体的CDR序列没有特别限制。然而，本发明所述抗体优 选包含SEQ ID NO:40 -45所示的互补决定区序列中^f壬一种或多种互补决定 区，更优选包含3种重链互补决定区，更进一步优选包含所示6种互补决定 区。对互补决定区以外的其他氨基酸序列没有特别限制。本发明所述抗体包 括所谓的CDR移植型抗体，其中，所述移植型抗体中互补决定区以外的氨 基酸序列来自于其它抗体，尤其是来源于其它物种的抗体。在这些CDR移 植型抗体中，优选CDR以外的氨基酸序列来源于人的人源化抗体或人抗体。 才艮据需要，可以对FR进行一个或多个氨基酸残基的添加、缺失、取代和, 或插入。用于制造人源化抗体或人抗体的方法可用公知的方法。"功能性片段"指抗体的部分(部分片段)，具有此抗体对抗原的一种或 多种活性(action)。换句话说，指保留了与抗原的结合能力、对抗原的反 应活性或者对抗原的识别能力的片段。例如，Fv、 二硫键稳定的Fv(dsFv)、 单链Fv (scFv)、及其聚合物等。更具体的例子包括那些含有Fab、 Fab'、 F14(ab')2、 scFv、双体(diabody) 、 dsFv和CDR的肽[D. J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.， 1998 T. J. International Ltd]。
利用木瓜蛋白酶处理与FGF23结合的抗体得到这些片段中，Fab片段为 具有与抗原结合活性，分子量约为50，000的抗体片段。Fab片段中单条重链 (H链)的氨基酸末端一侧将近一半区段和单条完整轻链(L链)通过二硫键连 接在一起。
本发明中的Fab片段可通过木瓜蛋白酶处理与FGF23结合的抗体而制 得。或者通过将编码此抗体Fab片段的DNA序列插入原核生物用表达载体 或真核生物用表达栽体中，再将此载体转入原核生物和真核生物中后，表达 此栽体后获得。
利用胃蛋白酶处理IgG得到的片段中，F (ab')2片段为具有与抗原结合活 性，分子量约为100,000的抗体片段。F(ab')2片段比通过绞链区二硫键结合 在一起的Fab片段还要大。
本发明中的F(ab')2片段可通过胃蛋白酶处理与FGF23结合的抗体而制 得，或者通过以下所述的利用二疏键或硫醚键将Fab'连接一起而制得。
Fab'是一种分子量约为50,000，具有抗原结合活性的抗体片段。其中， 所述F (ab')2铰链区的二硫键被切断。
本发明中的Fab'可通过用还原剂二疏苏糖醇处理本发明中能与所述 FGF23结合的F(ab')2而得。或者通过将编码此抗体Fab'片段的DNA序列插 入原核生物用表达载体或真核生物用表达栽体中，再将此载体转入原核生物 和真核生物中后，表达此载体后获得。
scFv是一种具有抗原结合活性的抗体片段，它是由单条重链可变区(以 下记作VH)和单条轻链可变区(以下记作VL)通过合适的肽段连接物(以下记 作P)连接组成的VH-P-VL或VL-P-VH型多肽。
本发明中的scFv片段可通过获取与FGF23结合的本发明所述抗体中编 码VH和VL的cDNA,构建编码scFV的DNA序列，并将编码此抗体片段 的DNA序列插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将此载 体转入原核生物和真核生物中后，表达此栽体后获得。
双体是一种由scFv二聚化形成的抗体片段，它具有双价抗原结合活性。 双《介抗原的结合活性可以相同也可以不同。
本发明的双体的制备，可通过获取与本发明FGF23结合的所述抗体中编码VH和VL的cDNA,按照使肽段连接物的氨基酸序列的长度在8个残 基以下的方式，构建编码scFV的DNA序列，并将所述DNA序列插入原核 生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将此载体转入原核生物和真核 生物中后，表达此载体后获得。
在dsFv中，组成sFv的VH和VL片段中各有一个氨基酸残基被半胱氨 酸残基取代，这两个多肽片段通过这些半胱氨酸残基之间形成的二硫键连接 在一起。被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基的选择，可按照Reiter等(Protein Engineering, 7: 697-704, 1994)所用方法，基于对抗体的三维结构预测来进行。
本发明中的dsFv片段的制备，可通过获取与FGF23结合的本发明所述 抗体中编码VH和VL的cDNA,构建编码dsFv的DNA序列，并将编码此 抗体片段的DNA序列插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中， 再将此载体转入原核生物和真核生物中后，表达此载体后获得。
构建的含有互补决定区的肽段至少含有一种以上的VH或VL互补决定
接。 、，、 P 、、、、'、 、 、、、
本发明中包含互补决定区的肽段的制备，可以通过构建编码与FGF23 结合的本发明所述抗体VH和VL互补决定区(CDR)的DNA序列，并 将所述DNA序列插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将 此载体转入原核生物和真核生物中后，表达此载体后获得。
此外，包含互补决定区的所述肽段的制备，也可通过诸如Fmoc法(芴 曱氧丰炭基法，fluorenylmethyloxycarbonyl method)和tBoc法(#又丁氧，炭基法， t-butyloxycarbonyl method)等化学合成法制得。
此外，"功能性片段"是能与抗原(FGF23)结合的抗体的片段。这种"功 能性片段"优选可与FGF23结合的片段并包含SEQIDNO:12中从第20位Q 到136位S的氨基酸序列，和/或SEQ IDNO:14中从第23位A到第128位 K的氨基酸序列。这种"功能性片段，，优选是包含SEQ ID NO:40-45中所示至 少一种或全部互补决定区并可与FGF23结合的片段。这种"功能性片段"更 优选衍生自C10杂交瘤产生的抗体可变区并可与FGF23结合。
本发明所述抗体包括抗体衍生物，其中，将放射性同位素、低分子量药 物、大分子药物和蛋白等，通过化学方法或基因工程使之结合于本发明的抗 FGF23抗体或此抗体的功能性片段上。
16本发明所述抗体衍生物的制备，可以通过化学等方法将放射性同位素、
低分子量药物、大分子药物和蛋白等使之结合于本发明的抗FGF23抗体或 此抗体的"功能性片段"的重链或轻链的N-末端或C-末端，此抗FGF23抗体 或此抗体的"功能性片段"的合适的取代基团或侧链，此抗FGF23抗体或此 抗体的"功能性片段"的糖链等而制得(Koutai Kogaku Nyuumon, Osamu Kanamitsu, Chijin shokan， 1994)。
此外，结合了蛋白的抗体衍生物的制备，可通过将编码本发明的抗 FGF23抗体或此抗体的"功能性片段"的DNA序列与编码使之被结合蛋白的 DNA序列相连后，将此DNA序列插入表达载体后，再将此表达载体转入合 适的宿主细胞中并表达此栽体的方法制得。
对于放射性同位素，其实例包括1311、 1251等。比如，放射性同位素可 通过氯胺T标记法等方法使之与所述抗体相连在一起。
低分子量药物包括包括氮芥(nitrogen mustard)、环磷酰胺 (cyclophosphamide)在内的烷基化药物(alkylating agents ); 抗代谢药物 (antimetabolites)如5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)、曱氨蝶呤(methotrexate ) 等；抗生素(antibiotics )如道诺霉素(daunomycin)、争光霉素(bleomycin)、 丝裂霉素C (mitomycin C)、柔红霉素(daunombicin)和阿霉素(doxorubicin ) 等；植物碱(plant alkaloids)类，如长春新碱(vincristine)、 长春花碱 (vinblastine)和长春地辛(vindesine)等；抗癌药物如激素类药物三苯氧胺 (tamoxifenand )和地塞米松(dexamethasone) (Clinical oncology; Japanese Clinical Oncology Research Meeting, Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Co., 1996);甾族化合物(steroids)如皮质醇(hydrocortisone) 和强的+> ( prednisone)等；包4舌阿司匹4木(aspirin)和消炎痛(indomethacin) 在内的非甾族化合物；免疫调节剂(immunomodulators )如硫代苹果酸金 (gold thiomalate )和青霉胺(penicillamine )等；免疫抑制剂 (immunos卿ressors )如环磷酰胺(cyclophosphamide )和咪峻硫噪呤 (azathioprine )等；抗炎药(anti-inflammatories )如抗组胺类(anti-histamines ) 药物朴尔敏(chlorpheniramine maleate )和氯马斯'汀(clemastine )等 (Inflammation and anti-inflammatory treatment method, Ishiyaku Publishing Corp. Ltd.， 1982).可用公知的方法使所述这些低分子量药物和抗体结合，例 如，用于道诺霉素和抗体结合的方法的实例包括通过戊二醛使道诺霉素和抗
17体的氨基基团间相结合的方法，通过水溶性碳化二亚胺使道诺霉素的氨基基 团和抗体的羧基基团结合在一起的方法。通过将低分子量药物和抗体结合在 一起，可制得具有该低分子量药物功能的抗体衍生物。
对于大分子药物，其实例包括聚乙二醇(以下记作PEG)、白蛋白、右旋 糖酐、聚环氧乙烷、苯乙烯-马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、 羟丙基曱基丙烯酰胺等。通过将这些大分子化合物结合在抗体或抗体的"功 能性片段"上，预期获得以下几种效果(l)提高其对各种化学、物理和生物 因子的稳定性。(2)显著延长其在血液中的半衰期，(3)免疫原性消失，抗体 产生被抑制等(Bioconjugate Pharmaceutical, Hirokawa Shoten, 1993)。用于结 合PEG和抗体的一种方法的实例是与PEG修饰性试剂反应的方法。PEG修 饰性试剂的实例包括e-氨基基团修饰剂赖氨酸(Laid-Open Patent Publication Number S61-178926)、羧基基团修饰剂天冬氨酸和谷氨酸(Laid-Open Patent Publication Number S56-23587)、胍基基团修饰剂精氨酸(Laid-Open Patent Publication Number H2-l 17920)等。
结合了蛋白的所述抗体也可以作为一种融合抗体被制得。换句话说，将 编码所述抗体或此抗体的功能性片段的cDNA与编码特异性蛋白的cDNA连 接在一起，则编码由所述抗体和特异性蛋白组成的融合蛋白的DNA即被构 建。这^爻DNA^L插入原核生物用或真核生物用表达栽体中。将此表达载体 转入原核生物和真核生物中后，表达此载体后，即可生产得到与特异性蛋白 相结合的所述融合抗体。
关于本发明中所述抗FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其对人FGF23 结合活性或对人FGF23的功能抑制活性的评估，可通过免疫学方法检测如 ELISA法(Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996)，或通过生物传感技术如Biacore生物传感器测定其结合 解离常数(Journal of Immunological Methods, 145: 229-240, 1991)，以及通过 检测用klothoc表达细胞对人FGF23刺激引起的早期生长反应基因-1启动子 活性的抑制作用(Nature，444:770-774，2006)等来进行。
在本发明中，"人抗体，，被定义为来源于人的抗体基因的基因表达产物的 抗体。正如下面所描述的那样，可以通过将此人抗体基因位点转入动物，从
而将抗原给予有产生此人源抗体能力的转基因动物后获得。这些转基因动物的实例包括小鼠。能产生人抗体的小鼠的已建立的方法描述在，如国际专利
出版号WO02/43478中。
对于本发明所述抗体的实例包括下面实施例中所述的由C10杂交瘤细胞产生的抗体(C10抗体)。在2007年2月2日，C10杂交瘤细胞已经进行基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏在专利有机体保藏中心(Centra16， 1-1Higashi l-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,日本)独立的4亍政才几构"先进工业科学和技术研究院(Advanced Industrial Science and Technology )，，， 索取号为FERMABP-10772 (识别表示CIO)。
本发明抗体或其功能性片段也包括包含重链和/或轻链的单克隆抗体或其功能性片段，组成所述重链和/或轻链的氨基酸序列各具有一个或几个氨基酸缺失、取代和添加。在此，"1个或几个"、"几个"指的是9个以下，优选5个以下，更优选3个以下，尤其优选2个。如先前所描述氨基酸序列的部分修饰(缺失、取代、插入、添加)可通过对编码此氨基酸序列的核苷酸序列的部分修饰而被引入组成本发明所述抗体或功能性片段的氨基酸序列。这些核苷酸序列的部分修饰可通过已知的位点特异性突变引入法的常规方法被引入[ProcNatl Acad Sci USA., 81: 5662-5666, 1984]。本发明所述抗体包括所有免疫球蛋白类型和同种型的抗体。
本发明所述抗FGF23抗体可通过以下生产方法制得。如将FGF23 ,或FGF23的一部分，或者FGF23的一部分和合适的能引起其抗原的抗原性增长的药物载体物(例如，牛血清白蛋白等)所形成的偶合物(conjugate)，必要时与相应的佐剂(弗氏完全或不完全佐剂等)一起免疫所需的非人哺乳动物如人抗体生成转基因小鼠。对于FGF23，天然型或重组型FGF23均可使用。或者，通过将编码FGF23的基因转入表达载体并在此动物体内表达此FGF23蛋白的方法来产生免疫致敏作用。通过杂交瘤(由来自免疫致敏动物的抗体生成细胞和没有抗体生产能力的骨髓瘤细胞融合而成)的培养，产生与用于免疫作用的抗原有特异亲和性的单克隆抗体，筛选产生所述单克隆抗体的克隆，由此制得了单克隆抗体。
本发明所述抗体包括那些通过利用所属领域技术人员熟知的基因工程修饰技术(例如，参见欧洲专利申请EP314161)而被转换成不同亚类的抗体。也即是说，通过基因工程技术，利用编码本发明所述抗体可变区的DNA,可以制得一种不同于原有亚类的亚类抗体。
192.本发明所述抗体的生产
生产一种单克隆抗体包括以下几个步骤。也即是
(l)用作免疫原的抗原蛋白或该抗原蛋白表达载体的制备，(2)通过动物体内抗原注射或动物体内抗原表达，免疫动物后，抽取动物血样和分析血样中抗体滴度，且在确定脾脏分离时间后，制备抗体生产细胞(3)制备骨髓瘤细胞(4)融合抗体生产细胞和骨髓瘤细胞(5)篩选能产生目标抗体的杂交瘤细胞团(6)杂交瘤细胞团被打散成单个细胞克隆(7)可任选地培养杂交瘤或饲养已被移植杂交瘤的动物以用于大量单克隆抗体的生产(8)检测分析以此种方法生产的单克隆抗体的生物活性和识别特异性，或检测作为标记性试剂的特性。
下文将按上面步骤对抗-FGF23单克隆抗体的生产方法作详细描述。然而，这种抗体的生产方法并不限于此种方法。如，也可使用脾脏细胞以外的抗体生成细胞和骨髓瘤细胞(此抗体的生产)。
(1) 抗原的纯化
作为抗原，可使用利用基因重组技术，将编码FGF23的DNA序列整合到一个合适的表达质粒上，在FGF23于宿主如大肠杆菌或动物细胞等中产生后，已纯化的FGF23蛋白。因为人FGF23蛋白的一级结构是公知的[GenBank索取号No. AAG09917, SEQIDNO:4],利用本领域技术人员熟知的方法化学合成的来源于FGF23氨基酸序列组成的不完全肽段也可当作此抗原使用。
(2) 抗体生成细胞的制备步骤
已制得的上述(l)所提到的抗原与佐剂如弗氏完全或不完全佐剂或铝钾等混合，且混合物作为免疫原免疫实验动物。对于所述实验动物，最适合使用具有人源抗体生产能力的转基因小鼠。此类小鼠在参考文献[Tomizuka.等，Proc Natl Acad Sci USA., 97: 722-727, 2000]中被Tomizuka等描述。
免疫小鼠时，免疫原的给药方法可以是皮下注射、腹腔注射、静脉注射、皮内注射、肌肉注射、足趾注射等方法中的任意一种。优选腹腔注射、足趾注射或,f"3永注射。
可进行一次免疫或在一个合适的时间间隔内进行多次免疫。随后，测量存在于免疫动物血清的抗所述抗原的抗体滴度。当使用具有很高抗体滴度的动物作为抗体生成细胞的生产原料时，后续操作步骤的效率将得到提高。一般来讲，优选使用来源于最终免疫后3-5天的动物的抗体生成细胞用于后续
的细胞融合。
在这里，用于抗体滴度检测方法的例子包括如^:射性同位素免疫定量测定法(以下记作"RIA法")、固定酶免疫定量测定法(以下记作"ELISA法")、荧光抗体法、被动血凝反应法等各种公知技术。从检测灵敏度、快速性、精确性和自动化操作的可行性来看，RIA法或ELISA法是合适的方法。
本发明所述抗体的滴度检测，例如使用ELISA检测法，可通过以下步骤进行。首先，将抗人抗体的抗原被吸附于ELISA96孔板等的固定表面。然后，用与此抗原无关的蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)，封闭没有吸附抗原的此固定表面。漂洗此表面后，与作为一抗的连续浓度梯度稀释的试剂(如来自于具有人抗体生产能力的转基因小鼠的血清)接触反应，以使所述抗原与样品中的抗-FGF23抗体相结合。再然后，作为二抗的酶标记抗人抗体被加入，此二抗可与所述人抗体结合。漂洗后，加入所述酶的底物。然后，检测因底物降解引起的颜色变化所导致的光吸收改变，以计算抗体滴度。
(3) 骨髓瘤制备步骤
对于骨髓瘤，可使用来源于哺乳动物如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人等自身不具有抗体生产能力的细胞。 一般来讲，优选使用来自于小鼠的细胞系，如8-氮鸟嗓呤抗性小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8U.1 (P3-U1) [Yelton, D.E.等，Current Topics in Microbiology and Immunology, 81: 1-7, 1978]，P3/NSI/l-Ag4画l (NS-1) [Kohler, G.等，European J. Immunology, 6: 511-519，1976]， Sp2/0-Agl4 (SP2/0) [Shulman, M.等，Nature, 276: 269-270， 1978],P3X63Ag8.653 (653) [Kearney, J. F.等，J. Immunology, 123: 1548-1550, 1979],P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K.和Harris, A. W" Nature, 256: 495-497, 1975]等。这些细胞系的继代培养要用合适的培养基，如8-氮鸟嘌呤培养基[一种补充有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清(FCS)、还有8-氮鸟嘌呤的RPMI-1640培养基]、Iscove's Modified Dulbecco's培养基(IMDM)或Dulbecco，s改良(Modified) Eagle培养基(DMEM培养基)。然而，在细胞融合前3-4天，细胞系的继代培养要用正常培养基(如包含有10% FCS的DMEM培养基)，为细胞融合准备的细胞数目不低于2xl07。
(4) 细力包融合
抗体生成细胞是浆细胞和其前体细胞的淋巴细胞。这些细胞可以从生物
21个体任意位置获得。 一般来讲，脾脏、淋巴结、骨髓、扁桃体、外周血、或者它们的合适组合均可被融合。
一般来讲，最常使用脾脏细胞。.
