专利名称：：使用酵母菌通过丁酰-CoA作为中间体制备丁醇的方法
技术领域：
：本发明涉及在酵母菌中生产丁醇的方法，所述酵母菌具有使用丁酰-CoA作为中间体生物合成丁醇的能力。
背景技术：
：随着石油价格的极大上涨和对关于全球变暖以及温室效应的日益增加的担心，近年来，使用微生物生产生物燃料方面己经受到日益关注。特别是，与生物乙醇相比，生物丁醇具有的优点在于，由于其氧含量较低，其与化石燃料具有更高的易混合性。近年来，作为新兴的汽油替代燃料，生物丁醇已得到迅速发展。美国市场的生物丁醇量每年达到3.7亿加仑，价格为3.75美元/加仑。作为对石油汽油的替代，丁醇比乙醇更好。由于具有高能量密度、低蒸汽压、类似于汽油的辛垸等级级别和低杂质含量，丁醇可与现有汽油以比乙醇更高的比例混合，而不损害性能、英里数或者有机污染标准。通过微生物大量生产丁醇可带来降低原油进口和温室气体排放的经济和环境优点。丁醇可通过梭菌属菌株厌氧ABE(丙酮-丁醇-乙醇)发酵来生产(Jones,D.T.和Woods,D.R.,M/cro6/o/.及ev.,50:484,1986;Rogers,P.，庙.Af/cro6/o/.，31:1,1986;Lesnik,E.A.等人，TVec/e/cJc/tfc7esearc/z，29:3583,2001)。直到20世纪50年代，这种生物学方法是40多年来用于丁醇和丙酮生产的主要技术。梭菌属菌株难以进一步改进是因为其复杂的生长条件和用于其的分子生物学工具和各种组学技术的供应不足。5因此，建议微生物诸如具有产生丁醇的卓越能力并可使用各种组学技术操作的酵母菌开发为丁醇生产菌株。特别是，尽管很少有新陈代谢工程和各种组学技术己经被应用于其上用于丁醇生产菌株的开发，酵母菌仍具有发展成丁醇生产菌株的极大潜能。图1中显示了丙酮丁醇梭杆菌通过丁醇生物合成途径产生丁醇(Jones，D.T.禾口Woods,D.R.,Microbiol.Rev.,50:484,1986;Desai，R.P.等人，J.Biotechnol.,71:191,1999)。己经被研究用于丁醇生产的两种典型菌株梭状芽胞杆菌属和大肠杆菌，由于它们对终产物丁醇的耐受性而难于在工业应用中使用。同时，丁醇生物合成途径被引入其中从而能够产生丁醇的重组细菌以及使用所述细菌生产丁醇的方法已经被公开(US2007/0259410Al;US2007/0259411Al)，但生产效率不高。目前，酵母菌在乙醇发酵工业中被频繁使用，并对乙醇具有极高的耐受性。一般说来，这些酵母菌具有很高的新陈代谢活性和很高的生长率，并且在具有低pH、低温和低水活性的环境下诸如壤土中生长得很好，甚至在厌氧条件下绝大部分也能生长。人们认为这些性质为使用酵母菌生产丁醇中提供了最大的优势。但是，如图2所示，在通常条件下酵母菌不能天然产生丁醇。而且，已经试图使用重组酵母生产丁醇，但是丁醇的产量很小(WO2007/041269A2)。因此，本发明的发明人付出了极大的努力来开发使用酵母菌生产丁醇的新方法，结果发现使用各种途径在酵母菌中产生的中间体丁酰-CoA通过乙醇/乙醛脱氢酶(AAD)被转化成丁醇，从而完成了本发明。
发明内容因此，本发明的目的之一在于提供一种生产丁醇的方法，所述方法包括通过各种途径生产丁酰-CoA，其为在酵母中进行的丁醇生物合成途径中的重要中间体，然后使用产生的丁酰-CoA作为中间体生产丁醇，本发明还提供了具有生物合成丁醇的能力的重组酵母。为了实现上述目的,本发明提供了具有丁醇生产能力的重组酵母菌其中引入了能够通过将CoA半分子转移给有机酸而将有机酸转化成有机酸-CoA的CoAT(CoA-转移酶)-编码基因;并提供了用于生产丁酰-CoA和丁醇的方法，所述方法包括在含有丁酸的培养基中培养所述重组酵母菌。本发明还提供了用于生产丁醇的方法，所述方法包括下列步骤将所述重组酵母菌与具有丁酸产生能力的微生物共培养，使得丁酸由具有丁酸产生能力的微生物产生；允许重组酵母菌使用所产生的丁酸生产丁醇；并从培养液中回收丁醇。