专利名称：转谷氨酰胺酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及新型的转谷氨酰胺酶的制备方法，具体而言，涉及将变性状态的转谷氨酰胺酶重折叠成具有酶活性、与天然状态的酶基本上具有同等活性的转谷氨酰胺酶的制备方法。通过该方法可以将变性的微生物转谷氨酰胺酶重折叠成具有酶活性的天然状态的酶，可以将用基因重组技术生产的无活性酶蛋白质变换成大量且廉价的高活性的酶，能广泛应用于食品加工领域。
背景技术：
转谷氨酰胺酶可应用于果冻等胶状食品、酸奶、奶酪、或胶状化妆品等的制备和肉食的改造等，还可广泛应用于除此之外的领域，是工业上极其有用的酶。
转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13；TGase)是催化蛋白质或多肽链的谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基与一级胺基间的乙酰基转移反应的酶，其中，将从微生物(茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobraense)的变种)培养上清中发现的转谷氨酰胺酶称之为微生物来源的转谷氨酰胺酶(MTG)。
MTG是由331个氨基酸构成的分子量为38000的单聚体蛋白质(生物化学杂志，268，11565-11572，1993)。为了大量生产该酶，就力求使上述微生物的培养条件最适化(Agricaltural BiologicalChemistry，53，2613-，1989)，但该微生物不能广泛应用于以往蛋白质的工业生产，生产量和生产耗费等方面也存在许多问题。另外，该酶虽可在菌体外以活性状态分泌，但由于它分子内具有4处通过脱酰胺反应而容易进行化学修饰的序列，在进行分泌生产的过程中培养液中进行了化学修饰，回收的培养上清中蓄积了活性很低的酶。为了解决这些问题，对应用大肠杆菌等微生物的基因重组MTG的生产法进行了各种探索(Bioscience and Bioindustry，52，554-561，1994)。
若让该酶的序列在大肠杆菌的菌体表达，其表达量甚微，但通过与可高表达的T7基因10来源的序列片段融合可成功地高表达融合蛋白质。但是，将该融合蛋白限制性分解而得到的具有原本序列的酶的活性，是天然状态下转谷氨酰胺酶的1/5，这提示了用该方法得到的酶的高级结构的不完全性(Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，61，830-835，1997)。此外，从融合蛋白中仅切出该酶的序列，就有必要通过消化酶或化学手段进行限制性分解，问题是不仅制备方法复杂，而且生产耗费高。
要解决以上问题，就有必要获得用微生物直接高表达该酶序列的技术，获得将回收的变性状态的酶完全再形成高级结构、恢复酶活性的技术(再折叠技术)。先前，本申请人在大肠杆菌菌体内表达MTG时，将使用的密码子变成宿主大肠杆菌用的，通过大幅度增加质粒的拷贝数而成功地实现目前为止尚不可能的在菌体内高表达该酶序列，并将该内容申请了专利(特愿平10-181951号，平成10年6月29日申请，特开平11-075876号(平成11年3月23日公开)，以下将该发明称为“以前的发明”)。
在这种状况下，努力开发优良的重折叠方法。
发明的课题、目的可是，对于蛋白质的重折叠技术来讲，预测检测目标蛋白质的天然状态的适宜条件是不可能的，有必要用实际的目标蛋白质进行各自操作条件的试验性探索(Advances in Protein Chemistry，50，1-59，1997)。根据以前的发明(上述本申请人申请的专利)，可从大量变性状态的该酶入手，在这里初次探讨该酶重折叠技术。
本发明的目的是为了建立该酶的廉价的工业制备方法，开发由基因重组微生物生产的变性状态下获得的该酶的重折叠方法，提供基本上与天然状态的转谷氨酰胺酶具有同等酶活性(即转谷氨酰胺酶活性)的转谷氨酰胺酶的制备方法。发明的公开以解决上述课题为本发明的目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现变性状态下的转谷氨酰胺酶至少要经过包含下述工序(a)和(b)的工序才能有效的制备出具有酶活性的转谷氨酰胺酶(a)将该变性状态的酶形成中间结构的工序，所述的中间结构是形成在水性溶剂中、酸性条件下具有酶活性的结构的中间结构；以及(b)将已经形成上述结构形成的中间结构的酶形成高级结构的工序，所述的高级结构是在水性溶剂中、pH值中性范围内具有酶活性的高级结构。
也就是说，本发明为至少包括上述步骤(a)和(b)，特别是包括重折叠步骤的转谷氨酰胺酶的制备方法。
(a)中得到的具有中间结构的酶，象(a)中处理过程那样得到的酶虽具有转谷氨酰胺酶活性，但与天然存在的酶相比其活性基本上很低，例如酶活性不到20U/ml。