最后一次免疫动物后，存在抗体生成细胞的部位，如脾脏，从能得到指定的抗体滴度的小鼠中分离出来，从而制得作为抗体生成细胞的脾脏细胞。下一步，融合脾脏细胞和骨髓瘤细胞。对于脾脏细胞和步骤(3)中得到的骨髓瘤细胞的融合方法，最常用的方法是使用聚乙二醇。这种方法的细胞毒性相
对较低，融合操作也筒单容易。这种方法有以下步骤，比如
将脾脏细胞和骨髓瘤细胞用无血清培养基(如DMEM)或磷酸盐緩冲生理盐水(PBS)漂洗好，脾脏细胞和骨髓瘤细胞以5:1-10:1的比例混合并离心。移去上清液，打散沉淀的细胞团，边搅拌边加入1 mL含500/。 (w/v)聚乙二醇(分子量1000-4000)的无血清培养基。然后，緩慢加入10mL的无血清培养基,随后离心。弃去上清液，在正常培养基(以下称HAT培养基)中悬浮沉淀的细胞，所述正常培养基(HAT培养基)含有合适量的次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶脱氧核苷(以下称HAT)溶解物和人白细胞介素-6 (以下称IL-6)。这些细胞被等量均分至培养板各孔(以下称培养板)，并在37。C和存在5%C02的条件下培养约两个星期。在培养期间，根据需要补充HAT培养基。(5)杂交瘤细胞团的筛选
上述所提到的骨髓瘤细胞为8-氮鸟噤呤抗性抹时，也即是说，如果它是一种次黄嘌呤-鸟噤呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷性细胞株时，没有融合的骨髓瘤细胞或仅由骨髓瘤细胞融合形成的融合型细胞，在含有HAT的培养基中不能存活。而另一方面，仅由抗体生成细胞形成的融合型细胞，或由抗体生成细胞与骨髓瘤细胞形成的融合型细胞杂交瘤细胞是能够生存的。但是仅由抗体生成细胞融合形成的融合型细胞的生存周期是有限的。因此，通过在含HAT培养基中的持续培养，仅仅由抗体生成细胞与骨髓瘤细胞形成的融合型细胞杂交瘤细胞能够生存。从而，杂交瘤细胞可被筛选出来。
对于正在克隆中生长的杂交瘤，培养基被换成不含氨基蝶呤的培养基(以下称作HT培养基)。然后，收集部分培养基上清液，用如ELISA法检测抗-FGF23抗体滴度。
上面，为利用8-氮鸟噤呤抗性细胞系的方法示例。但是，其他细胞系也可相应地应用于杂交瘤细胞的筛选方法。在这些情况下，所使用的培养基组合物也可变化。(6) 克隆步骤
通过利用与(2)中所用相同的抗体滴度检测方法检测抗体滴度，决定用于生产所述特异性抗体的杂交瘤细胞被移至另一个培养板，并进行克隆。克隆方法的实例包括限制性稀释法，在此方法中，杂交瘤细胞被稀释至培养板中每个培养孔仅含有一个杂交瘤细胞，并被培养；软琼脂培养法，在这种方
法中，杂交瘤细胞被培养在软琼脂培养基中，克隆被收集； 一种在此方法中用显微操作器每次转移一个细胞并对其培养的方法；分类机分拣克隆法，在这种方法中，利用细胞分拣机分离单个细胞等。限制性稀释法较为简单和常用。
关于培养孔，在培养孔里抗体滴度被观察到，如，当利用限制性稀释法重复克隆2-4次时，产生具有稳定的抗体滴度的细胞系被筛选出来，以用作抗-FGF23单克隆抗体生成杂交瘤细胞系。
(7) 通过杂交瘤细胞培养制备单克隆抗体
将HT培养基换成正常培养基，以培养已完成克隆的杂交瘤细胞。对于大规模培养，有利用大容量培养瓶的循环培养、旋转器培养，或利用中空纤维系统的培养等。通过用本领域技术人员熟知的方法如凝胶过滤等方法对大规模培养上清液的纯化，获得抗-FGF23单克隆抗体。此外，通过将所述杂交瘤在相同品系小鼠(如BALB/c)或nu/nu小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔等腹膜中的生长，获得含有大量抗-FGF23单克隆抗体的腹膜液。简单的抗体纯化方法是使用商品化的单克隆抗体纯化试剂盒(比如，MAbTrap Gil kit; GEHealthcare Bioscience Co.)等。
以这些方法获得的单克隆抗体具有高抗FGF23抗原特异性。
此外，重组型抗体的制备可通过利用基因重组技术(Delves, P. J.，ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.， 1997 WILEY,Shepherd, P. 和 Dean C., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORDUNIVERSITY PRESS, Goding， J. W.， Monoclonal Antibodies: principles andpractice., 1993 ACADEMIC PRESS),从骨髓瘤等抗体生成细胞中克隆编码所述抗体的基因，将此基因整合到一种合适的载体并转入一种宿主(如哺乳动物细胞系、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)而得到。
本发明包括含有由产生本发明抗体的杂交瘤产生的抗体的基因序列的核酸，尤其包括下述的含有由本发明的杂交瘤产生的抗体的重链可变区和轻
23链可变区的核酸。在这里，核酸包括DNA和RNA。此外，本发明也包括本 发明中所述的重链可变区和轻链可变区成熟片段的核酸，在此，所述成熟片 段是指去除所述信号肽序列后剩余的重链可变区和轻链可变区肽段。此外， 除上述的核酸外，本发明中所述核酸还包括具有与本发明中所述抗体氨基酸 序列的氨基酸和所述抗体重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸相对应的密 码子的核酸。
为制备编码来自于所述杂交瘤的单克隆抗体的基因， 一种方法被运用， 按照这种方法，编码所述单克隆抗体每条轻链可变区，轻链恒定区，重链可 变区，重链恒定区的DNA可通过PCR等方法得到制备。在此制备方法中， 根据抗-FGF23抗体基因或其氨基酸序列设计的寡DNA被用作引物。对于模 板，从杂交瘤中制得的DNA可用作模板。所述这些DNA被整合到一个合 适的载体上并被转入宿主细胞后，得到表达，或者将这些DNA—起整合到 一个合适的载体后共表达。
对于载体，可以使用能在微生物宿主中自主生长的噬菌体或质粒。对于 质粒DNA，其实例包括来源于大肠杆菌、枯草杆菌或酵母等的质粒。对于噬 菌体DNA，其实例包括人噬菌体。
所有能表达目的基因的宿主均可用作转化宿主。其实例包括细菌(大肠 杆菌、枯草杆菌等)、酵母、动物细胞(COS细胞、CHO细胞等)和昆虫 细胞等。
将基因转入宿主中所用的方法是众所周知的，可例举出许多方法(如钙 离子法、电穿孔法、原生质体法、乙酸锂法、磷酸钙、脂质体转染法等)。 此外，将基因转入下述动物中所用的方法，其实例包括以下所述方法显微 注射法、应用电穿孔技术或脂质体转让法将基因转入胚胎细胞的方法、以及 核移植法等。
在本发明中，可通过培养转化子，以及对培养产物的收集，获得抗-FGF23 抗体。在这里，"培养产物，，表示以下的任何一种(a)培养物上清液，(b)培 养的细胞或培养的菌体或它们的匀浆，以及(c)转化子分泌物。为了培养转 化子，要使用适合所用宿主的培养基，并使用静止培养法、滚瓶培养法等培 养方法。
培养完毕后，当所述目标抗体产生于细菌菌体或细胞内时，所述抗体通 过细菌菌体或细胞的匀浆得到收集。此外，当所述目标抗体产生于细菌菌体或细胞外时，培养物溶液被直接使用，或者是通过离心等方法除去细菌菌体 或细胞。随后，通过单独使用或适当组合使用各种用于蛋白质分离纯化的色 谱技术的常规生物化学方法，从所述培养产物中分离纯化所述目标抗体
此外，利用转基因动物构建技术，构建所述目标抗体基因被整合为内源 基因的动物宿主如转基因牛、转基因山羊、转基因绵羊或转基因猪等。从这 些转基因动物分泌的奶中可以得到大量的来源于所述目标抗体基因的单克
隆抗体(Wright， G.,等，Bio/Technology 9: 830-834， 1991)。当在体外培养杂交 瘤时，按照培养细胞的特性、试验研究的目的和培养方法等各种条件，使所 述杂交瘤得到生长、保持和储存。已知营养培养基或各种来源和制备于已知 基础培养基的营养培养基可被用于在培养上清液中生产所述单克隆抗体。 (8)所述单克隆抗体的分析
在这些方法中制得的所述单克隆抗体的同型类和亚类分析可通过以下 方法进行。首先，筌定方法的实例包括平板双向扩散(Ouchterlony)法、ELISA 法或RIA法等。平板双向扩散法较简单，但当所述单克隆抗体浓度低时， 必需进行浓缩操作。另一方面，当使用ELISA法或RIA法时，培养上清液 可直接与被吸附于固定表面的抗原反应，且通过使用与各种免疫球蛋白的同 型类和亚类反应的抗体作为二抗抗体，可对所述单克隆抗体的同型类和亚类 进行鉴定。
此外，可用Folin/Lowry法，以及通过计算其在280 nm的光吸收[1.4 (QD280)-免疫球蛋白lmg/mL]的方法，进行蛋白质定量。
所述单克隆抗体识别表位的鉴定(表位作图)按如下进行。首先，构建单 克隆抗体识别的分子的各部分结构。对于部分结构的构建，其方法如下一 种方法是采用众所周知的寡肽合成技术，制取分子的各部分肽段;一种方法 是利用基因重组技术将编码所述目标部分肽段的DNA序列整合到一个合适 的表达质粒，所述肽段在宿主如大肠杆菌等体内或体外制得。然而，为实现 上述目的， 一般是将上述两种方法组合使用。例如，利用本领域技术人员熟 知的基因重组技术构建以随才几长度从羧基末端或氨基末端开始连续性缩短 的抗原蛋白多肽系列。然后，研究所述单克隆抗体与这些多肽的反应活性， 并大致确定其识别位点。
以下，作更详细的说明，利用本领域技术人员众所周知的寡肽合成技术， 合成这些肽的相应部分的寡肽或变体等。为了确定表位，研究单克隆抗体与
25这些多肽的结合能力，所述单克隆抗体含有在本发明用于预防或治疗的药物 中作为活性成分，或者研究这些多肽对所述单克隆抗体与相应抗原的结合能 力的竟争性抑制活性。作为获得各种寡肽的简单方法，可使用商品试剂盒(如
SPOTs kit (Genosis Biotechnologies),利用多肽合成技术的多肽系列合成试剂 盒(Chiron Co)等)
(9)所述抗体片段的生产
基于上述(7)中所描述抗体，利用基因工程或蛋白质化学方法生产所述抗 体片段。
对于基因工程技术方法，其实例是构建编码目的抗体片段的基因，并 用合适的宿主如动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌等表达此基因， 纯化所述抗体片段。
对于蛋白质化学方法，其实例是蛋白酶(如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等) 被用于特异性位点剪切并进行纯化。
对于所述抗体片段，其实例是含有Fab、 F (ab')2、 Fab'、 scFv、双体、 dsFv、 CDR的肽段等。每一种抗体片段的生产方法将在下面得到详细描述。
(i) Fab的生产
Fab可用蛋白质化学方法，通过利用木瓜蛋白酶处理IgG制得。木瓜蛋 白酶处理后，如果所述初始抗体是具有蛋白A结合能力的IgG亚类，则通 过蛋白A层析柱，分离IgG分子和Fc片段，回收均质Fab(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第三版，1995)。如果所述抗体为不具有蛋 白A结合能力的IgG亚类抗体，利用离子交换层析，Fab从被洗脱在低盐浓 缩液的片断中得到回收(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第三 版，1995)。 此外，对于利用基因工程技术获得Fab,在大多数情况下使用大 肠杆菌，或者使用昆虫细胞和动物细胞等来生产Fab。如，在上面2(7)中被 描述的编码所述抗体可变区的DNA被克隆到Fab表达载体中，以构建Fab 表达载体。对于所述Fab表达载体，任何可使Fab的DNA得到整合和表达 的质粒都可使用。 一个实例是pIT106 (Science, 240: 1041-1043, 1988)等。Fab 表达载体被转入合适的大肠杆菌，并可生成并聚集于包涵体或外周质中。对 于来自于包涵体的Fab，可通过被常用于蛋白质的重折叠的方法而被激活。 此外，当Fab表达于外周质时，具有活性的Fab被释放到培养上清液中。利 用结合有抗原的层析柱，经过重折叠处理或来自于培养上清中的Fab被纯化得到均质Fab (Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992).