本发明还提供了用于生产丁酰-CoA和丁醇的方法，所述方法包括在含有脂肪酸的培养基中培养能够由脂肪酸生物合成丁酰-CoA的酵母菌。在本发明中，所述酵母菌优选具有编码AAD(乙醇/乙醛脱氢酶)的基因，所述基因由酵母菌自身表达以具有AAD活性或者将AAD-编码基因引入到酵母菌中。通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将是显而易见的。图1显示了丙酮丁醇梭杆菌中丁醇产生途径。图2显示了酵母菌中丁酸代谢途径的一部分。在图2中，虚线表述酵母菌中不存在的代谢途径，实线表示酵母菌中存在的代谢途径。图3显示了在重组酵母中使用丁酰-CoA库由脂肪酸生产丁醇的预测途径。图4显示了根据本发明通过使用培养基中的丁酸或者醋酸来增加酵7母细胞中的乙酰-CoA库从而在重组酵母菌中生产丁醇的途径。图5显示了pYUC18载体的基因图谱。图6显示了pYUC18.adhEl的基因图谱。图7显示了pYUC18.adhEl.ctfAB的基因图谱。具体实施例方式在本发明中，研究了两种方法以在酵母菌中生产丁酰-CoA:(l)通过将CoAT(CoA转移酶)编码基因引入到具有THL(—种将乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA的酶)编码基因的酵母菌中以便构建重组菌株，并在含有丁酸的培养基中培养重组酵母菌来生产丁酰-CoA的方法；和(2)在酵母菌本身中利用(3氧化途径由脂肪酸生产丁酰-CoA的方法。酵母菌可在过氧化物酶体和细胞质中通过e氧化途径使用各种脂肪酸产生短链长度(scl)和中等链长度(mcl)的酰基-CoA(Leaf,T.A.等人,Microbiology-Uk，142:1169,1996;Carlson,R.等人，J.Biotechnol.,124:561,2006;Zhang,B.等人，Appl.Environ.Microbiol.,72:536,2006)，但仍没有关于使用相同方法生产丁醇方面的报道。本发明的发明人试图构建具有AAD(乙醇/乙醛脱氢酶)-编码基因(adhEl)的重组酵母菌，所述基因来自丙酮丁醇梭杆菌ATCC824，其被引入到所述重组酵母菌中，以通过由所述两种方法产生预期的中间体丁酰-CoA来生产丁醇。另外，本发明的发明人甚至研究了当将没有梭状芽胞杆菌AAD活性的酵母菌在含有脂肪酸的培养基中培养时是否会产生丁醇。结果确定:(l)当将通过CoAT-编码基因和AAD-编码基因引入到具有THL-编码基因的酵母菌中而得到的重组菌株在含有丁醇的培养基中培养时，产生丁醇;(2)甚至当具有引入到其中的AAD-编码基因的重组菌株在含有脂肪酸的培养基中培养时，也产生丁醇;和(3)当没有梭状芽胞杆菌AAD活性的酵母菌在含有脂肪酸的培养基中培养时，产生丁醇。这些结果表明，通过P氧化途径由脂肪酸产生的丁酰-CoA通过由其自身表达的AAD被转化成了丁醇。这间接表明在本发明中使用的酵母菌具有由其自身表达以具有AAD活性的基因。通过上述结果可以看出，具有由其自身表达以具有AAD活性基因的酵母菌可被用于利用由各种途径合成的丁酰-CoA来生产丁醇。作为替代，当使用不具有AAD活性的酵母菌时，具有引入到其中的AAD-编码基因的重组酵母菌(例如，丙酮丁醇梭杆菌ATCC824-来源的adhEl)可被用于由丁酰-CoA生产丁醇。因此,在一个方面，本发明涉及具有丁醇生产能力的重组酵母菌，所述重组酵母菌中引入了能够通过将CoA半分子转移给有机酸而将有机酸转化成有机酸-CoA的CoAT(CoA-转移酶)-编码基因;本发明还涉及生产丁酰-CoA和丁醇的方法,所述方法包括在含有丁酸的培养基中培养所述重组酵母菌。在本发明中，所述酵母菌优选具有编码将乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA的酶(THL)的基因，所述CoAT优选为乙酰-CoA:丁酰-CoACoA-转移酶,并且所述CoAT编码基因优选为来自梭状芽胞杆菌属的ctfAB,但本发明的范围不限于此。