再者，本发明包括下述内容。
1.上述工序(a)的方法中，当该酶分子内的半胱氨酸残基的巯基为游离形式，形成在水性溶剂中、酸性条件下有酶活性的结构的中间结构时，在酸性条件下将该酶稀释。
2个半胱氨酸残基部分结合形成二聚体时，优选还原的的巯基为游离形式的。
2.上述方法，其中工序(b)中，水性溶剂包括形成具有酶活性的高级结构的促进剂。
工序(b)中包含调整到中性范围的阶段，此时可使用促进高级结构的目的物形成的促进剂，特别优选在升高pH值之前添加使用。此时，作为促进剂，优选低分子量化合物，例如氯化钾、氯化锶等无机盐，醋酸钠、丙酸钠等有机盐，氨基酸盐，聚乙二醇等，DMSO、DMF等有机溶剂。
3.上述方法，其中在工序(b)之后，包含工序(c)-即会合该酶中无活性的酶，分离该凝积物的工序。
4.上述方法，其中在工序(a)中该酶溶解在水性溶剂中，工序(b)中该中性范围是将工序(a)中获得的酶溶液的pH值升高到中性范围。
5.上述方法，其中在工序(a)中，将该变性状态的酶的酸性溶液在酸性条件下稀释时，在低温下进行，优选在15℃以下进行稀释，稀释的蛋白质浓度不到10mg/ml。
稀释倍数为5倍以上，优选10倍以上，更优选50～400倍，可分几个阶段进行稀释。当使用下述变性剂进行稀释时，稀释前和稀释后以尿素代表变性剂的浓度时，稀释成4～10M，优选稀释成0.01～0.5M。
工序(a)优选在低温下进行，特别是稀释时优选在低温下进行。例如，在15℃以下，优选在3-10℃的温度下进行。
6.上述方法，其中在工序(a)中的水性溶剂包含蛋白质变性剂。
优选初始物质的转谷氨酰胺酶在水性溶剂中有良好的溶解性，可使用蛋白质变性剂作为溶解辅助剂。这种情况下的蛋白质变性剂包括尿素，盐酸胍，硫氰酸盐等。使用的浓度就是普通蛋白质变性时使用的浓度，也可根据变性剂的种类选用，如使用尿素作为变性剂时，使用浓度为4-10M。
7.转谷氨酰胺酶的制备方法，它是通过将变性状态下的转谷氨酰胺酶在酸性条件下溶解到水性溶剂中，其后，将该酶溶液调整到中性范围时，生产出具有酶活性状态的酶。此时，优选的处理条件等可利用前面记载的。
8.上述方法，其中在工序(a)中得到的形成所述结构的中间结构，在近紫外区的CD谱与天然状态的相比有30-70％的分子椭圆率。
9.将变性状态下的转谷氨酰胺酶酸性条件下溶解到水性溶剂中，可得到具有以下性质(d)-(g)的蛋白质。
(d)用异羟肟酸法进行转谷氨酰胺酶活性测定，具有15-25U/mg的比活性；(e)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，分子量为36000-40000；(f)近紫外区的CD谱与天然状态的相比有30-70％的分子椭圆率；(g)用His-Mes pH6.1的缓冲液系统进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，与天然状态的相比迁移率慢。
上述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，优选具有与天然状态同等的大约38000的分子量。
转谷氨酰胺酶活性测定中所应用的异羟肟酸法，可按众知的方法(例如，参照文献Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，61，830-835，1997)进行。
下面是本发明的适宜例子。
下面工序包含工序A和B，由变性状态的转谷氨酰胺酶(MTG)，通过重折叠方法，制备具有酶活性的天然状态的转谷氨酰胺酶(A)将含有活性残基半胱氨酸残基(Cys)的巯基游离(free)，来自变性、可溶化了的微生物的转谷氨酰胺酶溶液的pH值调整到酸性范围，优选用含有少量变性剂的酸性缓冲液，优选稀释50-400倍，得到具有形成天然状态结构的过程中形成的中间结构(状态)的酶；(B)向含有上述具有中间结构(状态)的酶溶液中直接添加碱性溶液，或者在添加促进结构形成的低分子量化合物后添加碱性溶液，使其pH值上升到中性范围，6-7左右，促进该酶高级结构的形成，或者在形成高级结构的基础上，必要时会合未形成该结构的无活性级分，作为凝集物进行分离的过程。
实施方案下面对本发明的实施方案进行详细说明。尤其是从含有培养重组大肠杆菌而得到的变性状态的酶的培养物开始，作为适宜例，具体地以进行重折叠的情况为中心进行说明，但本发明并不限定于此。
本发明使用的初始物质-被处理物是变性状态的转谷氨酰胺酶，优选象来自微生物的变性转谷氨酰胺酶(MTG)那样没有高级结构、基本上不显示酶活性的转谷氨酰胺酶，再者具有最终能发挥转谷氨酰胺酶活性序列的酶也包含在本发明的初始物质之内。