(ii)F(ab')2的生产
F(ab')2可用蛋白质化学方法，通过利用胃蛋白酶处理IgG制得。胃蛋白 酶处理后，利用与Fab相同的纯化操作，可回收得到均质F (ab')2 (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，第三版，1995)。此外，也可通过马来酰亚 胺类(如o-PDM或双马来酰亚胺己烷等)处理以下(iii)所述的Fab',形成硫 醚键，或者通过DTNB (5,5'-二硫代-双(硝基苯曱酸))处理，形成S-S键的 方法，得到F (ab')2 (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(iii) Fab'的生产
Fab'可通过用还原性试剂(如二硫苏糖醇等)处理上述(ii)中所述的F (ab')2制得。此外，Fab'的生产可用基因工程技术，在大多数情况下使用大肠 杆菌，或者使用昆虫细胞和动物细胞等。例如，在上述2(7)中的编码所述抗 体可变区的DNA被克隆到Fab'表达栽体中，以构建Fab'表达载体。对于所 述Fab'表达载体，任何可使Fab'的DNA得到整合和表达的质粒都可使用。 一个实例是pAK19 (BIO/TECHNOLOGY， 10: 163-167, 1992)等。Fab'表达载 体被转入合适的大肠杆菌。Fab'可生成并聚集于包涵体或外周质中。对于来 自于包涵体的Fab',可通过被常用于蛋白质的重折叠的方法而被激活。此外， 当Fab'表达于外周质时，通过溶菌酶部分消化、渗透压休克、超声波裂解等 方法，匀浆细菌，这些(Fab')可从菌体外得到回收。利用G蛋白层析柱等， 经过重折叠处理或来自于细菌匀浆液中的Fab'被纯化得到均质 Fab'(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。 (iv) scFv的生产
利用基因工程技术，可用噬菌体或大肠杆菌或昆虫细胞或动物细胞等来 生产scFv。如，在上述2(7)中的编码所述抗体可变区的DNA被克隆到scFv 表达载体中，以构建scFv表达载体。对于所述scFv表达载体，任何可使scFv 的DNA得到整合和表达的质粒都可使用。其实例包括pCANTAB5E (GE Healthcare Bioscience Co.)， pHFA (Human Antibodies & Hybridomas, 5: 48-56, 1994)等。将scFv表达载体转入合适的大肠杆菌，通过使辅助性噬菌体感染， 可得到其中scFv以与噬菌体表面蛋白融合的形式而被表达于噬菌体表面的
27噬菌体。此外，scFv可生成并聚集于转入有scFv表达载体的大肠杆菌的包 涵体或外周质中。对于来自于包涵体的scFv,可通过被常用于蛋白质的重折 叠的方法而被激活。此外，当scFv表达于外周质时，通过溶菌酶部分消化、 渗透压休克、超声波裂解等方法，匀浆细菌，这些(scFv)从菌体外被回收。 利用阳离子交换层析等，经过重折叠处理或来自于细菌匀浆液中的scFv被 纯化得到均质scFv (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
(v) 双体的生产
利用基因工程技术生产双体时，主要使用大肠杆菌，也可使用昆虫细胞 和动物细胞。例如，制备DNA,其中连接上述2 (7)中所述抗体的VH和 VL,从而接头(linker)编码的氨基酸残基为8个残基或更少，并将其克隆 到双体表达载体上，从而构建了双体表达载体。任何可使双体DNA得到整 合和表达的质粒都可用作双体表达载体。其实例包括pCANTAB5E (GE Healthcare Bioscience)、pHFA (Human Antibodies Hybridomas， 5, 48， 1994)等， 双体可产生和聚集在转入双体表达载体的大肠杆菌包涵体或外周质中。从包 涵体中获得的双体，可通过常被用于蛋白质的重折叠法而被激活。此外，当 (双体)被表达于外周质时，通过溶菌酶部分消化、渗透压休克、超声波裂 解法等方法，匀浆细菌，这些(双体)从菌体外被回收。通过使用阳离子交 换层析等技术(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996) 处理,经过重折叠处理或来自细菌匀浆液的双体被纯化得到均质双体。
(vi) dsFv的生产
利用基因工程技术生产dsFv时，主要使用大肠杆菌，也使用昆虫细胞 和动物细胞。首先，将突变引入到在上述(ii)、 (iv)和(v)中编码抗体VH和 VL的DNA的合适位点，从而得到所述编码的氨基酸残基被半胱氨酸取代 的DNA。所述制得的每条DNA均可被克隆于dsFv表达载体中以构建VH和 VL表达载体。任何可使dsFv的DNA得到整合和表达的质粒均可用作dsFv 表达载体。例如pUL19 (Protein Engineering, 7: 697-704, 1944)等。所述VH 和VL表达载体可被转入合适的大肠杆菌中，且其可在包涵体或外周质中产 生和聚集。获得来自包涵体或外周质的VH和VL,并使之混合，dsFv可通 过常被用于蛋白质的重折叠法而被激活。经过重折叠法处理后，可通过离子 交换层析法和凝胶过滤法进一步纯化(Protein Engineering, 7: 697-704， 1994)。(vii) CDR肽的生产
含有CDR的肽可通过化学合成法(如Fmoc法或Boc法等)制得。此 外，CDR肽表达载体可通过制备编码含有CDR肽的DNA,并克隆于合适 的表达载体后获得。任何可使编码CDR肽的DNA得到整合和表达的质粒均 可用作所述表达载体。如pLEX (Invitrogen)和pAX4a+ (Invitrogen)等。所 述表达栽体可被转入合适的大肠杆菌中，且其可在包涵体或外周质中产生和 聚集。从包涵体或外周质中得到CDR肽，并可通过离子交换层析法和凝胶 过滤法对其进行纯化(Protein Engineering, 7: 697-704, 1994)。 3.本发明中所述抗体和此抗体的功能性片段的特征 本发明中所述抗体和此抗体的功能性片段具有任何以下特征
(a) FGF23结合试验；与具有SEQ IDNO:4中从第25位到第251位的氨 基酸残基的全长FGF蛋白序列结合。
(b) 体外试验；一种检测方法中FGF23的活性受抑制，利用此检测方法 可以;险测FGF23活性。体外检测FGF23活性的一个方法的实例是用FGF23 剌激引起早期生长反应基因-1的启动子活化(Nature, 444: 770-774, 2006)。
(c) 体内实-睑；对人给药时，抑制内源性FGF23活性，增加血清磷浓度 和血清1,25D浓度。与常规抗体(2C3B抗体(抗FGF23蛋白的小鼠单克隆 抗体，公开于WO03/057733,由索取号为FERMBP-7838的杂交瘤细胞产生 的抗-FGF23抗体)相比，血清磷浓度和血清1，25D浓度增加程度更大，且增 加血清磷浓度和血清1，25D浓度的持续时间长。比如，当给予猕猴时，其引 起血清磷浓度升高的持续时间约是2C3B抗体的约3倍以上，优选约5倍， 其引起血清1,25D浓度升高的持续时间约是2C3B抗体的约1.5倍以上，优 选约2.5倍。
本发明也包括编码本发明的抗FGF23抗体的氨基酸序列的核酸。此核 酸可以是DNA或RNA。本发明中的核酸，优选编码C10杂交瘤产生的抗 体的氨基酸序列的核酸。 一个实例是编码重链可变区的氨基酸序列的核酸 (C10抗体的重链核酸序列)，所述氨基酸序列由SEQIDNO:ll中从第58 位C到第408位A的核香酸序列编码。此外，另一个实例是编码轻链可变 区的氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列由SEQ ID NO: 13中从第67位G 到第384位A的核苷酸序列编码。
29II.药物组合物
制剂，即含有本发明的人抗-FGF23抗体或此抗体的功能性片段的药物 组合物包括在本发明范围内。这种制剂，除所述抗体或此抗体的功能性片段 之外，优选包括生理上可接受的稀释剂或药物载体，或可以是一种与其他药 物(如其它抗体或抗生素)的混合物。合适的药物载体包括生理盐水、磷 酸盐緩冲生理盐水、磷酸盐緩冲生理盐水葡萄糖溶液、緩冲生理盐水，但不 限于这些载体。此外，抗体可以是冻干的和在必要时添加上述緩冲液后得到 重建。给药方法包括口服给药、或肠胃外给药如口腔内、气管支气管内、 直肠内、皮下注射、肌肉注射、静脉注射等给药，优选给药方法优选静脉注 射给药。可通过各种制剂形式进行给药，这些剂型包括气雾剂、胶嚢、药 片、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏剂和胶布制剂(tapes)。
被制成液态制剂如乳剂和糖浆剂时，可使用添加剂如:水;糖类如蔗糖、 山梨醇和果糖等;醇类如聚乙二醇、丙二醇等;油类如芝麻油、橄揽油和大豆 油等;防腐剂如对羟基苯曱酸酯类等；调味剂如草莓调味剂和薄荷等。
被制备胶嚢、药片、粉剂、颗粒剂等时，可使用添加剂如赋形剂如乳 糖、葡萄糖、蔗糖、和甘露(糖)醇等；崩解剂如淀粉、海草酸钠等；润滑剂 如硬脂酸镁和滑石粉等;粘合剂如聚乙烯醇、羟丙基纤维素和凝胶等；表面活 性剂如脂肪酸酯等；增塑剂如丙三醇等。
注射制剂可使用的添加剂包括水；糖类如蔗糖、山梨醇、木糖、海藻 糖、果糖等；糖醇如甘露(糖)醇、木糖醇和山梨糖醇等；緩冲液如磷酸盐緩 冲液、柠檬酸盐緩冲液和谷氨酸盐緩冲液等；表面活性剂如脂肪酸酯等。
肠胃外给药的合适制剂包括注射剂、栓剂、气雾剂等。在使用注射剂 时，通常以单剂量安瓿或多剂量容器的形式被提供。它可能是合适的粉剂， 在使用时以合适的药物载体，如不含热源质的无菌水重新溶解。这些制剂含 有常被用于制剂配制的添加剂如乳化剂、悬浮剂等。注射剂使用方法包括, 如静脉输注、静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射等。 此外，给药剂量随给药对象的年龄、给药方式、给药频率而不同，并能在很 宽范围内调整。.