在另一方面，本发明涉及生产丁酰-CoA和丁醇的方法，所述方法包括在含有脂肪酸的培养基中培养能够由脂肪酸生物合成丁酰-CoA的酵母菌。在本发明的一个例子中，具有被引入到其中的来自丙酮丁醇梭杆菌ATCC824的AAD(乙醇/乙醛脱氣酶)-编码基因(adhEl)的重组酵母菌[酿酒酵母(pYUC18.adhEl)]被分析以便检测重组酵母菌是否能够由乙酰-CoA或短链、中等链或长链脂肪酸通过其自身存在的酶产生丁酰-CoA。重组酵母菌被构建以便由酵母菌自身产生的丁酰-CoA通过丁酸生产丁醇。特别是,据预测，当各种酰基-CoA(丁酰-CoA,乙酰-CoA等等)在重组酵母菌中被使用时,丁醇的产生将变得可能。此外，据预测，丁醇可通过被引入或者在重组酵母菌中存在的AAD(乙醇/乙醛脱氢酶)由丁酰-CoA来生产(图3)。为了证实这种预测，在含有油酸/月桂酸的sc-缺陷型培养基中培养重组酵母菌。结果，可以观察到丁醇由通过e氧化途径合成的酰基-CoA,包括丁酰-CoA产生。而且观察到，丁醇在没有梭状芽胞杆菌AAD活性的菌株中也会产生。这被认为归因于重组酵母菌中存在的参与酰基-CoA合成中的酶和酵母菌本身具有AAD活性。特别是,可以预测在含有脂肪酸的培养基中通过培养重组酵母菌[酿酒酵母(pYUC18.adhEl)]和本身具有AAD活性的酵母菌可以产生丁醇的原因是因为脂肪酸通过酶的作用(酰基-CoA合成酶)被转化成scl-酰基-CoA或者mcl-酰基-CoA,诸如丁酰-CoA(图3)。因此，在本发明中可以确定酵母菌中存在的将脂肪酸转化成scl-酰基-CoA或者mcl-酰基-CoA诸如丁酰-CoA的酶(酰基-CoA合成酶)有助于丁醇的生产(Marchesini，S.等人，J.Biol.Chem.278:32596,2003;Zhang,B.等人，Appl.Environ.Microbiol.72:536,2006)。在本发明的另一个例子中,使用外源丁酸进行了实验以检测具有乙醇/乙醛脱氢酶(AAD)编码基因(adhEl)和引入了来自丙酮丁醇梭杆菌ATCC824的CoA转移酶(CoAT)-编码基因的重组酵母菌是否可增加细胞中的丁酰-CoA库以使用外源丁酸合成丁醇。重组酵母菌[酿酒酵母(pYUC18.adhEl.ctfAB)]被构建以便使用外源丁酸生产丁酰-CoA并经丁醛由丁酰-CoA生产丁酸。来自丙酮丁醇梭杆菌ATCC824的CoAT酶对于在酵母菌细胞中增加丁酰-CoA库来说是高度有利的，因为其将乙酰乙酰-CoA的CoA半分子转移给丁酰-CoA或者乙酰-CoA(图4)(Bermejo，L.等人，Appl.Environ.Microbiol.,64:1079,1998)。特别是，据预测，当在含有丁酸的培养基中培养具有AAD-编码基因(adhEl)和被引入到其中的10CoAT-编码基因(ctfAB)的重组酵母菌时，酵母细胞中的丁酰-CoA库可被增加,从而增加了丁醇的生产。而且,据预测，当在同时含有丁酸和脂肪酸的培养基中培养重组酵母时，酵母菌细胞中的丁酰-CoA库可被进一步增加，从而进一步增加了丁醇的生产(图4)。为了证实该假设，在含有丁酸的培养基中培养重组酵母菌[酿酒酵母(pYUC18.adhEl.ctfAB)],结果可以观察到丁醇由丁酸经丁酰-CoA产生。这被认为归因于重组酵母菌中存在参与丁酰-CoA产生的CoAT酶。在本发明中可以确定重组酵母菌中存在将丁酸或者醋酸转化成丁酰-CoA或者乙酰-CoA的CoAT有助于丁醇的生产。另外可以观察到,当在同时含有丁酸和脂肪酸的培养基中培养重组酵母菌时，丁醇的生产进一步被增加。这表明更多的丁酰-CoA由丁酸和脂肪酸通过CoAT酶和p-氧化途径被生物合成。在本发明中,脂肪酸优选具有4-24个碳原子并含有至少一个选自由油酸和月桂酸组成的组的脂肪酸。在本发明中,AAD-和CoAT-编码基因分别是Clostridiumsp.-来源的adhEl和ctfAB,但本发明的范围不限于此。