更详细地讲，天然状态的转谷氨酰胺酶的序列是从N端的天门冬酰胺残基(序号1)开始到C端的脯氨酸残基(序号331)为止的331个氨基酸构成的，不用说这样的蛋白质也包含在本发明的初始物质之内。另外，其它具有从第2个到第331个氨基酸残基，由330个氨基酸(缺失第1个门冬酰胺残基)构成的蛋白质，或者N端和/或C端侧结合了一个或多个氨基酸残基的蛋白质，基本上不显示转谷氨酰胺酶活性，但通过高级结构的形成后具有了活性或有这种可能的蛋白质也包含在内。这种蛋白质的氨基酸序列内缺失、置换和/或添加或插入了一个或多个氨基酸，通过本发明的方法，可具有转谷氨酰胺酶活性或有这种可能性，具有这种序列的蛋白质也包含在本发明的初始物质之内。
本发明使用的初始物质的代表性例子包括，培养插入了微生物来源的转谷氨酰胺酶基因的微生物，例如重组的大肠杆菌，而得到的含变性酶的培养物(以前的发明上述本申请人的在先申请作为后面实施例中的参考制造例)。这里，改变微生物来源的转谷氨酰胺酶基因的一部分，使其表达的氨基酸序列的一部分中，有一处或多处发生缺失/或置换(一个或多个氨基酸残基)，和/或添加、插入一个或多个氨基酸，使之最终发挥转谷氨酰胺酶活性，若具有这样序列的可作为本发明的初始物质使用。
应用大肠杆菌作为生产宿主时，微生物来源的转谷氨酰胺酶起初在菌体中以不溶性颗粒蓄积，所以该颗粒可作为本发明的初始物质。这种情况下，优选在水性溶剂中使按常规方法回收的微生物来源的转谷氨酰胺酶的不溶性颗粒可溶化。此时，将之悬浮到1mM乙二胺四乙酸(EDTA)后，可应用尿素、盐酸胍等蛋白质变性剂溶化它。其它的用于可溶化的变性剂包括硫氰酸盐等。
尿素浓度和盐酸胍浓度按一般蛋白质变性所必要的浓度使用，分别为7-10M、4-7M左右。微生物来源的转谷氨酰胺酶的浓度无特别限制，但优选尽可能的高浓度，例如10-100mg/ml左右。
该水溶液中，在见到如二聚体这样的二硫键结合进行还原时，优选添加还原剂。此时可向水溶液中添加还原剂，如20mM的二硫苏糖醇(DTT)，将pH值调整到7.5以后，37℃搅拌大约2小时，使其溶化。
接着，向这样得到的微生物来源的转谷氨酰胺酶可溶化液中添加适量的盐酸等酸，将其pH值调整到2-7，优选3-5，更优选3.5-4.5，用包含相同浓度变性剂和还原剂的同一缓冲液或相同pH值的缓冲液稀释，将浓度调整为10-100mg/ml，优选20-80mg/ml。处理温度优选低温0-15℃，优选在3-10℃左右进行处理。
将上面得到的溶液稀释到预先冷却到3-10℃的5-50mM的醋酸钠缓冲液中，优选15-25mM，pH3-5，优选pH3.5-4.5，将蛋白质浓度调整为0.2-4mg/ml，尿素浓度为0.01-0.5M，这样能引导变性酶转向形成所述结构的中间结构(状态)。调整溶剂环境，在酸性条件下稀释，起初以速度效果观察的中间状态，不是平衡容易地从天然状态引导出的状态(参照后述的实施例11-16)。
变性酶的稀释可分阶段进行，总体的稀释倍数优选50-400倍左右，使用变性剂时，变性剂的浓度用尿素代表时，将浓度为4-10M左右的酶稀释到0.01-0.5M左右。
在上述酸性条件下进行稀释时，适于重折叠的获得上述结构形成的中间结构(中间状态)时间长，例如保持在0.5小时以上，优选1小时以上，更优选保持1.5小时以上。
如此形成的中间结构(中间状态)与后面实施例11-16中所示的天然结构(状态)的不同，通过选择本发明优选的稀释条件，可有效获得“天然状态”的转谷氨酰胺酶。
中间状态的形成可用逆相高效液相(HPLC)和高效凝胶过滤色谱进行检测，如分别用Vydac 214TP54(4.6φ×250mm，SEPARATIONSGROUP)和Superdex-75 HR 10/30(10φ×300mm，ァマシャム·ファルマシァ·バィオラク)进行检测，通过比较微生物来源的转谷氨酰胺酶的峰面积可进行确认。用文献(Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，61，830-835，1997)记载的方法测定出的中间状态的酶活性低，如比活性为10-20U/mg左右，比天然状态的酶活性(约300U/mg)大大下降。具有这样酶活性的组分或级分包含在本发明(a)工序中得到的具有“形成所述结构的中间结构”的酶中。因此，在具有这样低酶活性的MTG生产阶段(不包含其采集过程)，结束本发明的(a)工序。
应用凝胶过滤色谱和透析可取代上述稀释法，形成中间(状态)，但与稀释法相比，酶蛋白质的回收率和酶活性(比活性)降低，所以，不优选这些方法。若得到上述低酶活性产物，可进行(b)工序，尤其没必要分离本发明(a)工序中的酶。