栓剂可用药物载体(如可可脂、氢化脂肪、羧酸等)进行配制。气雾剂 可用载体所述抗体或此抗体的功能性片段本身进行配制，或者用载体进行配 制，所述载体对给药对象(患者)的口部和呼吸道粘膜不产生刺激作用，且
30能使所述抗体或此抗体的功能性片段扩散成微粒，使其容易吸收。
载体的具体实例包括乳糖、丙三醇等。根据所述抗体或此抗体的功能性 片段的特性和所用载体的特性，可选用气雾剂、干粉等剂剂。此外，在口服 制剂中所用的添加剂组分也可添加到这些肠胃外给药制剂中。
所用剂量一般因症状、年龄、体重等而异，但是一般来说，对成年人的
口服给药，约为每天0.01 mg-1000mg。此剂量可一次给药或分成几次给药。 在肠胃外给药时，可通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射每次的给药量为 0.01 mg - 1000 mg。
本发明包括本发明所述抗体，或此抗体的功能性片段，或使用包含本发 明所述抗体、或此抗体的功能性片段的药物组合物预防或治疗下述疾病的方 法，此外，本发明还包括本发明所述抗体、或此抗体的功能性片段在制备用 于预防或治疗下述疾病的药物中的用途。
可被本发明所述抗体、或此抗体的功能性片段预防和治疗的疾病包括 具有FGF23过度活性的疾病，如肺瘤引起的软骨病(tumor-induced osteomalachia ) 、 ADHR 、 XLH 、骨纤维性结构不良、麦-奥二氏 (McCune+Albright)综合征，以及伴随有异常矿物质代谢的疾病如常染色 体隐性低血磷症。此外，(本发明)还有望提高对低血磷症、骨盐沉积衰竭、 骨骼疼痛、肌肉无力、骨骼畸形、成长障碍、低1,25D血症等疾病相关的综 合征的疗效。由于FGF23在生理条件下具有重要作用，被磷代谢和维生素D 代谢控制所介导的FGF23钾代谢控制活性，可通过本发明所述抗体、或此 抗体的功能性片段来调控，因此，它们(本发明所述抗体、或此抗体的功能 性片段)可用于预防和治疗由矿物质代谢和维生素D代谢异常所导致的疾 病，如骨质疏松症、佝偻病(包括低血磷症性佝偻病和维生素D抗性佝偻 病)、高4丐血症、低钧血症、异位钩化症(ectopic calcification)、骨硬化、 派杰(Paget，s)病、甲状旁腺机能亢进症、曱状旁腺机能减退症、搔痒症等。 此外，本发明所述抗体或此抗体的功能性片段也可用于以肾病性骨营养不 良、透析性骨病、肾小管功能障碍为代表的由肾衰竭透析和肾衰竭并发症引 起的疾病的预防和治疗。另一方面，据^艮道，1,25D不^f义具有上述的对矿物 质代谢(如钙代谢等)的活性，也具有细胞生长抑制作用、细胞分化活性等。 因此，本发明所述抗体或此抗体的功能性片段也可用于其生长分化由1，25D 调控的细胞引起的疾病的预防和治疗。此外，众所周知，在肿瘤引起的软骨病中，由肿瘤引起的FGF23过量 表达可导致病变。因此，可以想到，通过使用连接有放射性物质(如放射性 同位素等)、或者连接有各种毒素治疗试剂(如低分子量药物等)的本发明 抗体，和所述抗体在过量产生FGF23的胂瘤中的聚集，会导致肺瘤回缩。
III.制剂实例
包含本发明所述抗体或此抗体的功能性片段的制剂,以溶解在水或除水 以外的药理上可接受的溶液中的无菌溶液或悬浮液的安瓿形式供使用。此 外，也可将无菌粉剂(优选冻干的本发明所述抗体分子)填充在安瓿中，使 用时用药理上可接受的溶液稀释后供使用。
实施例
下面是通过实施例对本发明作更详细描述，但这并不意味着本发明仅受 限于实施例的这些描述。
实施例1
重组人FGF23表达载体的制备。
(1)人FGF23H蛋白表达载体的构建。
使用可造成肿瘤引起的软骨病(tumor-induced osteomalachia)的肿瘤的 人cDNA文库为模板，扩增编码人FGF23基因的cDNA,所述操作过程使 用FlEcoRI引物(SEQ ID NO:l)和LHisNot引物(SEQ ID NO: 2)和 LA-TaqDNA聚合酶，进行35个PCR循环，每个PCR循环的组成为96°C 保温1 min,然后96。C 30秒，55。C 30秒和72。C 30秒。所述FlEcoRI引物在 退火后与存在于编码人FGF23基因的核苷酸片段5'上游远端的序列结合， 并在扩增获得的编码人FGF23基因的核苷酸片段5'端处引入EcoRI限制性 酶切位点。所述LHisNot引物中含有可与编码人FGF23基因的核苷酸序 列中的终止密码子5'端发生退火的序列、编码末端(terminal)密码子的序 列(其在编码His6标记序列(His- His- His- His- His- His )和Notl限制性位 点的序列之后)。结果，扩增片段编码人FGF23蛋白，在所述FGF23蛋白 的羧基末端被加入一段His6-标记的序列，其下游处有一个Notl限制酶位点。 所述扩增片^:经EcoRI和Not I消化后，与同样经EcoRI和Notl消化的动
32物细胞表达载体pcDNA3.IZeo (Invitrogen)相连接。以这种方法构建的所述表 达载体被克隆且其核苷酸序列得以确定， >匸人而确认该表达载体编码添加有 His6标记序列的目标蛋白，即人FGF23蛋白。所述载体被称为 pcDNA/hFGF23H。
FlEcoRI: CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG ( SEQ ID
LHisNot:
CGAA ( SEQ ID NO:2)
(2)人FGF23蛋白表达载体的构建
用pcDNA/hFGF23H作为模板扩增片段，其中使用FlEcoRI引物和LNot 引物(SEQIDNO:3)和LA-TaqDNA聚合酶，进行25个PCR循环，每个PCR 循环的组成为94°C保温lmin,然后94°C 30秒，55°C 30秒和72°C lmin。结 束反应后，所述编码人FGF23片段用EcoRI和Notl进行消化处理，然后纯化。 通过将其插入到pEAK8/IRES/EGFP载体的EcoRI和Notl限制酶位点，这些 纯化得到的片段被克隆，所述pEAK8/IRES/EGFP载体是动物细胞表达载体， 其是通过在pEAKS (Edge Biosystem)内连接分子内核糖体进入序列 (intramolecular ribosomal entry sequence , IRES)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 而得到的。由此获得的质粒的核苷酸序列得以确定，从而确认其编码人FGF23 蛋白。所述载体被称为pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23。
LNot: ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA ( SEQ ID NO:3)
(实施例2)
(l)重组人FGF23蛋白和重组突变型人FGF23 H蛋白的表达。 通过对所述载体中氨千青霉素抗性基因上Fspl限制酶位点的剪切，使 pcDNA/hFGF23H被线性化并被纯化，然后与鼠CHO克隆-1细胞(Shirahata, S.,等，Biosci Biotech Biochem， 59: 345-347， 1995)混合，并利用Gene Pulser II (Bio Rad)穿孔仪，使用电穿孔法被转染到此细胞内。在用含有10% FCS的 MEM a培养基(Gibco BRL)培养这些细胞24小时后，培养基中加入Zecocin (Invitrogen)到终浓度0.5 mg/ml，然后(用此培养基)培养所述细胞1个星期。胰酶消化后，贴壁生长的细胞被释放，并通过有限稀释法，使其在Zecocin 终浓度为0.3 mg/ml的条件下被克隆，以得到很多的细胞克隆。利用蛋白质 印迹(Westem blotting)技术，表达人FGF23H效率最高的细胞被鉴定出来。 每个细胞克隆的培养上清液都被收集并对其进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳，然后将(电泳得到的)蛋白转移到PVDF膜(Millipore)上。通过使用抗 -His-tag(羧基末端)抗体和ECL光致发光系统(photo-luminescent, GE Healthcare Bioscience),检测出来自约32kDa附近的FGF23 H蛋白的信号。 因此，具有最高表达能力的被称为#20的细胞克隆被发现，此细胞克隆被命 名为CHO-OST311H，并于2000年8月11日保藏于位于日本的国际专利生 物体保藏中心国立先进工业科学和技术研究院(International Patent Organism Depositary (IPOD) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)) ， Tsukuba Central 6， 1-1-1 Higashi, Tsukuba， Ibaraki (保藏 号FERM BP-7273)。在本说明书中，CHO-OST311H被称作CHO-hFGF23H。
(2) 人FGF23表达细胞的获得
pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23载体对CHO Ras克隆-1细胞的转染通过使 用膜融合脂的基因转染方法完成。当培养于6孔培养板中的CHO Ras克隆-l 细胞已经覆盖住所述6孔培养板底部约60%时，移去所述培养基，并加入l ml无血清的MEMa培养基。2.5 (tig转入载体和10 pi Transfectam(注册商标) (Promega)分别与50 pi MEMa无血清培养基混合，两种溶液混合后，静置 10min。将混合物加入事先准备好的6孔板的培养孔中。孵育2小时后，移 去含有DNA的培养基，换上含有10%FCS的培养基，孵育培养物一整夜。 第二天，加入嘌呤霉素(Sigma)至终浓度5 pg/ml，以选择具有药物抗性的 细胞。通过有限稀释法，由此获得的具有药物抗性的细胞被克隆。此外，利 用蛋白质印迹技术，得到表达目标蛋白效率最高的细胞系。所述细胞被称为 CHO-hFGF23。
(3) 重组人FGF23蛋白在动物细胞中的表达和检测。 用抗羧基端-His6标记序列的抗体对培养物上清液中CHO-hFGF23H重
组物的蛋白质印迹，检测到两条约为32kDa和10kDa的条带。将这两条带 从凝肢中切出，并测定其N-末端氨基酸序列。在较大分子量条带(约为32kDa) 中，所检测到的序列是从SEQ ID NO: 4中第25位氨基酸开始的氨基酸序 列，它可被视为是在分泌过程中其信号肽段序列已被切除的人FGF23蛋白。
34另一方面，在较小分子量条带中，所^r测序列被确认是从SEQ IDNO:4中第 180位氨基酸开始的氨基酸序列，事实证明此片段是179与180位氨基酸 之间发生剪切后产生的羧基末端片段。此外，通过利用可识别所述人 FGF23N-末端一侧的多克隆抗体对其的检测，具有从第179位氨基酸开始到 N-末端氨基酸序列的多肽(氨基酸末端肽段)的存在也得到确认(国际专利 出版号WO02A4504)。
相似地，在所述不具His6标记序列的CHO-hFGF23培养上清液中，发 生于第179与180位氨基酸残基之间的剪切也得到确认(国际专利出版号 WO02/14504)。因此，以下的操作被用于分离和纯化没有发生剪切的全长人 FGF23蛋白，所述全长人FGF23蛋白具有SEQ ID NO: 4中从第25位到第 251位的氨基酸序列(有时称作全长FGF23)。
(4)重组全长人FGF23蛋白的纯化
所述CHO-hFGF23培养上清液用SuperCap (注册商标)(Pall Gelman Laboratory)过滤，所使用的SuperCap是一种孔径为0.2 pm的膜过滤装置， 过滤所得滤液通过SP-Sepharose FF (GE Healthcare Bioscience)。与层析柱结 合能力较弱的物质被50mM的磷酸钠盐緩沖液(pH6.7)漂洗和洗脱下来。 所述(洗脱)成分包括发生于第179与180位氨基酸残基之间的剪切作用 产生的所述羧基末端片段。吸附在层析柱中的蛋白被浓度梯度为0-0.7M的 NaCl溶液洗脱下来，全长人FGF23蛋白在约0.3 M NaCl溶液的洗脱成分中 被观察到。下一步，全长人FGF23蛋白被吸附到金属亲和性层析柱Talon Superflow (注册商标)(Clonetech)中，并经50 mM的磷酸钠盐緩冲液(pH 6.7)漂洗，通过加入不同浓度咪唑，将所述全长人FGF23蛋白洗脱纯化。
包含目标蛋白的所述(洗脱)成分被SP-Sepharose FF柱吸收，洗脱后 纯化。
人FGF23氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY
SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR
AKRAFLPGMN PPPYSQFLSR R函PLIHFN TPIPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQELPSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF I (实施例3)
生产人抗体的小鼠的产生(KM小鼠)
用于制备人单克隆抗体的生产完全人抗体的小鼠具有内源性Ig重链和 K-轻链都被破坏的纯合体遗传背景，同时具有包含人Ig重链基因位点的第 14号染色体片段(SC20)和人IgK-轻链转基因(KCo5)。所述小鼠通过A品系 小鼠和B品系小鼠的杂交育种获得，其中A品系小鼠具有人Ig重链基因位 点，B品系小鼠具有人IgK-轻链转基因(KCo5)。所述A品系小鼠为内源性 Ig重链和K-轻链都被破坏的纯合体，且具有可被传递给后代的第14号染色 体片段(SC20)的小鼠品系。此小鼠品系在如Tomizuka等作出的报道中被描 述(Tomizuka,等，ProcNatl. Acad. Sci. USA., 97: 722-727， 2000)。此外，所述 B品系小鼠为内源性Ig重链和K-轻链都被破坏的纯合体，且具有所述人Ig K-轻链转基因(KCo5)的转基因小鼠品系。此小鼠品系在如Fishwild等作出的报 道中被描述(Nat. Biotechnol., 14; 845-851， 1996)。
在以下的免疫实验中所用的小鼠个体是由雄性A品系小鼠和雌性B品 系小鼠或雄性B品系小鼠和雌性A品系小鼠杂交所获得的小鼠，并且，在 此所用的小鼠血清中可同时检测到人Ig重链和K-轻链[Ishida & Lonberg， IBCs 1 lth Antibody Engineering, Abstract 2000]。此外，所述产生人抗体的小 鼠也可通过締结合约的方法从Kirin Beer Company公司获得。
(实施例4)
抗人FGF23的人单克隆抗体的制备 (l).产生抗人FGF23的人单克隆抗体的杂交瘤的获得。 本实施例中所用单克隆抗体可用普通方法制备，如，由TamioAndo等 编写的"单克隆抗体实验室操作说明"("Introduction to monoclonal antibody experimental manipulation" ) ， (Kodansha出版，1991)。实施例2中制备的全 长人FGF23蛋白被用作免疫原，使用可产生实施例3中制得的人免疫球蛋 白的人抗体生成小鼠。
为制备人抗FGF23单克隆抗体，首先，将实施例2中得到的经纯化的 全长人FGF23蛋白与RIBI佐剂(Corixa)在腹腔内混合，并在首次免疫时以
36每只小鼠20pg的剂量，将其腹腔接种于人抗体生成小鼠。与首次免疫相类 似，在两周的时间间隔内，将纯化得到的FGF23蛋白与RIBI佐剂(Corixa) 混合物共接种小鼠3次。五只小鼠被用于免疫作用，第三次免疫后，抽取血 液样本，利用下述酶标识免疫吸附法(ELISA法)，血清中抗FGF23人IgG 抗体的存在得到确认。利用ELISA方法，使用由用抗FGF23蛋白单克隆鼠 抗体—3CIE抗体而固定化的FGF23,血清中含有最高(抗FGF23人IgG抗 体)浓度值的小鼠被筛选出来，其中，所用抗FGF23蛋白单克隆鼠抗体—3CIE 抗体被公开于国际专利出版号WO03/057733 (作为FERM BP-7839被保藏 的杂交瘤产生的抗-FGF23抗体)。在进行如下所描迷的脾脏分离之前3天， 通过鼠尾静脉(接种)给药，以每个小鼠给药20 pg全长人FGF23蛋白免疫小 鼠。