例如，来自其他微生物的基因可在本发明中被使用而没有限制，只要它们可被引入并在宿主酵母菌中表达以显示与上面描述的基因相同的酶活性。同时,除了直接将外源丁酸加入到重组酵母菌的方法之外，也可采用共培养的方法提供丁酸。特别是，可以共培养能够产生丁酸的菌株与本发明的重组酵母菌,从而通过丁酸产生菌株产生前体丁酸，而产生的丁酸可由本发明的重组酵母菌经丁酰-CoA转化成丁醇。共培养菌株以便经前体产生特定产物的例子包括白色瘤胃球菌和产琥珀酸沃廉菌。除主要产物醋酸之外，通过纯培养的白色瘤胃球菌进行葡萄糖发酵可产生C02、H2和乙醇作为终产物。但是,当白色瘤胃球菌与产琥珀酸沃廉菌共培养时，氢气被除去，从而不产生乙醇。这里，产琥珀酸沃廉菌可由乙酰-CoA产生醋酸以形成ATP,因此与纯培养白色瘤胃球菌相比，每摩尔葡萄糖ATP的产量可被增加。特别是，与白色瘤胃球菌纯培养相比，其与产琥珀酸沃廉菌共培养时通过所需ATP的供应，可以更有效地产生终产物醋酸(Stams,A丄，AntonieVanLeeuwenhoek,66:271,1994)。能够产生丁酸的微生物包括梭状芽胞杆菌属微生物(酪酸梭状芽胞杆菌,贝氏梭状芽胞杆菌，丙酮丁醇梭杆菌等)和肠道微生物(Megasphaeraelsdenii,Mitsuokellamultiacida等)(Alam，S.等人,J.Ind.Microbiol"2:359,1988;Andel,J.G.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol"23:21-26,1985;Barbeau,J.Y.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol"29:447,1988;Takamitsu,T.等人，J.Nutr.,132:2229,2002)。当丁酸产生菌与本发明的重组酵母菌共培养时，丁酸可由该菌株产生，并且本发明的重组酵母菌可使用所产生的丁酸产生丁醇。因此,在另一方面,本发明涉及生产丁醇的方法,所述方法包括下列步骤:将所述重组酵母菌与具有丁酸产生能力的微生物共培养,从而具有丁酸产生能力的微生物产生丁酸;允许重组酵母菌使用产生的丁酸生产丁醇;并从培养液中回收丁醇。虽然仅仅梭状芽胞杆菌属微生物和肠道微生物已经被提及可作为在共培养中使用的丁酸产生菌株，对本领域技术人员来说显而易见地是，任何菌株都可在本发明中被使用而没有限制，只要它们可产生丁酸并可与重组酵母菌共培养。实施例此后，将参照实施例进一步详细描述本发明。但是应当理解，这些实施例仅仅是示例性的，本发明的范围不限于此。特别是，虽然下面的实施例仅仅说明酿酒酵母作为酵母菌，使用其它酵母菌对本领域技术人员来说也是显而易见的。另外，虽然下面的实施例仅仅说明来自特定菌株的基因作为引入的基因，本领域技术人员将会理解，任何基因都可被用作引入的基因，只要其在宿主细胞中被表达而显示与上述基因相同的活性。而且,应当注意的是，虽然在下面的实施例中仅仅以特定的培养基和方法作为例子，糖化液，诸如乳清、CSL(谷物浸出液)等和其它培养基,以及各种培养方法,诸如分批培养法,连续培养法等(Lee等人，BioprocessBiosyst.Eng.,26:63,2003;Lee等人，Appl.Microbiol.Biotechnol"58:663,2002;Lee等人，Biotechnol.Lett.,25:111,2003;Lee等人，Appl.Microbiol.Biotechnol"54:23,2000;Lee等人，Biotechnol.Bioeng.,72:41，2001)也落入本发明的范围之内。实施例l:其中具有被引入的由丁酰-CoA生产丁醇的途径的重组DNA的制备作为丁醇生物合成途径的最后步骤中的基因，丙酮丁醇梭杆菌ATCC824adhEl(AAD-编码基因)被扩增并克隆到pYUC18表达载体中,从而得到pYUC18.adhEl载体。表达载体pYUC18通过将在酵母菌中具有活性的复制起始区、启动子、转录终止序列插入到作为骨干的大肠杆菌克隆载体pUC18(Amersham)中来构建。