接着，在(b)工序中，将如上得到的含有形成中间状态的酶溶液的pH值处理成中性范围。此时，将酶溶液维持在低温下，例如维持在15℃以下，优选维持在3-10℃，升高其pH值到中性范围。调整成中性范围的方法优选向其中添加碱性溶液，将pH值升高到5.8-8.5，优选6-7，离心除去产生的沉淀，回收含结构形成结束了的微生物来源的转谷氨酰胺酶的上清。因此，会合该方法完成上述结构形成中得到的无活性酶，作为凝集物可容易地分离，所以极为有利。在获得具有上述目标酶活性的结构形成阶段(不包含其采集过程)，结束本发明的(b)工序。
上清的酶活性为30U/mg，与天然状态的同等高，各种HPLC的洗脱峰形图，分光学性质，及热稳定性与天然状态的微生物来源的转谷氨酰胺酶完全或基本一致。由以上可知，从变性蛋白质完成向天然状态酶的重折叠。此外，酶的分离、纯化方法，可利用已知的转谷氨酰胺酶之外其它酶的分离、纯化方法，容易地进行。
在升高中间状态的pH值时，预先向其中添加低分子量化合物作为促进剂，由此可促进从中间状态向天然状态的结构形成。比如，0.01-10mM氯化钙(CaCl2)等2价金属盐，形成结构转移的核心促进局部结构形成，促进中间状态向天然状态转移。除氯化钙以外，可应用氯化锶等无机盐。0.1-2M的醋酸钠和丙酸钠等有机盐，0.1-2M的精氨酸盐酸盐等氨基酸盐，10-40％的二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺等有机溶剂，1-10％的聚乙二醇等多元醇和1-50mM的CHAPS等表面活性剂，可通过改变缓冲液的性质而抑制向天然状态结构转移的过程中产生的酶会合聚集，提高该酶蛋白质的回收率。
如此得到的转谷氨酰胺酶纯度极高，将之分离纯化无特殊困难，应用惯用的或已知的方法进行酶(转谷氨酰胺酶)的分离纯化很容易进行。
本发明中如此得到的转谷氨酰胺酶与天然状态的基本上具有同等活性，且纯度极高，所以没必要再进行纯化，可直接在食品等各种领域与天然状态的转谷氨酰胺酶同样使用。
附图简述
图1示MTG表达质粒pTRPMTG-01的构建图。
图2示MTG表达质粒pTRPMTG-02的构建图。
图3表示MTG表达的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的展开图。
1.MTG(4μg)2.pUC19/JM109的菌体破碎总级分(阴性对照)3.pUCTRPMTG-02/JM109的菌体破碎总级分4.第3泳道的离心上清部分5.第3泳道的离心沉淀部分图4示质粒pUCN216D的构建图。
图5示MTG表达质粒pTRPMTG(+)D2的构建图。
图6表示缺失相当于精氨酸残基GAT的图。
图7表示N末端的氨基酸为丝氨酸的图。
图8表示天然状态的转谷氨酰胺酶(天然型)与从基因重组MTG获得的酶(基因重组型)的逆相HPLC图。
1.基因重组型；2.天然型天然型、基因重组型转谷氨酰胺酶分别以8μg以下的条件进行逆相HPLC。柱Vydac 214TP5410洗脱液A 0.1％TFA(三氟醋酸)B 0.1％TFA，80％乙腈洗脱程序1ml/min时间(分)A(％)B(％)0 703020 505025 0 10028 0 100图9表示天然状态的(天然型)与从基因重组MTG获得的(基因重组型)转谷氨酰胺酶的CD谱。
用AVIV型号62ADS(HART SCIENTIFIC)和1mm电池，20℃测定实施例1中4个待检样品的CD谱。图中待检样品的序号1-4如下。待检样品序号转答氨酰胺酶缓冲液pH值转答氨酰胺酶1 天然型4.0 3.22mg/ml2 然型 5.8 3.203 基因高组型 0 1.814 基因高组型5.8 1.69图10表示实施例12中得到的基因重组型转谷氨酰胺酶的天然型及其结构形成过程中中间结构(状态)的CD(圆二色性)谱。
1.稀释后0-10分；2.稀释后10-60分；3.稀释后60-160分；4.稀释后170-270分；5.纯化基因重组型转谷氨酰胺酶。
图11表示实施例12中得到的基因重组型转谷氨酰胺酶的天然型及其结构形成过程中中间状态的CD谱。
1.纯化基因重组型转谷氨酰胺酶；2.将纯化基因重组型转谷氨酰胺酶调整到pH4.2，0.16M的尿素中；3.由变性状态稀释后，经过26小时。
图12表示对实施例13中得到的基因重组型转谷氨酰胺酶的天然型及其结构形成过程中中间结构(状态)进行凝胶过滤分析的色谱图。
图13表示对实施例16中得到的基因重组型转谷氨酰胺酶的天然型及其结构形成过程中中间状态进行非变性PAGE的结果图。
1.纯化基因重组型转谷氨酰胺酶；2.由变性状态稀释后，经过26小时；3.将纯化基因重组型转谷氨酰胺酶调整到pH4.2，0.16M的尿素中；4.与3相同。
最佳实施状态以下通过制备例和实施例对本发明进行具体说明。
(初始物质的制备)将编码微生物来源的转谷氨酰胺酶的DNA导入大肠杆菌中，用2×YT培养基培养大肠杆菌，微生物来源的转谷氨酰胺酶以不溶性颗粒蓄积在细菌体内，将之作为初始物质使用均如下制备。其详细内容记载于本申请者以前的发明特愿平10-181951号、平成10年6月29日申请，特开平11-075876号公报(平成11年3月23日)(说明书等)中，本说明书中引入其说明书中的内容作为参考。