所述脾脏用外科手术从经免疫的小鼠中分离出来，并被浸入含有350 mg/mL碳酸氬钠、50单位/mL青霉素、50 ng/mL链霉素的10mL无血清 DMEM培养基中(Invitrogen，以下称作无血清DMEM培养基)，然后用刮勺 (spatula)将其碾碎在滤网(mesh)上(细胞滤器Falcon)。通过此滤网(mesh) 的所述细胞悬浮液经离心后，生成细胞沉淀，然后，用无血清DMEM培养 基漂洗这些细胞两次，接着，对悬浮在无血清DMEM培养基中的这些细胞 进行细胞计数。当骨髓瘤细胞SP2/0 (ATCC No. CRL-1581)在含有10% FCS (Sigma)的DMEM(Invitrogen)培养基(以下称作含血清DMEM培养基)中，于 37。C和存在5%(302条件下进行培养时，要使其细胞密度不高于1 x 106细 胞/mL。同样，用无血清DMEM培养基漂洗这些骨髓瘤细胞，并悬浮在无 血清DMEM培养基中进行细胞计数。回收得到的脾脏细胞悬浮液与鼠骨髓 瘤细胞悬浮液按5:1的细胞数目比例混合并离心后，将上清液完全去除。对 所述细胞团，在一边用移液管尖端搅拌此细胞团时， 一边緩慢加入作为融合 介质的1 mL 50% (w/v)的聚乙二醇1500 (Boehringer-Manheim),然后分两次 緩慢加入预热到37。C的1 mL无血清DMEM培养基，再加入7 mL无血清 DMEM培养基。离心后，去除上清液，得到融合细胞。由此所得的融合细 胞用如下所述的有限稀释法进行筛选。杂交瘤的筛选通过在含10% FCS 、 IL-6 (10 ng/mL)(或10%杂交瘤克隆因子(以下称作HCF): Biobase)、次黄 嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶脱氧核苷(T)(以下称作HAT Sigma)的 DMEM培养基中培养来完成的。此外，用含HT(Sigma)、 10%FCS和10%HCF的DMEM培养基，并通过有限稀释法，进行单个克隆。(细胞的)培 养在96孔微量滴定板(Becton， Dickinson)上进行。生成抗-FGF23人单克隆抗 体的杂交瘤克隆的选择(筛选)和由各个产生杂交瘤的人单克隆抗体的品质 鉴定，通过如下所述的酶标识免疫吸附法(ELISA法)进行。结果，得到许多 杂交瘤，所述杂交瘤包含人免疫球蛋白Y链(hlg力和人免疫球蛋白轻链K,并 且可产生具有与人FGF23特殊反应活性的人单克隆抗体。从这些所得到的 许多杂交瘤中，作为产生识别FGF23蛋白的抗体的杂交瘤，特别获得2个 克隆(CIO和C15)。此外，在包括本实施例在内的以下所有实施例中，生成 本发明的抗-FGF23人单克隆抗体的各杂交瘤克隆用符号代表。在所述符号 的前或后所出现的"抗体"意指由杂交瘤生成的抗体，或由宿主细胞产生的 重组抗体，所述宿主细胞带有从所述杂交瘤中分离出来的抗体基因(全长或 可变区)。在本文明确指出的范围内，有时杂交瘤克隆的名称可表示抗体的 名称。在2007年2月2日，C10杂交瘤克隆已保藏于位于日本的国际专利 生物体保藏中心国立先进工业科学和技术研究院(International Patent Organism Depositary (IPOD) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) ), Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki ) (保藏号为FERMABP-10772) (ID标签C10)。
(2)来自于所述杂交瘤培养物上清液的C10和C15抗体的纯化 实施例4(1)中得到的C10和C15杂交瘤被限制培养在含有胰岛素 (5 |ng/ml， Invitrogen)、人转铁蛋白(5 pg/ml， Invitrogen)、 二磷脂酰甘油(O.Ol mM， Sigma)、亚竭酸钠(2.5 x 10-5 mM， Sigma)、 1% Low IgG胎牛血清 (Hyclone)的eRDF培养基(Kyokuto Seiyaku)中。所述杂交瘤被培养在长颈瓶 中，所得培养物上清液被回收。利用Protein G Fast Flow凝胶(GE Healthcare, Bioscience),使所述培养物上清液被亲和性纯化，此法使用PBS(-)为吸附緩 冲液，0.1 M甘氨酸緩冲液为洗脱緩冲液(pH2.8)。通过加入1 MTris(pH 9.0),将洗脱成分的pH值调整到约为pH7.2。使用Sephadex G25脱盐层析 柱(NAP column; GE Healthcare Bioscience),由此制得的所述抗体溶液被 PBS所置换，然后通过孔径为0.22 pm膜过滤器MILLEX-GV (Millipore)的 过滤灭菌作用，使其无菌化，从而得到纯化的C10和C15抗体。通过测定 经纯化的抗体在280 nm的吸光值，来测定其浓度，其中，计算基准为1.4 OD= 1 mg/mL。
38(实施例5)
编码C10抗体的抗体基因的获得及其序列的测定 (1). C10抗体的cDNA序列的合成
为获得表达于C10杂交瘤的含有人抗体重链和轻链的抗体可变区的所 述DNA片段，应用5'RACE法(5'cDNA末端快速扩增技术)进行克隆， 所述5'RACE法使用可与人抗体重链和轻链恒定区特异性结合的引物。具体 是，进行克隆时所用的试剂盒为BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒 (Becton Dickinson Bioscience Clonetech)，克隆按试剂盒所附的l喿作说明进 行。
根据操作说明，将RNA抽提试剂ISOGEN (Nippon Gene)加入到C10 杂交瘤中，取15 pg纯化得到的总RNA用作cDNA合成的原料。以各个约 1 的纯化获得的总RNA为模板，制得第一链cDNA。除RNA之外的所有 试剂和酶均由BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒(cDNA扩增试剂盒)提 供。
在第一链cDNA的合成中， 总RNA 1 |il
5'CDS 1 |iil
SMART Oligo 1 nl 由上述组分组成的反应混合物于70。C孵育2分钟，然后，加入 5 x Buffer 2 pi DTT 1 pi dNTP Mix 1 pi
接着,于42。C孵育1.5小时。 进一步地，加入50 pi Tricine-EDTA緩冲液，然后于72°C孵育7分钟， 获得第一链cDNA。
(2)PCR方法扩增所述重链和轻链基因，并确认其核苷酸序列 (2)-l; PCR方法扩增所述重链和轻链基因
为扩增编码所述C10抗体的基因的cDNA,下述的反应混合物被制备并 被用于PCR，所使用的一组PCR引物包括3'引物和5'引物，其中，所述3'引物序列具有对人抗体基因的特异性序列(所述特异性序列将在下面被描
述)，所述5'引物(通用引物A混合物)与添加于所述cDNA的5'末端的序列 特异性杂交结合，所述cDNA用BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒合成， 此外，PCR所用酶为KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)。
无菌水H2028 pi
第1链cDNA2.5 pi
KOD-Plus-緩沖液(10X)5
dNTP Mix (2 mM)5 pi
MgS04 (25 mM)2
KOD-Plus-(l单位/pl)1 nl
通用引物A混合物(UPM)(10X)5 Ml
基因特异性引物(GSP)(10jiM)1.5 pi
总体积50 ^
对于所述重链基因的扩增反应，所使用的引物为SMART RACE cDNA 扩增试剂盒中的UPM引物和IgGlp引物(SEQIDNO:5)，而对于所述轻链 基因的扩增，所使用的引物为SMART RACE cDNA扩增试剂盒中的UPM 引物和hk-2引物(SEQIDNO: 6)。
hk-2: GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC (SEQ ID NO:引物6) 此外，所用的反应条件如下
重复5个循环，每个循环包括94。C/30秒，72°C/3 min, 重复5个循环，每个循环包括94。C/30秒，70。C/30秒，72。C/3 min 重复25个循环，每个循环包括94。C/30秒，68。C/30秒，72°C/3 min 进一步地，2 pi所述反应混合物通过加入98 (il Tricine-EDTA緩冲液得 到稀释，所得5pl稀释液作为模板用于第二次(巢式)PCR反应
所述PCR反应溶液的组成如下
无菌水H20 30 pi
第一次PCR反应溶液(50倍稀释) 5 pi
KOD-Plus-緩沖液(10X) 5 pi
dNTP Mix (2 mM) 5 pi
MgS04 (25 mM) 2 piKOD-Plus-(l单位/inl) 巢式通用引物A (NUP; 10 fiM) 基因特异性引物(GSP)(IO, 总体积
1 pi
1 pi 1 pi 50 ^
在上述反应中，用于所述重链基因扩增的一组引物为NUP引物(在 SMART RACE cDNA扩增试剂盒中；Becton Dickinson Bioscience Clonetech) 和hh2引物(SEQIDNO:7)。用于所述轻链基因扩增的一組引物为UPM引 物和hk-5引物(SEQ ID NO:8)。所述反应温度条件如下起始温度94°C lmin,然后重复20个循环，每个循环由94°C/5sec， 68。C/10秒和72°C/3min 组成，最后，72。C加热7min。
hh2: GCTGGAGGGCACGGTCACCACGC ( SEQ ID NO:7)
(2)-2;所述抗原基因的核苷酸序列的测定
经扩增的重链PCR片段(以下称作HV[C]:由H链的5'-非翻译区的 前导序列，可变区(HV)和恒定区的部分区域[C]组成)和经扩增的轻链PCR 片段(以下称作LV[C]:由L链的5'-非翻译区的前导序列，可变区(LV)和 所述恒定区的部分区域[C]组成)通过乙醇沉淀法被回收，然后用琼脂糖凝 胶电泳法回收。再通过使用膜的DNA纯化试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen))进行纯化。经纯化的HV[C]扩增片段或LV[C]扩增片段分别 被亚克隆到Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Zero Blunt TOPO PCR克隆 盒)(Invitrogen)的PCR 4 Blunt-TOPO载体上，对所获得的克隆的质粒 DNA,作插入DNA的核苷酸序列分析。DNA的核苷酸序列测定所用的引物 是M13-20FW (SEQ ID NO: 9)和M13RV ( SEQ ID NO: 10)。
M13-20FW: GTAAAACGAC GGCCAGTG (SEQ ID NO:9)
M13RV: CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID NO: 10)
编码C10抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA核苷酸序列，以及重 链可变区和轻链可变区的氨基酸序列展示如下
<C10重链核酸序列> (可变区从ATG起始密码子到编码羧基末端氨基 酸残基的DNA序列)(SEQIDNO:ll)
41102030405060
A丁GGACTGGACCTGGAGGGTCTTCTGCTTGCTGGCTGTAGCTCCAGGTGCTCACTCCCAG
708090100110120
GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCC
130140150160170180
TGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAACCACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCT
190200210220230240
GGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCAACCCTATTAGTGGTAGCACAAGTAACGCA
250260270280290300
CAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATG
310320330340350360
GAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGATATTGTG
370380390400408
GATGCTTTTGATTTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
<(310重链氨基酸序列> (到前导序列和可变区)(SEQ ID NO:12)(划线 部分氨基酸残基代表作为分泌信号的前导序列)
10 20 30 40 50 60
MDWTWRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN HYMHWVRQAP 70 80 90 100 110 120
GQGLEWMGII NPISGSTSNA QKFQGRVTMT RDTSTSTVYM ELSSLRSEDT AVYYCARDIV
130 136 MFDFWGQGT MVTVSS
<C10轻链核酸序列> (可变区从ATG起始密码子到编码羧基末端氨基
酸残基的DNA序列)(SEQ ID NO: 13)
102030405060
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCC
708090100110120
AGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGA
130140150160170180
GTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGTCTGGTATCAGCAG
190200210220230240
AAACCAGGGAAAGCTCCTMGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTC
250260270280290300
CCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTG
310320330340350360
CAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATGATTACTTCACTTTCGGC
370380384
CCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
42<C10轻链氨基酸序列> (到前导序列和可变区)(SEQ ID N0:14)(划线 部分氨基酸残基代表作为分泌信号的前导序列)
10 20 30 40 50 60
MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA匹AIQLTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSALVWYQQ 70 80 90 100 110 120
KPGKAPKLLI YDASSLESGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQFNDYF丁FG
128 PGT麵K
此外，在亚克隆于载体PCR4Blunt-TOPO的C10抗体的基因序列中， 所述人抗体恒定区的部分序列被克隆，且此区域的DNA核苷酸序列也得到 分析。其结果，可确认编码由Kabat等编写的EU index中所示的重链恒定 区118位到191位氨基酸残基的序列，在此区域中，此序列被确认与人IgGl 的氨基酸序列完全一致，且C10抗体亚类为IgGl。此外，通过使用同样的 方法，编码C15抗体的抗体基因也被获得，此抗体所属序列也得到确定。
(实施例6)
重组C10抗体表达载体的构建 C10表达载体的产生(技术方案显示在图1)
