丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性检测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及糖蛋白特异性英光检测技术，具体地说是丹醜脱及其衍生物在糖蛋白 特异性英光检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质糖基化修饰在生命科学研究领域具有至关重要的作用，作为最主要和普遍 的蛋白质翻译后修饰之一，目前已知哺乳动物蛋白质中至少有二分之一发生了糖基化，该 些糖蛋白广泛分布于组织、细胞、体液中，特别是在细胞膜表面、体液等中含量丰富，糖基化 对于蛋白质的折叠、运输和定位等都起着重要作用，并参与受体激活、信号转导、细胞载附 等诸多重要的生物过程。糖蛋白数量变化或糖链结构的改变，都可能导致疾病发生。不但 目前已知的很多疾病的诊断标志物是糖蛋白，而且通过国际标准认证的药物中，糖蛋白也 占到较高的比例。
[0003]目前糖蛋白检测领域试剂盒主要集中于外国的生物试剂公司，且多数产品均W高 附加值的价格在市场销售，价格高昂，不利于生物技术基础研究的发展。尤其国内利用现有 的生物试剂进行生物实验成本居高不下，无法实现经济效益与实验共同发展。本发明开发 的丹醜脱及其衍生物英光染色方法灵敏度接近Pro-QEmerald488染色法，是一种灵敏、便 捷、特异的糖蛋白英光检测技术，有较好的基础与临床意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供丹醜脱及其衍生物在糖蛋白特异性英光检测中的应用。
[0005] 本发明所述的丹醜脱相关化合物是指W丹醜脱阴离子为母核的轴盐、钟盐和馈盐 等。
[0006] 丹醜脱母核为：
[0007]
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明还提供了应用丹醜脱进行糖蛋白特异性英光检测 的方法包括如下步骤：
[0009] 1)将经SDS-PAGE电泳后含蛋白质样品的凝胶置于固定液中固定10~60min，弃 固定液。
[0010] 优选的固定时间为30min，固定液可W是含有40%己醇和10%己酸的水溶液；
[0011] 2)在高楓酸溶液里氧化10~40min，其中高楓酸溶液为含重量体积比0. 1~1% 的高楓酸及按体积比0. 5~5 %的己酸水溶液。然后用按体积比0. 5~5 %的己酸水溶液冲 洗2~5次，每次1~lOmin;优选的氧化时间为20min，优选的氧化液组成为含重量体积比 0. 5 %的高楓酸及按体积比3 %的己酸水溶液；氧化后优选的洗脱次数为3次，每次5min，优 选的洗脱液组成为体积比为3%的己酸溶液。
[0012] 3)加入染色液5~60min，其中染色液为含重量体积比0. 001~0. 02%的丹醜脱 或其衍生物及按体积比0. 5~5%的己酸水溶液。优选的染色时间为30min，优选的染色液 组成为含重量体积比0. 006%的丹醜脱及按体积比3%的己酸水溶液；
[0013] 4)加入洗脱液，洗脱液组成为体积比0. 5~5. 0%的己酸水溶液，洗脱1~3次， 每次5~20min。优选的洗脱次数为2次，每次lOmin，优选的洗脱液组成为按体积比3%的 己酸水溶液。
[0014] 5)检测，可在激光扫描仪下观察染色后的糖蛋白。
[0015] 前期研究表明该技术有如下优点：
[0016] 1)灵敏度高；丹醜脱糖蛋白特异性英光检测法灵敏度同Pro-QEmerald488灵敏度 相当；
[0017] 2)操作简单迅速：操作步骤少，可在2个小时内完成；
[0018] 3)重现性好；受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；
[001引 4)可逆性好；容易脱色；
[0020] W质谱兼容性好：由于丹醜脱英光检测法不影响蛋白质结构，所W可与 MLDI-T0F等质谱仪高度兼容；
[0021] 6)使用安全；采用毒性低的染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；
[002引 7)成本低。
【附图说明】
[0023]图1.丹醜脱的化学结构；
[0024]图2.在一向SDS-PA(iE胶上，丹醜脱糖蛋白英光染色法与其它染色法检测蛋白 质标准品效果的比较。（A)丹醜脱糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色 法，（C)SYPRORuby全蛋白英光染色法。Pro-Q血erald糖蛋白英光染色法和SYPR0Ruby 全蛋白英光染色法均按照文献记载操作。采用Sigma公司的8种不同标准蛋白质为样 品；Transferrin(糖蛋白），BSA(非糖蛋白），IgG(糖蛋白），0VA(糖蛋白），a1-acid glycoprotein(糖蛋白），a-casein(非糖蛋白），目-casein(非糖蛋白），avidin(糖蛋 白），在图中用斜体字表示糖蛋白。带1，100化g;带2,50化g;带3,25化g;带4,125ng;带 5,64ng;带 6, 32ng;带 7,16ng;带 8,8ng;带 9,4ng;带 10, 2ng。
[0025]图3.在一向SDS-PAGE胶上，丹醜脱糖蛋白英光染色法与其它染色方法检测实际 样品效果的比较。（A)丹醜脱糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色法，（C) SYPR0Ruby全蛋白英光染色法。Pro-Q血erald糖蛋白英光染色法和SYPR0Ruby全蛋白英光 染色法均按照文献记载操作；采用提取的人血清总蛋白为样品。带l，5000ng;带2,2500ng; 带 3,1250ng;带 4,625ng;带 5,31化g;带 6,160ng;带 7,80ng;带 8,40ng;带 9,20ng;带 10， lOng。
[0026] 图4.在二向SDS-PAGE胶上，丹醜脱糖蛋白英光染色法与其它染色方法检测实际 样品效果的比较。（A)丹醜脱糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色法，（C) SYPR0Ruby全蛋白英光染色法。分离样品为大鼠肝脏总蛋白；IPG胶条长13cm，P册-10;分 离胶的浓度为11.4% ;样品上样量为25yg/胶条。
[0027] 图5.在一向SDS-PAGE胶上，丹醜脱糖蛋白英光染色法与其它染色方法针对糖蛋 白染色特异性的考察。（A)丹醜脱糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色 法，（C)SYPRORuby全蛋白英光染色法。用PNGaseF去除标准蛋白a1-acidglycoprotein 及人血清总蛋白中N-链糖。带1，人血清总蛋白；带2,去N-链糖后人血清总蛋白；带3， a1-acidglycoprotein;带 4,去N-链糖后a1-acidglycoprotein;带 5,PNGaseF酶。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，该些实施例仅用于说明 本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0029] 实施例1丹醜脱糖蛋白特异性英光染色
[0030] 图1是丹醜脱的化学结构式。
[0031] 丹醜脱糖蛋白英光染色法采用如下述步骤进行：
[0032] 1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于40%己醇和10%己酸水溶液中固 定30min，弃固定液；
[0033] 2)在高楓酸溶液里氧化20min，其中高楓酸溶液为含重量体积比0. 5%的高楓酸 及按体积比3%的己酸水溶液。然后用按体积比3%的己酸水溶液冲洗3次，每次5min;
[0034] 3)加入染色液染色30min，其中染色液为含重量体积比0. 006%的丹醜脱及按体 积比