因为MTG在菌体内以不溶性颗粒的形式蓄积，所以包含在如下菌体破碎液的离心沉淀部分中，在以后的实施例中，将该离心沉淀部分作为颗粒应用。该颗粒不显示转谷氨酰胺酶活性。大肠杆菌中MTG的大量表达<1>MTG表达质粒pTRPMTG-01的构建考虑到大肠杆菌和酵母密码子的使用频度，已经全部合成了MTG基因(参照特开平5-199883号公报)。但是，该基因序列没有在大肠杆菌中表达最适宜的元件。也就是说，存在的30个精氨酸残基的密码子均是单一的密码子AGA。于是，首先，再合成最适于在大肠杆菌中表达的从MTG N末端开始的200个碱基。
转录MTG基因的启动子应用trp启动子，它在培养基中缺乏色氨酸时容易诱导转录。高表达マグィ转谷氨酰胺酶(TG)基因的质粒pTTG2-22(参照特开平6-225775号公报)使用trp启动子，マグィTG基因上游的序列按异种蛋白在大肠杆菌中高表达的要求设计。
质粒质粒pTRPMTG-01的构建是如图1所示的那样在マグィTG表达质粒pTTG2-22(参照特开平6-225775号公报)的trp启动子下游，从ClaI/HpaI部位到BgIII部分置换成合成DNA基因的ClaI/HpaI片段和pGEM15BTG(参照特开平6-30771)的HpaI/BamHI片段(小)。
合成DNA基因的ClaI/HpaI片段，是从pTTG2-22的trp启动子下游ClaI部位开始到翻译起始密码子结束的序列和具有MTG基因从N末端开始的216个碱基的基因序列。关于MTG结构基因部分，要参考大肠杆菌的密码子使用频度，使之最适于在大肠杆菌中表达，这样来确定碱基序列。但为了去除mRNA形成高级结构的能力，所以将编码N末端部分区域中的缩合密码子的3个字母变换成富含腺嘌呤、尿嘧啶，尽可能不要联用相同的碱基。
合成DNA基因的ClaI/HpaI片段，设计成N末端有EcoRI、HindIII位点。设计的基因其+链和-链间相互重叠的大约40-50个碱基，合成12条相当于各个序列的DNA(序列表中序号2-13)。将该合成的DNA的5’端磷酸化，与配对的合成的DNA退火后，连接。然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切出大的目的DNA，重组到pUC19的EcoRI/HindIII部位。验证碱基序列，将正确的命名为pUCN216。从该pUCN216中切出ClaI/HpaI片段(小)，用于构建pTRPMTG-01。
(2>MTG表达质粒pTRPMTG-02的构建由于保持有pTRPMTG-01的大肠杆菌JM109不能高表达MTG，所以将MTG基因N末端改变了的部分以外的部分(777个碱基)也改变用于大肠杆菌。由于一次合成777个碱基较难，所以参考大肠杆菌的密码子使用频度确定碱基序列后，每次200个碱基分4批(B1，2，3，4)合成。设计每批的末端保持EcoRI、HindIII。设计的基因，其+链和-链间相互重叠的大约40-50个碱基，每批合成10条相当于各序列的DNA，共合成40条(序列表中序号14-53)。将该合成的DNA的5’端磷酸化，与配对的合成的DNA退火后，连接。然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切出大的目的DNA，重组到pUC19的EcoRI/HindIII部位。验证碱基序列，将正确的分别命名为pUCB1，B2，B3，B4。然后如图2那样连接B1和B2，B3和B4，制作pUCB3-4。再由pTRPMTG-01、pUCN216、pUCB1-2、pUCB3-4构建pTRPMTG-02。存在于pTRPMTG-02上包含高表达MTG基因的碱基序列示于序列表序列号1中。
<3>MTG表达质粒pTRPMTG-02(+)、(-)的构建由于保持有pTRPMTG-02的大肠杆菌JM109不能高表达MTG，所以将质粒多拷贝化。将包含pTRPMTG-02 trp启动子的Eco0109I片段(小)平端化后，重组到多拷贝质粒pUC19的HincII部位，构建与lacZ的启动子和trp启动子的同一体(pUCTRPMTG-02(+))逆向的质粒(pUCTRPMTG-02(-))。
<4>MTG的表达用含有150μg/ml氨苄西林的3ml 2×YT培养基中培养pUCTRPMTG-02(+)、pUC19转化的大肠杆菌JM109，37℃振荡培养10小时(预培养)。向该培养液0.5ml中添加50ml含有150μg/ml氨苄西林的2×YT培养基，37℃振荡培养20小时。