利用PCR技术，使用KOD-Plus-DNA聚合酶，以获得的含有C10抗体 LV[C]链的质粒DNA为模板，使用在其末端被设计成连上限制酶切位点(5' 末端BglII,3'末端BgIII )的引物CIO—L5—Bgl (SEQ ID NO: 15)和 C10—L3—Bsi ( SEQ ID NO:16),所述C10抗体的LV (轻链的前导序列+可 变区)DNA被扩增。所述反应温度条件为起始温度94。C加热1 min，每 个循环包括94。C/5秒和68。C/45秒重复此循环35次，最后，72°C加热3min。 经扩增的DNA片段用限制性内切酶BglII和BsiWI消化处理后，再用琼脂 糖凝胶电泳法纯化，回收得到约400 bp DNA。另一方面，所述载体， N5KG1-Val Lark载体(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1修饰型载体(美国专利 6001358))同样经限制性内切酶BglII和BsiWI消化处理，并经>喊性磷酸酶 (E. coli C75) (Takara Shuzo Co.， Ltd.)去磷酸化作用处理，然后用琼脂糖凝胶 和DNA纯化试剂盒純化，回收得到稍小于9kb的DNA。这两条DNA片段 经T4DNA连接酶连接后，转染到大肠杆菌DH10B,以获得转化子。对含 有插入DNA的转化子的质粒DNA作DNA核苷酸序列分析后，获得质粒DNA, N5KG1—C10_Lv，其中，C10抗体的LV被插入到编码N5KG1 -Val Lark 人抗体轻链恒定区的5'上游处的框架内。下一步，所述C10抗体的HVDNA (重链前导序列+可变区)被插入质粒载体(N5KG1一C10-一Lv)，其中,此质粒 载体中已被插入LV。以含有所述C10抗体的HV[C]的被亚克隆于 pCR4Blunt-TOPO栽体的质粒DNA为模板，使用设计成末端连有限制酶切 位点(SalI位于5'末端，Nhel位于3'末端)的引物CIO—H5_Sal (SEQ ID NO:17)和C10—H3—Nhe(SEQIDNO:18)，用PCR扩增HV。所述反应温度 条件为起始温度94。C加热1 min，每个循环包括94。C/5秒和68。C/45 秒，重复此循环35次，最后，72。C加热7min。经纯化的扩增的HV DNA 片段被亚克隆于pCR4Blunt-TOPO载体，对由此获得的克隆的质粒DNA, 作插入DNA的核苦酸序列分析。DNA的核苦酸序列测定所用的引物是上 面所述的M13-20FW和M13RV。对亚克隆，作插入部分DNA的核苷酸序 列的分析，这与作为模板的HV没有差异，此外，选择的质粒DNA (TOPO—C10一Hv),其中的引物部分具有所i殳计的序列。这些DNA被限制酶 Sail和Nhel消化后，用琼脂糖凝月交电泳法纯化，回收得到约420 bp的DNA ， 此DNA片段用T4 DNA连接酶连接到同样地经限制酶(SalI和Nhel)处理 和去磷酸化处理的N5KG1—C10—LvDNA(约9kb)上，然后，将所得连接产 物转入到大肠杆菌DH10B，从由此得到的转化子中筛选出所述目标的质粒 DNA。大量纯化由上述方法得到的抗体表达质粒DNA -N5KG1—C10—IH (克 隆#1),并证实在克隆过程中，L链和H链整个区域，及其插入位点周围 的DNA核芬酸序列没有被引入变化(图2,图3)。进行DNA核苷酸序列的 确认时，使用SEQIDNO:19-25的各种引物。制得的所述C10抗体表达载 体的简图见图4。此外，使用同样的方法，构建重组C10抗体表达载体。 C10—L5—Bgl:
GAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT (SEQ ID NO: 15)
C10—L3一Bsi:
AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC (SEQ ID NO: 16)
C10—H5一Sal:
44ID NO:17)
C10—H3—Nhe:
AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC (SEQ ID NO: 18)
hh-4: GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG (SEQ ID NO: 19) hh-1: CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAC (SEQ ID NO:20) CMV腦3F: GACACCCTCATGATCTCCCGGACC (SEQ ID NO:21) CMVHR1303: TGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCT (SEQ ID NO:22)
hk-1: TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC (SEQ ID NO:24) SEQU1783: GGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA (SEQ ID NO:25)
(实施例7)
重组型CIO抗体的制备
通过将所述构建完成的CIO抗体表达栽体转入宿主细胞，制得CIO抗 体表达细胞。对于表达宿主细胞，使用在无血清培养基-EX-CELL325PF培 养基(JRH,含有2 mM谷氨酰胺，100单位/ml青霉素，100 pg/ml链霉素，次 黄嗓呤和胸腺嗜啶脱氧核苷(HT)补充物(1:100) (Invitrogen))中条件性 (conditioned)培养的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺失的突变型CHO DG44细 胞系(以下称作CHO细胞，IDEC Pharmaceuticals)。用电穿孔法进行所述 载体对宿主细胞的转入。通过电穿孔法，用限制酶AscI使约2pgC10表达 载体线性化，并在350 V， 500 条件下，使用BioRad Electroporator( BioRad 电穿孔仪)，将所迷基因转入4x 106CHO细胞中，然后，将所得细胞接种 于96孔细胞培养板。载体被转入宿主细胞后，加入G418并继续培养。对 克隆进行确认检验后，筛选得到抗体表达林系。筛选得到的CHO细胞系在 EX-CELL-325 PF培养基(含有2 mM谷氨酰胺，100单位/ml青霉素，100 pg/ml链霉素，次黄噪呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HT)补充物(1:100) (Invitrogen))中，于5% C02条件下进行培养。所得培养物上清液被吸收在 Mabselect Protein A column (GE Healthcare Bioscience)中，用PBS漂洗后， 再用20 mM柠檬酸钠盐(citrate- Na )和50 mM NaCl (pH 3.4)緩冲液洗 脱。用50 mM pH 7,0磷酸钠盐緩冲液中和洗脱液。用去离子水稀释1.5倍，将经稀释的洗脱液的导电率调整到4.0ms/cm以下。紧接着，所得样品 进料后净皮吸收到由Q-Sepharose (Hitmp Q HP, GE Healthcare Bioscience)和 SP-Sepharose (Hitrap SP FF， GE Healthcare Bioscience)连接组成的层析柱上， 用20 mM磷酸钠盐緩沖液(pH5.0)漂洗，然后用PBS(-)洗脱。因此制得的 抗体溶液通过孔径为0.22lim的膜过滤器，MILLEX-GV(Millipore),过滤除 菌。通过检测其在280nm的光吸收值，计算经纯化的C10抗体浓度，计算 基准为[1.4OD280= 1 mg/mL]。另夕卜，通过使用同样的方法，制备重组C15 抗体。
(实施例8)
猕猴FGF23蛋白表达载体的构建
将经EDTA处理后的猕猴静脉血和悬浮在PBS (-)中的5% Dextran T-2000 (GE Healthcare Bioscience)以2:1的比例混合，以沉淀血红细胞。随 后，上清液分层在淋巴细胞分离液(Ficoll-Plaque) (GE Healthcare Bioscience) 的上层，离心得到淋巴细胞成分。由此所得的淋巴细胞被悬浮在ISOGEN-LS (Nippon Gene),按照所附的实验方案，得到猕猴总淋巴细胞RNA。按照所 附的实验方案，利用所制得猕猴总淋巴细胞RNA和第一链cDNA合成试剂 盒(Invitrogen),制备得到猕猴淋巴细胞cDNA文库。通过实施以下搡作过 程使编码猕猴FGF23的cDNA扩增所述猕猴淋巴细胞cDNA文库为模板， 使用猴yFGF23FW引物(SEQ ID NO:26)和猴FGF23RV引物(SEQ ID NO:27),以及KOD plus DNA聚合酶(Toyobo), 94。C孵育5 min,然后进 行45个PCR循环，每个PCR循环由94。C /20秒，55°C/30秒和72°C /50秒 组成。所述猴FGF23FW引物退火后与存在于编码人FGF23的核苷酸序列 5'上游区域的序列相结合，并在扩增得到的DNA片段FGF23编码区的5'处 加入EcoRI限制酶位点。所述猴FGF23RV引物包含一段退火后可与包括编 码人FGF23编码区终止密码子的序列相结合的序列，并包含有Notl限制酶 位点。扩增所得的片段经EcoRI和NotI消化，再插入在pEAK8/IRES/EGFP 载体的EcoRI和Notl限制酶位点处而#皮克隆，其中，所述 pEAK8/IRES/EGFP载体在表达载体pEAKS (Edge Biosystem)内连接了内核 糖体进入序列(IRES)和增强型绿色萸光蛋白(EGFP)。对由此得到的质粒的核 苦酸序列测序，以确定其编码猕猴FGF23蛋白，此载体被称为pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23。此外，在本实施例中获得的猕猴FGF23的核 酸序列和氨基酸序列分别显示于SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29中。
猴FGF23FW: CGGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCT (SEQ ID NO: 26)
猴 FGF23RV: ATTTGCGGCCGCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGC (SEQ ID NO: 27)
猕猴FGF23核酸序列(SEQ ID NO:28)
ATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCTCTGGGTCTGTGCCTTGTGCAGC
ACGGGCCCGGAAGCCTGCCGCCCCTTCGCCAAGTTCATCTAG 猕猴FGF23氨基酸序列(SEQ ID NO:29)
MLGARLRLWV CALCSVCSMS VIRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFGG NIFGSHYFNP ENCRFRHWTL ENGYDVYHSP QHHFLVSLGR AKRAFLPGMN PPPYSQFLSR R丽PLIHFN TPRPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRA画T PAPASCSQEL PSAEDNSPVA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEACRPFAKF I
(2)猕，吳FGF23表达细胞上清液的制备通过磷酸钙法，将pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23瞬时转染到PEAK快 速细胞(rapid cells) (Edge Biosystem)中，从而获得它们的培养物上清液。
(实施例9)
CIO抗体对猕猴FGF23结合能力的研究。
通过以下用夹心ELISA的方法，研究了 CIO抗体不仅结合于人FGF23, 同样也与猕猴FGF23结合。将实施例4中制得的C10抗体、2C3B抗体和人 IgGl对照抗体稀释在50 mM NaHC03溶液中，得到浓度为5 pg/ml的稀释溶 液，然后被加到96孔微孔板的各个孔中，4。C孵育12小时，以用于ELISA (Maxisorp(注册商标)，Nunc)反应。由此，C10抗体、2C3B抗体和作为对照 的人IgGl对照抗体被吸收到微孔板中。接下来，除去所述这些溶液，并在 每个孔中加入阻断剂(SuperBlock(注册商标)阻断緩沖液，PIERCE),室温孵 育30 min,然后用含有0.1%Tween20的Tris緩冲生理盐水(T-TBS)漂洗各个 孔两次。将实施例2中纯化制得的全长人FGF23蛋白或实施例8中制得的 表达猕猴FGF23的细胞上清液稀释到合适的浓度后，加到被抗-FGF23抗体 覆盖的微孔板的各个孔中，与固定化的抗体反应两个小时，然后用含有0.1% Tween20的Tris緩沖生理盐水(T-TBS)漂洗每个孔两次。接下来加入3 (ig/ml 生物素标记的3C1E抗体，室温孵育1.5小时，以使生物素标记的3C1E抗 体与人或猕猴FGF23结合，其中，所述人或猕齐吳FGF23被结合在固定化抗 体上。用T-TBS漂洗后，加入5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的链亲合 素(DAKO),使之反应l小时，并用T-TBS漂洗3次。每孔加入含有四曱基 联苯胺(DAKO)的底物緩沖液，室温孵育30min。每孔中加入0.5 M的硫酸， 终止反应。以570 nm波长为参照波长，用微孔板读出机(MTP-300， Colona Electric Co.)检测其在450 nm波长的吸光度。比较人全长FGF23蛋白和猕猴 FGF23表达细胞培养物上清液在以3倍的稀释比进行稀释时的反应活性。所 得结果显示在图5A和图B。正如图5A清楚显示的那样C10抗体或2C3B 抗体固定化时，对人全长FGF23蛋白的反应活性是相同的。在此条件下， 对于猕猴FGF23表达细胞培养物上清液的稀释系列的反应性，在CIO抗体 反应活性和2C3B抗体反应活性之间，没有观察到太大差异(图5B)。也即是, C10抗体，与2C3B抗体相同，^皮证明能够结合于人和猕猴FGF23。(实施例10)
C10抗体和2C3B抗体对正常猕猴血中磷浓度和血中la,25-二羟基维生 素D浓度的作用效果比较。
FGF23具有以下的作用促进肾磷排泄和降低血液磷浓度，抑制肾中 维生素D活化酶和降4氐血中la,25-二羟基维生素D(以下称作1,25D)浓度(国 际专利出版号WO02/14504 )。已证实将对2C3B抗体等FGF23，具有抑制作 用，也即是，中和活性的抗体，给药于正常鼠，导致内源性FGF23活性的 抑制、血清磷酸盐浓度和血清1，25D浓度升高(国际专利出版号 WO03/057733 )。由此，这强烈表明对FGF23具有中和活性的抗体对由过量 FGF23导致的包括肿瘤引起的软骨病、XLH等在内的人类疾病具有治疗作 用。因此，研究了本发明中得到的人抗体—C10抗体在体内对FGF23的中和 活性。尤其是，由于对它在人体上的药理作用的期望，通过使用猴的内源性 FGF23功能的抑制、以及猴的血清磷酸盐浓度和血清1,25D浓度的升高为指 标，测定其中和活性能，其中，猴与其它动物种如啮齿类动物等相比，猴在 进化上与人更接近。进行实验时，使用小鼠抗体-2C3B抗体，作为C10抗 体的比较对照。
使用下面的方法，在未经处理的正常猕猴体内C10抗体和2C3B对血 清磷酸盐浓度的增长效果进行比较。使用实施例4中生产的C10抗体。所用 实验动物为2-3岁的雌性猕猴，体重2-4kg。各有3只动物被用于所述溶剂 给药组和2C3B抗体给药组，4只动物被用于C10抗体给药组。C10抗体和 2C3B抗体分别用PBS (-)配制成浓度为3 mg/ml的抗体溶液,以此作为给药 溶液。所述PBS(-)溶剂被用作阴性对照。C10和2C3B抗体分別通过头臂 静脉以1 ml/min的流速，分别按1 mL/kg(相当于3mg/kg )给药量给药一次。 通过L型Wako无才几石粦试剂(Wako Pure Chemical Industries)和Hitachi Clinical Analyzer Model 7180 (Hitachi, Ltd.),检测血清磷酸盐浓度。通过1， 25 (OH) 2D RIA Kit [TFB] (Immunodiagnostic System),检测血清1,25D浓度。 所述检测在抗体给药后0,5、 1、 2、 3、 5、 7、 10、 14、 21、 28、 35、 42、和 49天分别进行。数据用平均值+/-标准误差表示。图6的数据显示了每种抗 体给药后10天内定期收集的血液样本中血清磷浓度的变化。在测试期间， PBS (-)给药组血清磷浓度几乎不变，而在所述C10抗体给药组和2C3B抗体 给药组，与给药前和PBS (-)给药组相比，观察到明显的血清磷浓度升高。在所述C10抗体和2C3B抗体给药组，血清磷浓度最高值出现时间均为抗体 给药后第5天。在此时间点上，PBS(-)组、2C3B抗体组和C10抗体组的 血清磷浓度分别为5.28 mg/dl， 8.10 mg/dl和9.59 mg/dl。比较抗体给药5天 后2C3B抗体组和C10抗体组的血清磷浓度与同时期的PBS(-)组的血清磷 浓度的上升值，2C3B抗体组中血清磷浓度增长为2.82 mg/dl,而在C10抗 体组血清磷浓度增长为4.31 mg，(这些结果)表明，与所述2C3B抗体组 相比，C10抗体诱导的血清磷浓度增长是2C3B抗体诱导的血清磷浓度增长 的1.5倍以上(图7)。因此，与所述2C3B抗体给药组相比，C10抗体给药组 对血清磷浓度增长的作用明显更高。此外，给药10天后，2C3B抗体给药