使用引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，以pYDl(Invitrogen)作为模板通过PCR进行30个循环来扩增，该循环过程为95""C变性20秒,55'C退火30秒并且72'C延伸30秒,从而得到PCR片段(GAL启动子)。而且，使用引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4以上面描述的相同方式进行PCR,从而得到PCR片段(转录终止序列，TRP1ORF,复制子)。然后,使用引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:4以第一PCR片段和第二PCR片段作为模板同时进行PCR，从而得到最终的PCR片段，其中第一和第二PCR片段彼此连接在一起。扩增的PCR片段被///wdlll-SacI消化，并被克隆到使用相同酶(/f/"dlII-SacI)消化过的pUC1813载体中，从而构建酵母菌表达载体pYUC18(图5)。PI:5'-aaaaaagcttaacaaaagctggctagtacgg-3'[SEQIDNO:2]P2:5'-ggtacccggggatccgtcgacctgcagtccctatagtgagtcgtattacagc-3'P3:5，-ctgcaggtcgacggatccccgggtacccagtgt3gatgtaacaaaatcg3ct-3，P4:5，-ctaggagctcctgggtccttttcatcacgt-3，使用引物SEQIDNOs:5和6以丙酮丁醇梭杆菌ATCC824的染色体DNA作为模板通过PCR进行扩增，从而得到PCR片段。扩增的PCR片段(^//^7基因)被尸Wl-义mal消化并被克隆到表达载体pYUC18中，从而构建pYUC18.adhEl(图6)。P5:5'-aaaactgcagaagtgtatatttatgaaagtcacaacag-3'P6:5'-tccccccggggttgaaatatgaaggtttaaggttg-3，实施例2:其中具有被引入的AAD和CoAT的重组DNA的制备丙酮丁醇梭杆菌ATCC824fld/^/(AAD-编码基因)和ctfAB(CoAT-编码基因)被扩增并克隆到实施例1中构建的pYUC18表达载体中，从而得到pYUC18.adhEl.ctfAB载体(图7)。使用引物SEQIDNO:7和SEQIDNO:8，以丙酮丁醇梭杆菌ATCC824的染色体DNA作为模板通过PCR进行扩增，从而得到PCR片段。扩增的PCR片段(aWW-"/^B基因)被Sall-Xmal消化并被克隆到使用相同酶消化过的pYUC18表达载体中，从而构建pYUC18.adhEl.ctfAB(图7)。P7:5'-tacgcgtcgacaagtgtatatttatgaaagtcacaacag-3，[SEQIDNO:8]P8:5'-tccccccgggataccggcatgcagtatttctttctaaacagccatg-3'实施例3:其中具有被引入的AAD和/或CoAT的重组酵母菌的制备将在实施例1和2中制备的pYUC18,pYUC18.adhEl和pYUC18.adhEl.ctfAB的每个都引入到酿酒酵母ATCC208289菌株中并在SC-Trp选择培养基(无氨基酸的细菌培养用酵母氮基料(0.67%,Difco),葡萄糖(2%，CJ),缺陷型混合物(0.2。/。，TRPDO添加剂，BDBioscience),细菌培养用琼脂(2%,Difco))中筛选菌落,从而构建酿酒酵母(pYUC18),酿酒酵母(pYUC18.adhEl)和酿酒酵母(pYUC18.adhEl.ctfAB)菌株。实施例4:通过加入脂肪酸在酵母菌中生产丁醇通过培养在实施例3中构建的重组酵母菌酿酒酵母(pYUC18.adhEl)来尝试进行丁醇的生产。