从培养液中收集菌体，超声波破碎。该菌体破碎液的总组分、离心上清部分、离心沉淀部分在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的展开结果如图3所示。可以确证，pUCTRPMTG-02(+)/JM109的菌体破碎液的总组分、离心沉淀部分中与MTG的分子量相同的蛋白质高表达。另外，通过Wester blotting可以验证，该蛋白质与小鼠抗MTG抗体反应。该蛋白质的表达量为500-600mg/L。生产培养基中即便不加入3-β-吲哚丙烯酸也能看到显著高表达。
再者，用小鼠抗MTG抗体进行Wester blotting时，在离心上清部分中一点也没看到MTG表达，由此可以明白表达的MTG几乎全部形成不溶性蛋白质包含体。
<5>表达MTG的N末端氨基酸分析对表达MTG的蛋白质包含体N末端氨基酸残基进行分析，N末端序列约60％为甲硫氨酸残基，40％为甲酰甲硫氨酸残基。要除去相当于起始密码子的(甲酰)甲硫氨酸残基，需进行以下操作。
<6>MTG的N末端门冬酰胺残基的缺失以含有MTG N末端216个碱基的pUCN216为模板进行PCR，使相当于门冬酰胺残基的碱基序列缺失掉。pUCN216是包含MTG N末端ClaI-HpaI片段的大约216个bp克隆到pUC19的EcoRI/HindIII部位的质粒。pF01(序列表序列号54)、pR01(序列表序列号55)是持有载体中序列的引物，pDELD(序列表序列号56)是缺失了相当于Asp残基的碱基序列，pHd01(序列表序列号57)是将C变成G，产生HindIII位点。pF01、pDELD是正义引物，pR01、pHd01是反义引物。
首先，pF01和pHd01，pDELD和pR01组对，分别对pUCN216进行PCR，94℃30秒、55℃1分、72℃2分的条件下进行35个循环。用酚/氯仿抽提各PCR产物，然后用乙醇沉淀，溶解到100μl水中。
从各PCR产物中取1μl混合，94℃热变性10分钟，然后以pF01和pHd01引物对进行PCR，94℃30秒、55℃1分、72℃2分的条件下进行35个循环。
用酚/氯仿抽提第二次PCR产物，乙醇沉淀后，用HindIII、EcoRI处理，获得pUC19的亚克隆pUCN216D(图4)。验证所得pUCN216D的序列，是目的产物。
<7>门冬酰胺残基缺失质粒的构建将pUCN216D的EcoRI/PpaI片段(小)与pUCB1-2(MTG基因的HpaI/BglII片段亚克隆到pUC19的Ec0RI/HindIII部位的质粒〕的Eco0109I/HpaI片段(大)结合，构成pUCNB1-2D。再将pUCNB1-2D的ClaI/BglII片段(小)与MTG高表达质粒pUCTRPMTG-02(+)DClaI/BglII片段(大)结合，形成门冬酰胺残基缺失的MTG表达质粒pUCTRPMTG(+)D2(图5)。结果如图6所示，得到包含缺失相当于门冬酰胺残基GAT的MTG基因的质粒。
<8>缺失门冬酰胺残基的MTG的表达用含有150μg/ml氨苄西林的3ml 2×YT培养基中培养pUCTRPMTG(+)D2转化的大肠杆菌JM109，37℃振荡培养10小时(预培养)。向该培养液0.5ml中添加50ml含有150μg/ml氨苄西林的2×YT培养基，37℃振荡培养20小时。将菌体超声波破碎后，取其破碎液的上清部分和沉淀部分，从SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后考马斯亮兰染色和用小鼠抗MTG抗体进行Western blotting的结果来看，在超声波破碎后的沉淀部分，即不溶性部分中可检测到缺失门冬酰胺残基的MTG蛋白质。这提示缺失门冬酰胺残基的MTG蛋白质以蛋白质包含体的形式蓄积在菌体内。
对该蛋白质包含体的N末端氨基酸序列进行分析，如图7所示，N末端的序列大约90％为丝氨酸。
比较<5>和<8>中得到的表达MTG的N末端氨基酸序列结果，由表1可以看出，通过使MTG的N末端缺失门冬酰胺残基，可有效除去表达MTG的N末端附加的起始密码子甲硫氨酸。
表1
N.D.未检测(实施例1)用象前面所讲初始物质制备例中那样制备的颗粒(上述离心沉淀部分)来制备颗粒悬浮液(1mMEDTA)，添加终浓度为8M的尿素，再添加20mM DTT之后，用20mM磷酸缓冲液调整pH值到7.5，37℃搅拌2小时，进行抽提，作为变性酶液。用前述的逆相HPLC测定该变性酶液的含量后，分成小分，-80℃冻存，直到以后实验中应用。
向该变性酶溶液(酶浓度约50mg/ml)中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将0.25ml注入到50ml预先5℃冷却的稀释用缓冲液(含2mM DTT的20mM醋酸钠，pH4.0)中，搅拌使之均匀。此时，反应条件为变性酶浓度0.2mg/ml，尿素浓度0.04M。按文献(Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，61，830-835，1997)中记载的方法求出反应溶液中的酶活性(比活性)为19.4U/mg。5℃继续搅拌30分钟，然后滴入4M氢氧化钠使pH值增加到6.0，离心，得到上清。所得酶活性上升到pH值上升前的1.5倍，达到29.0U/mg，几乎与微生物来源的天然状态转谷氨酰胺酶一致。从变性酶开始的蛋白质回收率为53.6％。