组的血清磷浓度与PBS(-)组的血清磷浓度处于相同水平，而C10抗体给药组 中的血清磷浓度(8.76 mg/dl)仍维持在比2C3B抗体给药组血清磷浓度最高 水平(8.10 mg/dl)还要高的水平(图6)。另外，由C10抗体引起的增加后血 清磷浓度的保持时间比由2C3B抗体引起的增加后血清磷浓度保持时间更 长，用2C3B抗体的所述保持时间是7天，这与PBS(-)给药组有明显差别， 而用C10抗体的所述保持时间是令人惊讶的35天，两者相差约5倍。同样 地，对于抗体给药后的1, 25 D浓度，与2C3B抗体给药相比，C10抗体给 药后的1,25D浓度明显上升，并且其保持时间明显延长(图8)。
这些结果表明，与现有的FGF23中和抗体-2C3B抗体相比，在猕猴体 内，C10抗体具有更强的促血清磷浓度和血清I，25D浓度增长活性，也即是， 具有更强的FGF23中和活性。目前对XLH等低血磷症性佝偻病的治疗，要 求每天大剂量的磷和维生素D多次给药，以勉强维持磷浓度处于正常范围 内。有报道表明给药多次性导致病人应变性差。本研究中，C10抗体的单次 给药即可得到对血清磷浓度和血清1，25D浓度持续性增长活性的事实表明， 作为低磷血症治疗性药物，与常规的治疗方法相比，C10抗体在治疗的疗效 上很可能具有显著的优势。
(实施例11)
C15抗体对人和猕猴FGF23反应活性的确定
用磷酸钙法将实施例11中制得的pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23或实施例 8中制得的pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23瞬时基因转染于PEAK快速细胞 (EdgeBiosystem)。转染3天后，收集每个培养物上清液。以实施例13中制得的C15抗体为一抗(图9)，对所收集的培养物上清液作蛋白质印迹。结果 表明类似于C15与人FGF23结合，C15也与猕猴FGF23结合。
(实施例12)
C10抗体和C15抗体对正常猕猴血磷浓度和血中la，25-二羟基维生素D 浓度的作用效果比较。
实施例11表明C15抗体如同C10抗体那样具有与人和猕猴FGF23重 组蛋白结合活性。随后，对于C10抗体和C15抗体，通过将其给予正常猕 猴，比较其在体内对FGF23的中和活性。对猕猴内源性FGF23的中和活性 的评价，以血磷浓度的上升值为指标来进行，使用实施例7中制得的C10 抗体和C15抗体。所用实验动物为2-3岁和体重2-3 kg的正常猕猴。每个实 验组使用2只雄性和一只雌性共3只动物。所用稀释介质为PBS (-)。制备 的C10抗体浓度为1 mg/ml和3 mg/ml， C15抗体浓度为3 mg/ml。所述抗体 通过隐静脉以1 ml/min的流速，按1 mL/kg的容量给药一次，以此获得1 mg/kg和3mg/kg的C10抗体给药剂量和3 mg/kgC15抗体给药剂量。血清 磷浓度通过L型Wako无机磷试剂(L型Wako无机磷试剂)(Wako Pure Chemical Industries)和日立自动分析仪7180 (Hitachi Clinical Analyzer Model 7180 (Hitachi, Ltd.))被测定。采血在抗体给药前和给药1， 3, 5, 7, 10, 14, 21和28天后进行。测定在所有采血点的血清磷浓度。在C10抗体lmg/kg 给药组，C10抗体3 mg/kg给药组和C15抗体3mg/kg给药组，给药前它们 的血清磷浓度分别为5.37， 5.70和5.58 mg/dL,各组之间没有显著差异。给 药后，所有猕猴体内均被观察到有血清磷浓度的增长。因此，不仅C10抗体， 而且C15抗体也显示出对猕猴内源性FGF23的中和活性。在C10抗体1 mg/kg给药组，C10抗体3 mg/kg给药组和C15抗体3mg/kg给药组，给药3 天后血清磷浓度分别为9.03， 9.10和8.64 mg/dL。在此时间点，C10抗体1 mg/kg给药组和C15抗体3mg/kg给药组的血清磷浓度达到最高值。另一方 面，C10抗体3mg/kg给药组的血清磷浓度继续增长并在给药5天后达到最 高值，此最高值为9.75 mg/dL。在C10抗体1 mg/kg给药组，C10抗体3 mg/kg 给药组和C15抗体3mg/kg给药组，给药前和给药后的血清磷浓度最大差额 分别为3.67, 4.65和3.06 mg/dL。由此结果可知，在同样3mg/kg剂量下，与 C15抗体(对血清磷浓度的增长作用)相比，C10抗体不仅显示出对血清磷浓度更高的增长作用。而且让人惊讶的是，C10抗体1 mg/kg剂量给药对血
清磷浓度的增长作用比C15抗体3 mg/kg剂量给药(对血清磷浓度的增长作
用)还要高。接下来，对相比于给药前水平的血清磷浓度增长的持续时间进
行了比较。其结果是所述CIO抗体1 mg/kg给药组，CIO抗体3 mg/kg给
药组和C15抗体3mg/kg给药组的血清磷浓度增长的持续时间分别是14, 28
和7天。由此结果可知，在同样3mg/kg剂量下，与C15抗体(对血清磷
浓度增长的持续时间)相比，CIO抗体不仅显示出对血清磷浓度增长活性的
更高持续性。而且让人惊讶的是，CIO抗体1 mg/kg剂量，比C15抗体3mg/kg
剂量,可将血清磷浓度更长期地保持在高水平。以上这些事实说明，在猕猴
体内，C10抗体与同时获得的C15抗体(对血清磷浓度的作用)相比，CIO 抗体具有更强的对血清磷浓度的增长活性和对血清磷浓度增长活性的持续
性。也即是，与C15抗体相比，CIO抗体具有明显强的对猕猴FGF23的中 和活性。
(实施例13)
人FGF23 DNA片段(不含信号肽序列)的制备。
按照操作说明书，用KOD-plus-DNA聚合酶(Toyobo)制备反应溶液。 将FGF23(-SP) FW引物(SEQ ID NO:34)和FGF23(-SP) RV引物(SEQ ID NO: 35)各50 pmol,作为模板的人FGF23-cDNA (从起始密码子到终止密 码子共长756 bp， SEQ ID NO: 36),添加到50 ^反应溶液中，94。C孵育3 min 后，进行30个循环扩增，每个循环由98。C/15秒、63。C/15秒和68°C/2min 30秒组成。吝在72。C孵育3 min。所得684 bp扩增片段用0.8%凝胶分离 收集。按照操作说明书，使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen),从经回 收的凝胶中回收所述扩增片段。用FseI(New England BiolabsJapan)对所回收 的扩增片段进行酶消化，按照操作说明书，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)回收经酶处理的片段。由此得到与不含人FGF23的信号序列的 人FGF23成熟形式相对应的部分DNA片段。
FGF23(-SP) FW: TATCCCAATGCCTCCCCACTGCTCGGCTCCAGCTG (SEQ ID NO: 34)
FGF23(-SP)RV:
TTGGCCGGCCCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGCGGCAGCCTTCCG
52(SEQIDNO:35，包括FseI位点)
所述人FGF23核苷酸序列(下划线标记为信号序列部分的，矩形框标记的是来自于所述(FGF23 )全长序列的不含所述信号序列的人FGF23成熟形式区域的核苷酸)(SEQIDNO:36)。
ATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCTCTGGGTCTGTGCCTTGTGCAGC
TGGCTTTGTGGTGATTACAGGTGTGATGAGCAGAAGATACCTCTGCATG
GGTGGTCAGGGGCGGTCGAGTGAACACGCACGCTGGGGGAACGGGCC
CGGAAGGCTGCCGCCCCTTCGCCAAGTTCATCTAG
所述人FGF23氨基酸序列基于SEQ ID NO:36为标准(下划线标记为信号序列部分的氨基酸残基，矩形框标记的是来自于所述(FGF23)全长序列的不含所述信号序列的人FGF23成熟形式区域氨基酸残基)(SEQ IDNO:37)。
MLGARLRLWVCALCSVCSMSVLRAtYPNASPLLGSSWGGLIHLYTAT
PFAKFI(实施例14)
pPSs FGF23载体的构建
WO2006/78072实施例1-8中描述的pPSs5.5经Sfol和Fsel消化，其末端经来自于大肠杆菌的碱性磷酸酶去磷酸化处理。插入在实施例13中制得的包含有人FGF23基因的DNA片段，然后转染入DH5a。从获得的转化子中制取DNA，确定连接区的核苷酸序列，从而得到pPSs FGF23栽体(图10)。
(实施例15)
pUS FGF23 KI载体的构建
WO2006/78072实施例43-1中被描述的pCk loxPVAP经Sail和Fsel酶消化，其末端经来自于大肠杆菌C75的碱性磷酸酶去磷酸化处理。插入一个约为1.5kb的片段后，其中，此片段为上述实施例14中制得的pPSs FGF23载体经Sail和FseI酶消化后用0.8%琼脂糖凝胶分离回收后获得，所述载体被转染入大肠杆菌XL10-Gold超感受态细胞(UltracompetentCells)(STRATAGENE)。从获得的转化子中制得DNA。确定连接区核苷酸序列，从而得到pUS FGF23 KI载体(图11)。
以下所示为985bp序列(SEQ ID NO:38 )和氨基酸序歹'K SEQ ID NO:39 )。所述985bp序列(SEQIDNO:38)，其中，pUS FGF23 KI载体人FGF23表达单位的从起始密码子到终止密码子的多核苷酸序列(FGF23信号序列)被含编码区域的鼠IgK信号序列(SEQIDNO:38的划线部分)取代，并且其下游含有FGF23成熟形式序列;所述氨基酸序列(SEQIDNO:39)，系为由所述cDNA编码的氨基酸序列(247个氨基酸，划线部分代表鼠IgK信号序列，SEQ ID NO:39)。包括内含子区域在内的鼠IgK信号序列的序列信息基于从GenBank得到的MUSIGKVR1(索取号K02159),其上游基因组序列从UCSC鼠基因组数据库获得。
SEG ID NO:38
ATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTT
54CATCTACAGTGCCCTGATGATCAGATCAGAGGATGCTGGCTTTGTGGT
CTGCCGCCCCTTCGCCAAGTTCATCTAG
SEQ ID NO: 39
METDTLLLWVLLLWVPGSTGYPNASPLLGSSWGGLIHLYTATARNS
I
(实施例16)
用于电穿孔法的pUS FGF23 KI载体的制备
60pUS FGF23 KI载体在37°C条件下，用添加亚精胺(spermidine-added) (1 mM pH7.0， Sigma Aldrich Japan)的緩沖液(RocheDiagnostics,限制酶用H緩沖液(H buffer for restriction enzyme))和NotI
55(TakaraBio，Inc.)消化5小时。经苯酚/氯仿抽提后，加入2.5倍体积的100%乙醇和0.1倍体积的3 M乙酸钠，所得混合物在-20。C放置16小时。所述载体经Notl线性化处理，被离心收集，再加入70%乙醇灭菌。在净化工作台内去除70%乙醇并风干处理1小时。加入HBS溶液以配制成0.5 pg/jtiLDNA溶液，所得溶液室温放置1小时后，用于制备电穿孔法所用的pUSFGF23 KI载体。
(实施例17)
用pUS FGF23 KI载体和RS因子敲除鼠胚胎细胞系获得PL FGF23鼠胚胎细胞系。
为获得PLFGF23鼠胚胎细胞系(其中人FGF23-cDNA通过同源重组的方法被插入到免疫球蛋白K轻链基因下游)，按照已建立的方法(ShinichiAizawa, "Biotechnology Manual Series 8, Gene Targeting," Yodosha， 1995)， 3夸经限制酶NotI线性化处理的pUS FGF23 KI载体(按照实施例16中所示的方法制得)转入到RS因子敲除鼠胚胎细胞，.通过使用WO2006/78072实施例IO中所描述的方法，得到RS因子敲除鼠胚胎细胞。
RS因子敲除鼠胚胎细胞的培养方法按照已被描述过的方法(ShinichiAizawa,见上文)，所用滋养细胞为培养在经丝裂審素C(Sigma Aldrich japan)处理的培养基中的G418抗性原代培养细胞(从Invitrogen购入)。首先，培养RS因子敲除鼠胚胎细胞并经胰蛋白酶处理，细胞以3 x 107细胞/ml的浓度悬浮在HBS中。将0.5 ml所述细胞悬浮液与10 载体DNA混合。然后，用基因脉冲试管(Gene Pulser Cuvette)(电极距离0.4 cm, Bio RadLaboratories)进行电穿孔(电容960 pF，电压250V，室温)。所述电穿孔处理后的细胞被悬浮在10 ml胚胎细胞培养基中(Shinichi Aizawa,见上文)，然后这些细胞被接种于塑料培养皿(Falcon,Becton Dickinson)中，用于100 mm组织培养，其中滋养层细胞为先前已被预先铺入。36小时候后，所用培养基换成含有0.8 pg/ml嘌呤霉素的(Sigma Aldrich Japan)胚胎细胞培养基。将被挑取的培养7天后出现的每个克隆都接种入24孔板培养至完全汇合。将所得细胞三分之二悬浮于0.2 ml的接种培养基(FBS + 10% DMSO， SigmaAldrich Japan)中，所得悬浮液-80。C保存。剩下的三分之一接种于12孔明胶涂层培养板中。所述细胞被培养2天后，使用Puregene DNA提取试剂盒
56(Qiagen)提取得到106 - 107细胞的基因组DNA。由此得到的抗。票呤霉素RS 因子敲除鼠胚胎细胞基因組DNA经限制酶EcoRI (Takara Bio， Inc.)消化后， 用琼脂糖凝胶电泳法分离。随后，以Ck 3'探针为探针进行Southern印迹检 测，以检测同源重组子，其中，Ck 3'探针是在本发明中使用的，已在 WO00/10383得到描述的(见实施例48)Ig轻链Jk-Ck基因組DNA 3'末端的 DNA片段(XhoI酶切位点到EcoRI酶切位点,长约1.4 kb, WOOO/10383,图 5)。经EcoRI消化后，在野生型RS因子敲除鼠胚胎细胞中检测到一条长15.1 kb的条带。在同源重组体中，除15.1kb的条带外，预计应该还有一条新的 条带(12.8 kb)出现在15.1 kb的条带下面(图12),且所述新条带在噤呤霉 素抗性品系中被检测到。也即是，这些克隆被证实其免疫球蛋白k链基因下 游处一个等位基因座插入有人FGF23-cDNA。
(实施例18)
通过敲除PL FGF23小鼠胚胎干细胞系中的抗药性基因获得US FGF23 小鼠胚胎干细胞系。
在获得的由PL FGF23小鼠胚胎干细胞系而来的US FGF23小鼠胚胎干 细胞系中，2种抗性基因(Pun)1", Neof)被敲除，这是参照现有成熟的实验 方法(Shinichi Aizawa,"生物技术手册"系列8，基因打靶技术"Yodosha ， 1995年，Shinichi Aizawa，"Biotechnology Manual Series 8， Gene Targeting," Yodosha, 1995)进行的，在这一过程中将pCAGGS-Cre载体(Simaga等，Mol Reprod Dev., 46: 109-113， 1997)引入PL FGF23小鼠胚胎干细胞系中。