在培养中使用的培养基的基本成分如下无氨基酸的细菌培养用酵母氮基料(0.67%,Difco)，葡萄糖(2%,CJ),尿嘧啶(20mg/L,Sigma),L-亮氨酸(100mg/L，Sigma),和L-组氨酸(20mg/L,Sigma)。而且，在基本培养基中添加了2.5g/L的油酸和2.5g/L的月桂酸并调节为pH为5.7。将100mL培养基加入到250mL培养瓶中,并将重组酵母菌酿酒酵母(pYUC18.adhEl)接种到培养基中并在有氧和无氧室中30"C下培养。培养过程之后,以12小时为间隔从培养物中收集样品，并通过气相色谱仪(GC,Agillent)测定样品中的丁醇含量。结果,如下表l所示,可以观察到丁醇不仅在酿酒酵母(pYUC18.adhEl)菌株中产生，而且在酿酒酵母(pYUC18)菌株中也产生。这表明加入到培养基中的脂肪酸通过e-氧化被转化成包括丁酰-CoA的各种酰基-CoA库，然后被转化成丁醇。表l:使用脂肪酸(5g/L)的来自酿酒酵母菌株培养物上清液的丁醇浓度(mg/L)培养条件酿酒酵母(pYUC18)酿酒酵母(pYUC18.adhEl)有氧0.50.2厌氧1.81,8实施例5:通过加入丁酸在重组酵母菌中生产丁醇通过培养实施例3中构建的重组酵母菌酿酒酵母(pYUC18.adhEl.ctfAB)来尝试生产丁醇。在培养中使用的基本培养基组分与在实施例4中使用的相同。而且，在基本培养基中添加了40mM丁酸并将其pH调节为5.7。将100mL培养基加入到250mL培养瓶中,并将重组酵母菌酿酒酵母(pYUC18.adhE1.ctfAB)接种到培养基中并在有氧和无氧室中30°C下培养。在培养过程之后，以12小时为间隔从培养物中收集样品，并通过气相色谱仪(GC,Agillent)测定样品中丁醇的含量。结果,如下表2所示,在酵母菌酿酒酵母(pYUC18)中没有观察到丁醇产生，相反在酿酒酵母(pYUC18.adhEl.ctfAB)中产生丁醇。这表明，当在添加了丁酸的培养基中培养其中具有引入的CoAT的菌株时，重组细胞中的丁酰-CoA库增加，因此丁醇由重组细胞产生。表2:来自需要丁酸(40mM)的酵母菌培养物的上清液的丁醇浓度培养条件酿酒酵母(pYUC18)酿酒酵母(pYUC18.adhEl.ctfAB)有氧00.5厌氧01.2而且,在已添加丁酸的培养基中另外添加脂肪酸，并且将每种酵母菌都在该培养基中培养。然后，从培养物中收集的样品中测定丁醇的含量。结果，如下表3所示,当重组酵母菌在另外添加脂肪酸的己添加丁酸的培养基中被培养时也产生丁醇。而且，可以观察到重组菌株酿酒酵母(pYUC18.adhEl.ctfAB)比酿酒酵母(pYUC18)菌株产生更高浓度的丁醇。这表明同时具有(l)通过酰基-CoA合成酶的作用将脂肪酸转化成丁酰-CoA的代谢途径和(2)通过CoAT的作用将丁酸转化成丁酰-CoA的代谢途径的重组菌株酿酒酵母(pYUC18.adhEl.ctfAB)更有利于丁醇合成。而且，可以看出生物合成作为中间体的丁酰-CoA的代谢途径在丁醇产生中起了重要作用。表3:使用丁酸(20mM)和脂肪酸(5g/L)的来自酵母菌培养物上清液的丁醇浓度(mg/L)_<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>工业实用性如上面详细描述的那样,本发明具有提供在酵母菌中生产丁醇的方法的作用，所述方法包括利用各种途径在酵母菌中生产丁酰-CoA，然后使用产生的丁酰-CoA作为中间体生产丁醇。虽然已经参照具体特征对本发明进行了详细描述，但本领域技术人员将会理解，该描述仅仅是优选实施方式，而不会限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附的权利要求书及其等同物来限定。权利要求1.一种具有丁醇产生能力的重组酵母菌，所述重组酵母菌中引入了能够通过将CoA半分子转移给有机酸而将有机酸转化成有机酸-CoA的CoAT(CoA-转移酶)-编码基因。2.