维持以上的重折叠反应条件，将实验的规模提高10倍，用500缓冲液稀释，pH值上升到6.0以后，离心，得到上清。该酶的比活性为33.7U/mg，从变性酶液开始的蛋白质回收率为41.9％。将所得酶液通过阳离子交换色谱，应用(1)逆相HPLC(参照图8)，(2)CD谱(参照图9)，和(3)示差扫描热量计(DSC)，比较所得纯化酶的性状与微生物来源的天然状态转谷氨酰胺酶的性状，可以看到二者基本上没差异。
(实施例2)向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为0.2mg/ml。将6ml该变性酶溶液过用含2mM DTT的20mM醋酸钠，pH4.0缓冲液平衡过的Sephadex-G25M柱(1.6φ×15cm，Pharmacia)，用相同的缓冲液展开。以280nm波长的UV吸收为指标回收级分。层析在室温进行。将回收级分于5℃冷却30分钟以上，向其中滴入4M氢氧化钠使pH值增加到6.0，离心，得到上清。该酶的比活性为23.4U/mg，从变性酶液开始的蛋白质回收率为39.8％，酶的比活性、蛋白质回收率比实施例1中得到的有所降低。
(实施例3)向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为0.2mg/ml。将1ml该变性酶溶液装入透析袋(Spectra/Por membrance，Nol；Spectrum MedicalInduatries，Inc.)，在1000ml缓冲液(含2mM DTT的20mM醋酸钠，pH4.0)中5℃透析过夜。向所得透析内液中滴入4M氢氧化钠使pH值增加到6.0，离心，得到上清。该酶的比活性为31.1U/mg，从变性酶液开始的蛋白质回收率为42.6％，比实施例1中得到的有所降低。
(实施例4)向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为6.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH6.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将0.25ml注入到50ml预先5℃冷却的稀释用缓冲液(含2mM DTT的20mM醋酸钠，pH6.0)中，搅拌使之均匀。此时，反应条件为变性酶浓度0.2mg/ml，尿素浓度0.04M。5℃继续搅拌30分钟，离心得到上清。上清中一点也没检测到蛋白质，会合聚集用于重折叠的变性酶。
再向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入4M氢氧化钠使pH值增加到9.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH9.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将0.25ml注入到50ml预先5℃冷却的稀释用缓冲液(含2mMDTT的20mM醋酸钠，pH9.0)中，搅拌使之均匀。此时，蛋白质回收率为18.9％，检测不到酶活性。继续滴入浓盐酸，将pH降到6.0，离心得到上清。上清中一点也没检测到蛋白质，会合聚集用于重折叠的变性酶。
以上结果与实施例1的有效性均提示进行稀释操作时pH值必需保持酸性条件。
(实施例5)向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将0.25ml注入到50ml预先5℃冷却的稀释用缓冲液(含2mM DTT的20mM醋酸钠，pH4.0)中，搅拌使之均匀。5℃继续搅拌30分钟，再注入0.25ml pH4.0的变性酶溶液(40mg/ml)，稀释之。这样的操作重复2次，共分4次稀释，结果最终的反应条件为变性酶浓度0.78mg/ml，尿素浓度0.16M。5℃继续搅拌30分钟，滴入4M氢氧化钠使pH值增加到6.0，离心得到上清。所得酶的比活性为32.8U/mg，从变性酶液开始的蛋白质回收率为59.0％。稀释操作不分次进行，将1ml变性酶溶液(pH4.0，40mg/ml)一次进行稀释时，所得上清的比活性相同(32.8U/mg)，但蛋白质回收率比分4次稀释时降低3％，得到56％。