PL FGF23小鼠胚胎干细胞的培养方法参照现有方法(Shinichi Aizawa, 上述文件)，培养液中加入经丝裂霉素C(Sigma Aldrich Japan)处理的G418 抗性原代培养细胞(购自Invitrogen)作为滋养层细胞。首先，将培养好的 PLFGF23小鼠胚胎干细胞用胰酶消化，所述细胞以3 x 107细胞/ml的浓度 悬浮于HBS中，将0.5 ml的细胞悬浮液与10 |ig的栽体DNA混合，采用 基因脉冲试管(Gene Pulser Cuvette)(电极间距0.4 cm, Bio Rad Laboratories )进行电穿孔法(电容960 faF,电压250 V，室温操作)。经 电穿孔的细胞悬浮在lOml胚胎干细胞培养液(Shinichi Aizawa,见上文) 中，2.5 ml的细胞悬浮液接种到预先铺入滋养层细胞的60 mm組织培养用 的塑料培养皿中(Falcon, Becton Dickinson)。经过30小时的培养，将1000个胚胎干细胞接种到预先铺入滋养层细胞的100mm组织培养用的塑料培养 皿中(Falcon, Becton Dickinson)。挑取6天之后出现的克隆，每个克隆接 种入24孔板培养至完全汇合。其三分之二悬浮于0,2 ml的冻存培养液(FBS + 10%以Ck 3'探针进行Southern印迹检测，以检测同源重组子，其中，Ck 3' 探针是在本发明中使用的，已在WO00/10383得到描述的(见实施例48)Ig轻 链Jk-Ck基因組DNA(XhoI酶切位点到EcoRI酶切位点，长约1.4 kb， WO00/10383，图5)3'末端DNA片段。DMSO ( Sigma Aldrich Japan),誦80。C 保存备用；其余的三分之一接种于12孔明胶涂层板。所述细胞被培养2天 后，使用Puregene DNA提取试剂盒(Qiagen)提取得到106 - 107细胞的基因 组DNA。由此产生的小鼠胚胎干细胞基因组DNA用限制性内切酶 EcoRI(TakaraBio，Inc.)酶切消化，用琼脂糖凝胶电泳法分离目标条带。随后， 以Ck 3'探针为探针进行Southern印迹检测，^r测出其中只有位于loxPV基 因序列之间的Pun/基因被敲除的胚胎干细胞系，所述使用探针Ck 3'的检测， 其中Ck 3'探针是在本发明中使用的，已在WO00/10383得到描述的(见实 施例48)Ig轻链Jk-Ck基因組DNA的3'末端DNA片段(XhoI酶切位点到 EcoRI酶切位点，长约1.4kb, WO00/10383,图5)。当胚胎干细胞基因组中保 留有Puror基因，由EcoRI酶切可以检测到两个条带(15.1 kb和12.8 kb ); 而只有当胚胎干细胞基因组中敲除了 Purc/基因，由EcoRI酶切可以检测到 两个条带分别为15.1 kb和10.9 kb (图12)。此外，通过上述过程中获得 的Southern杂交膜，用例9所示的专利WO2006/78072中的3'KO探针方法 检测，在胚胎干细胞系基因组DNA中，只有位于1oxPVPurc/基因序列之间 的Nec/基因被敲除，通过使用探针3'KO检测，当胚胎干细胞基因组中保留 有Ne(/基因，由EcoRI酶切可以检测到两个条带(7.4 k和5.7 k);而只有 当胚胎干细胞基因组中敲除了 Nec/基因，由EcoRI酶切可以检测到两个条 带分别为5.7k 和4.6 k (图12)。通过上述实验，由PL FGF23小鼠胚月台 干细胞系可以获得2种耐药基因(Puro1", Neo1")同时被敲除的胚胎干细胞系 (US FGF23小鼠胚胎干细胞系。
(实施例19)
用US FGF23小鼠胚胎干细胞系和宿主胚胎制备US FGF23 KI嵌合小 鼠，其中宿主胚胎来自B淋巴细胞缺陷小鼠品系。在一个免疫球蛋白fi链基因被敲除的纯合小鼠中，B淋巴细胞功能有缺
陷，并且不能产生抗体(Kitamura等，Nature, 350: 423-426, 1991)。在本实施 例中，宿主胚胎通过上述培养在洁净环境中的纯合雄性和雌性小鼠杂交繁育 而来，用于嵌合体小鼠的制备。在这种情况下，嵌合小鼠的大部分B淋巴细 胞功能来自其所注射的胚胎干细胞。在本例中，由Tomizuka等报道的免疫 球蛋白H链基因敲除的纯合小鼠(Proc. Natl. Acad， Sci. USA, 97: 722-7, 2000)，是通过3次以上的与MCH(ICR)品系(CLEA Japan, Inc.)回交，被用 于宿主胚胎的制备。
通过上述实施例18所获得的US FGF23胚胎干细胞系被复苏，这些胚 胎干细胞系被确认其中插入了人类免疫球蛋白K链基因的下游序列的 FGF23-cDNA。 US FGF23胚胎干细胞;陂注射入8细胞期宿主胚胎，这些宿 主胚胎由上述免疫球蛋白H链基因敲除的纯合雄性和雌性小鼠杂交繁育而 来，注射细胞量为8-10胚胎干细胞/宿主胚胎。注射胚胎在胚胎干细胞培养 液中培养过夜(Shinichi Aizawa，"生物技术手册"系列8,基因打靶技术" Yodosha ， 1995年)，注射胚胎发育成为胚泡后，将被注射的胚胎移植到 2.5天假孕处理的代孕MCH (ICR)母鼠子宫中(CLEA Japan, Inc.),每一侧子 宫分别植入约IO个注射胚胎。利用上述实例18的USFGF23小鼠胚胎干细 胞系通过注射胚胎的方法获得嵌合小鼠。嵌合小鼠是由毛色的差别来鉴定 的，其中是否具有胚胎干细胞源性的野生型颜色(深褐色)能够在宿主胚胎
源性(白色)毛色中鉴定出来。在嵌合小鼠的后代中，每个小鼠有明显的部 分野生型源性毛色的毛色分布，也就是说，通过可辨认的胚胎干细胞源性的 野生型颜色(深褐色)可以区别嵌合小鼠和纯合小鼠。从这些实验结果，插 入了人类免疫球蛋白K链基因的下游序列的FGF23-cDNA的US FGF23胚胎 干细胞系具有维持嵌合小鼠生成的能力。也就是说，在小鼠个体中，US FGF23胚胎干细胞具有分化成正常组织的能力。此外，USFGF23KI嵌合小 鼠的血中具有高浓度的FGF23,这在稍后的范例21中我们要进一步地地提 到，USFGF23 KI嵌合小鼠具有类似于低磷佝偻病的特征，可以作为这一疾 病研究的动物模型。
(实施例20) 对照嵌合小鼠的制备
59根据前述(专利WO2006/78072 )实施例11中的方法，没有插入具有人 类FGF23-cDNA功能基因的嵌合小鼠(来源自野生型小鼠)，在下述实施 例21中对US FGF23 KI嵌合小鼠的C10抗体给药实验中用作各个对照嵌合 小鼠。
(实施例21)
使用US FGF23 KI嵌合型小鼠对CIO抗体病理改善功效的证明 在实施例IO和实施例12中已证明，在猕猴(cynomolgus monkey)体 内，与2C3B抗体和C15抗体相比，C10抗体能更显著地抑制内源性FGF23 的效果，并且提高血清中磷浓度和血清1,25D浓度。已经强烈暗示具有对 人FGF23中和活性的抗体，对人类疾病例如肿瘤引起的软骨病、诸如XLH 等的低血磷佝偻病、以及过量的FGF23引起的软骨病具有治疗效果。因此， 本文研究了 C10抗体对那些由过量FGF23引起的病状的改善作用。C10抗 体的治疗试验是使用在实施例19中制得的US FGF23 KI嵌合型小鼠(以下 缩写为hFGF23KI小鼠)。12只hFGF23KI小鼠被用作疾病模型动物，6只 同周龄的正常小鼠(野生型小鼠，在实施例20中所制得的)作为对照动物， 进行对比实验。收集7周龄的hFGF23 KI小鼠的血清，分别检测血清中FGF23 浓度(FGF-23 ELISA KIT, Kainos Laboratories, Inc)和血磷浓度。与野生 型小鼠相比，hFGF23KI小鼠血清FGF23浓度显著升高(野生型小鼠;n=6， 163pg/mL, hFGF23KI小鼠；n=12, 1467pg/mL)。这个结果表明，在hFGF23 KI小鼠中引入人FGF23基因是被正确地进行，并且也表示在hFGF23 KI小 鼠血清中存在有过量的外源性人FGF23。此外，与野生型小鼠相比，hFGF23 KI小鼠的血磷浓度显著下降(野生型小鼠；n=6, 5.82 mg/dL， hFGF23KI 小鼠；n=12, 2.62mg/dL)。由于过量人FGF23的作用hFGF23KI小鼠出现 了低血磷症状。此时，将12只hFGF23KI小鼠分成C10抗体给药组和对照 的IgGl给药组两组，每组六只，每只都有等量FGF23浓度(图13)。然后， 从第八周开始，对两组小鼠重复静脉注射C10抗体或同种型对照用的纯化的 人IgGl (对照抗体)，注射剂量为30 mg/kg，给药频率为一周一次，共给 药五次。取第一次给药前和给药三天后的血样，提取血清。用Saitoh握力器 (Saitoh-GRIP STRENGTH METER, MK-380S， Muromachi Kikai Co., Ltd.) 测评第四次给药24小时后小鼠的四肢紧握力量。四肢紧握力量是以小鼠尽全力时最大力量(握力)为指标，其中，将小鼠置于一个测量的栅格中，让 小鼠抓住栅格，然后用手水平拉动小鼠尾部，直至小鼠不能承受拉力而松开
栅格。在第五次给药24小时后评测小鼠的骨骼状况。麻醉小鼠，通过心脏 取血法将其处死，取出其大腿骨(fermur)和胫骨(tibia)，在70%的乙醇 中固定。分别^r测第一次给药前，第一次给药三天后和第五次给药24小时 后的血清中磷浓度。将未去除钙质的大腿骨包裹在树脂中，用 Villanueva-Goldner染色后，进行组织学评价。胫骨中的矿物质含量经灰化 后测得。
实验结果表明，对照抗体给药组的hFGF23KI小鼠，在分组时和一同处 死时(即，在给药之前时和在第五次给药24小时之后时)，其血清中磷浓 度显著低于对照抗体给药組的野生型小鼠，这种情况表明hFGF23KI小鼠持 续的低血磷状况(图14)。另一方面，C10抗体给药组的hFGF23KI小鼠 在给药三天后，其血清中磷浓度提高到与对照抗体给药组的野生型小鼠同等 水平(图14)。此外，C10抗体给药组的hFGF23KI小鼠在第五次给药后 血清中磷浓度仍与对照抗体给药组的野生型小鼠处于同等水平，这就表明， C10抗体对增加血清磷浓度的作用即使在五次给药之后仍然存在(图15 )。
作为低血磷病人的一个症状，骨骼肌弱化已有临床报道(Baker和 Worthley， Crit Care Resusc.,4: 307-315, 2000)。在本实验究中，由于血磷酸 盐过少,我们预计hFGF23KI小鼠会出现肌肉弱化症状。因此，用上述方法测 量并比较每组小鼠的四肢紧握力，作为肌肉弱化的指标。其结果，对照抗体 给药组的hFGF23KI小鼠的紧握力显著低于对照抗体给药的野生型小鼠，在 这个疾病模型小鼠中观察到肌肉弱化的症状(图16)。与之相反，C10抗 体给药组的hFGF23KI小鼠的紧握力显著提高(图16)。
然后，用Villaneuva-Goldner方法对未去除钙质的大腿骨组织染色并进 行組织学观察。结果是，与对照抗体给药组的野生型小鼠相比，在对照抗体 给药组的hFGF23KI小鼠骨骼中观察到大量类骨质(osteoid,在图17中用 红色表示)，表明该组小鼠被诱导出钙化缺陷。这正是佝偻病的特征症状。 相反，在C10抗体给药组的hFGF23KI小鼠大腿骨组织中，观察到类骨质所 占的区城减少，并推测类骨质是被辆化的骨质所取代(在图17中以绿色表 示)。这些结果表明，C10抗体可以改善由过量FGF23引起的骨质钙化降 低。胫骨中的矿物质用灰化的方法测量并在各组之间进行比较。对照抗体给药组的hFGF23KI小鼠胫骨中矿物质含量显著低于对照抗体给药组的野生型 小鼠(图18)。相反，实验证明C10抗体给药组的hFGF23KI小鼠胫骨中 矿物质含量有所提高(图18)。通过以上实验，证明在hFGF23KI小鼠体内， C10抗体抑制了过量表达的人FGF23在体内的作用，并改善了低血磷症性 询偻病的各种症状，如低血磷症，肌肉弱化，骨骼钓化紊乱等症状。这些结 果表明C10抗体是一种与FGF23相关的各种人类疾病的有效治疗剂。
工业实用性
本发明所述C10抗体是一种抗FGF23的抗体，与其它抗FGF23的抗体 相比，C10抗体在体内对持续性提高磷浓度和/或持续性提高血清1，25D浓度 有很高的活性。本发明所述C10抗体是一种对于预防或治疗由FGF23活性 过度引起的疾病，或者通过控制FGF23活性能够改善病状的疾病有显著疗 效的药物。
权利要求
1.一种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有杂交瘤细胞C10(索取号FERM BP-10772)产生的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
2. —种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其含有SEQIDNO:l: 的从第20位Q到第136位S的氨基酸序列所示的重链氨基酸序列和/或SEC IDNO:14的从第23位A到第128位K的氨基酸序列所示的轻链氨基酸序 列。
3. —种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段，其中，所述抗人FGF22 抗体或此抗体的功能性片段含有重链可变区和/或轻链可变区氨基酸序列； 且此重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12的从第20位Q到第136位S 的氨基酸序列所示，此轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:14的从第23 位A到第128位K的氨基酸序列所示。
4. 由杂交瘤细胞CIO (索取号FERMBP-10772)产生的抗人FGF23抗 体或此抗体的功能性片段。
5. —种抗体或此抗体的功能性片段，其结合于人FGF23上的全部或部 分表位，所述人FGF23上的全部或部分表位结合由杂交瘤细胞C10 (索取 号FERMBP-10772)产生的抗体。
6. 如权利要求1-5中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性 片段，其中所述功能性片段是选自Fab、 Fab'、 F(ab')2、 二硫键稳定的F、 (dsFv)、 二聚化的V区域(双体)、单链Fv(scFv)和CDR的肽段。
7. 如权利要求1-5中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性 片段，其包含重链和/或轻链，所述重链和/或轻链具有的氨基酸序列中一个 或几个氨基酸残基被缺失、取代或添加。
8. 如权利要求1-7中任何一项所述抗人FGF23抗体，其中，所述抗体 的种类是IgG、 IgA、 IgE或IgM。
9. 如权利要求8所述抗人FGF23抗体，其中，所述抗体的亚类是IgGl、 IgG2、 IgG3、或IgG4。
10. —种药物组合物，其含有如4又利要求1-9中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片^a作为活性成分。
11. 一种药物組合物，其可通过FGF23控制磷代谢和/或维生素D代谢并含有如权利要求1-9中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片 段作为活性成分。
12. —种用于矿物质代谢紊乱相关性疾病的预防或治疗的药物组合物， 其含有如权利要求1-9中任何一项所述抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片 段作为活性成分。
13. 如权利要求12所述药物组合物，其中，所述矿物质代谢紊乱相关性 疾病选自肿瘤性软骨病、ADHR、 XLH、骨纤维性结构不良、麦-奥二氏综合 征和常染色体隐性低血磷症。
14. 一种药物组合物，其用于预防或治疗选自骨质疏松症、佝偻病、高 钓血症、低钾血症、异位钾化症、骨硬化、派杰病、曱状旁腺机能亢进症、 曱状旁腺机能减退症和搔痒症的疾病，此药物组合物含有如权利要求1-9中 任何一项所述的抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段作为活性成分，
15. 杂交瘤细胞CIO (索取号FERM BP-10772)。
16. —种编码重链可变区氨基酸序列的核酸，其中，此重链可变区氨基 酸序列由SEQ IDNO:ll所示从第58位C到第408位A的碱基序列编码。
17. —种编码轻链可变区氨基酸序列的核酸，其中，此轻链可变区氨基 酸序列由SEQIDNO:13所示从第67位G到第384位A的碱基序列编码。
18. —种载体，其含有如权利要求16或17中所述核酸。
19. 一种宿主细胞，其含有如权利要求17中所述载体。
20. —种抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段的制造方法，包括步骤 培养如权利要求19中所述的宿主细胞以表达抗人FGF23抗体或此抗体的功 能性片段。
全文摘要
本发明提供一种抗FGF23抗体和通过使用此抗体对FGF23活性的抑制起到预防或治疗作用的一种作为预防或治疗药物的药物组合物。一种由杂交瘤细胞C10(索取号FERM BP-10772)产生的抗人FGF23抗体或此抗体的功能性片段。
文档编号C12N15/09GK101652476SQ20088000481
公开日2010年2月17日 申请日期2008年2月14日 优先权日2007年2月14日
发明者吉田均, 山下武美, 山崎雄司, 岛田孝志, 浦川到, 长谷川尚, 青野友纪子 申请人:协和发酵麒麟株式会社