根据权利要求1所述的具有丁醇产生能力的重组酵母菌，其特征在于，所述CoAT为乙酰-CoA:丁酰-CoACoA-转移酶。3.根据权利要求2所述的具有丁醇产生能力的重组酵母菌，其特征在于，所述CoAT编码基因为来自梭状芽胞杆菌属的"/J5。4.根据权利要求1所述的具有丁醇产生能力的重组酵母菌，其特征在于，酵母菌具有编码将乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA的酶(THL)的基因。5.—种生产丁酰-CoA的方法，所述方法包括在含有丁酸的培养基中培养权利要求1-4中任意一项所述的重组酵母菌。6.根据权利要求5所述的生产丁酰-CoA的方法，其特征在于，所述培养基进一步含有脂肪酸。7.根据权利要求6所述的生产丁酰-CoA的方法，其特征在于，脂肪酸具有4-24个碳原子。8.—种生产丁醇的方法，所述方法包括在含有丁酸的培养基中培养权利要求1-4中任意一项所述的重组酵母菌以产生丁醇；并从培养液中回收所产生的丁醇。9.根据权利要求8所述的生产丁醇的方法，其特征在于，所述酵母菌本身被表达以具有编码AAD(乙醇/乙醛脱氢酶)的基因，显示AAD活性。10.根据权利要求8所述的生产丁醇的方法，其特征在于，所述酵母菌为其中具有被引入的AAD-编码基因的重组酵母菌。11.根据权利要求IO所述的生产丁醇的方法，其特征在于，AAD-编码基因为来自梭状芽胞杆菌属的或者^//^2。12.根据权利要求8所述的生产丁醇的方法，其特征在于，所述培养基进一步含有脂肪酸。13.根据权利要求12所述的生产丁醇的方法，其特征在于，脂肪酸具有4-24个碳原子。14.一种生产丁醇的方法，所述方法包括下列步骤将权利要求1-4中任意一项所述的重组酵母菌与具有丁酸产生能力的微生物共培养，使丁酸由具有丁酸产生能力的微生物产生；允许重组酵母菌使用产生的丁酸产生丁醇；并且从培养液中回收丁醇。15.根据权利要求14所述的生产丁醇的方法，其特征在于，所述酵母菌本身被表达以具有编码AAD(乙醇/乙醛脱氢酶)的基因，显示AAD活性。16.根据权利要求14所述的生产丁醇的方法，其特征在于，所述酵母菌为其中具有被引入的AAD-编码基因的重组酵母菌。17.根据权利要求16所述的生产丁醇的方法，其特征在于，AAD-编码基因为来自梭状芽胞杆菌属的或者^//^2。18.根据权利要求14所述的生产丁醇的方法，其特征在于，所述培养基进一步含有脂肪酸。19.根据权利要求18所述的生产丁醇的方法，其特征在于，脂肪酸具有4-24个碳原子。20.—种生产丁酰-CoA的方法，所述方法包括在含有脂肪酸的培养基中培养能够由脂肪酸生物合成丁酰-CoA的酵母菌。21.根据权利要求20所述的生产丁酰-CoA的方法，其特征在于，脂肪酸具有4-24个碳原子。22.—种生产丁醇的方法，所述方法包括在含有脂肪酸的培养基中培养能够由脂肪酸生物合成丁酰-CoA的酵母菌以产生丁醇；和从培养液中回收产生的丁醇。23.根据权利要求22所述的生产丁醇的方法，其特征在于，脂肪酸具有4-24个碳原子。24.根据权利要求22所述的生产丁醇的方法，其特征在于，所述酵母菌本身被表达以具有编码AAD(乙醇/乙醛脱氢酶)的基因，显示AAD活性。25.根据权利要求24所述的生产丁醇的方法，其特征在于，所述酵母菌为其中具有被引入的AAD-编码基因的重组酵母菌。26.根据权利要求25所述的生产丁醇的方法，其特征在于，AAD-编码基因为来自梭状芽胞杆菌属的"d/^7或者《^￡2。全文摘要本发明涉及一种在具有利用丁酰-CoA作为中间体生物合成丁醇的能力的酵母菌中生产丁醇的方法，所述方法包括在其中具有被引入的CoAT(乙酰-CoA丁酰-CoACoA-转移酶)编码基因的酵母菌中通过各种途径生产丁酰-CoA，然后将产生的丁酰-CoA转化成丁醇。文档编号C12N15/81GK101631864SQ200880004615公开日2010年1月20日申请日期2008年2月11日优先权日2007年2月8日发明者埃莱夫塞里奥斯·特里帕·保特塞克斯,张俞信,李相烨申请人:生物普尔肯株式会社