(实施例6)向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将0.25ml注入到50ml预先5℃冷却的稀释用缓冲液(含2mMDTT的20mM醋酸钠，pH4.0)中，搅拌使之均匀。5℃继续搅拌30分钟，向其中添加1mM CaCl2，再5℃搅拌30分钟。此时，反应条件为变性酶浓度0.2mg/ml，尿素浓度0.04M，CaCl21mM。然后，滴入4M氢氧化钠使pH值增加到6.0，离心得到上清。所得酶的比活性为30.0U/mg，从变性酶液开始的蛋白质回收率为60.1％。以不添加CaCl2时同时进行的重折叠作为对照，所得酶的比活性为31.7U/mg，从变性酶液开始的蛋白质回收率为51.3％，相差大约9％，由此确证在pH值增加到6.0以前添加CaCl2的效果。另一方面，预先向稀释用缓冲液中添加1mM CaCl2时，比活性为25.3U/mg，蛋白质回收率为53.2％，与pH值上升前添加相比有些降低。
(实施例7)向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml.将0.25ml注入到50ml预先5℃冷却的稀释用缓冲液(含2mMDTT的20mM醋酸钠，pH4.0)中，搅拌使之均匀。5℃继续搅拌30分钟，向其中添加0.1mM StCl2，再5℃搅拌30分钟。此时，反应条件为变性酶浓度0.2mg/ml，尿素浓度0.04M，StCl20.1mM。然后，滴入4M氢氧化钠使pH值增加到6.0，离心得到上清。所得酶的比活性为27.3U/mg，从变性酶液开始的蛋白质回收率为84.5％。比实施例1的蛋白回收率(53.6％)有大幅度上升。
(实施例8)向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将0.25ml注入到50ml预先5℃冷却的稀释用缓冲液(含2mM DTT的20mM醋酸钠，pH4.0)中，搅拌使之均匀。5℃继续搅拌30分钟，向其中添加10mM表面活性剂CHAPS(3-[(3-胆胺异丙基)二甲基-氨基]-2-羟基-1-丙磺酸)，再5℃搅拌30分钟。此时，反应条件为变性酶浓度0.2mg/ml，尿素浓度0.04M，CHAPS 10mM。然后，滴入4M氢氧化钠使pH值增加到6.0，离心得到上清。所得酶的比活性为29.3U/mg，从变性酶液开始的蛋白质回收率为93.0％。比实施例1的蛋白回收率(53.6％)有大幅度上升。
(实施例9)向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将0.2ml注入到10ml预先5℃冷却的稀释用缓冲液(含2mMDTT的20mM醋酸钠，pH4.0)中，搅拌使之均匀。5℃边搅拌边在30秒、5分、及0.5、1.0、1.5、2.0、3.0及17小时后分别取样，滴入4M氢氧化钠使pH值转换到6.0，离心取上清。所得上清中酶的比活性及从变性酶溶液开始到获得上清的蛋白质回收率与取样时间间的关系如表2所示。结果，稀释后直接转换pH值的比活性低，随着取样时间的延长，pH值转换后上清中的比活性增高，1.5小时以上时可达30U/mg。由于经pH4.0的稀释所形成的中间结构(状态)获得适于重折叠的结构状态，所以更优选1.5小时以上的时间。
表2
(实施例10)向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将0.2ml注入到10ml预先5℃冷却的各种pH值的稀释用缓冲液(含2mMDTT的20mM醋酸钠，pH3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、5.0、5.5)中，搅拌使之均匀。5℃继续搅拌2小时，然后滴入4M氢氧化钠使pH值转换到6.0，离心取上清。所得上清中酶的比活性及从变性酶溶液开始到获得上清的蛋白质回收率与稀释时的pH间的关系如表3所示。结果，pH4.0和4.2时比活性和蛋白质回收率最高。
表3
(实施例11)向与实施例1同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM醋酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将147ml注入到7350ml预先5℃冷却的稀释用缓冲液(含2mM DTT的20mM醋酸钠，pH4.1)中，搅拌使之均匀。5℃继续搅拌2小时，然后滴入4M氢氧化钠使pH值转换到6.0，倾析并离心取上清。所得上清中酶的比活性为30.7U/mg，从变性酶溶液开始到获得上清的蛋白质回收率为66.5％。通过超滤(截断分子量10kDa)将该上清浓缩为750ml，用平衡阳离子交换色谱的缓冲液(20mM醋酸钠，pH5.8)稀释10倍。然后，过经同一缓冲液充分平衡过的阳离子交换柱(CM SepharoseFF，11.3φ×10cm，ァマシャム·ファルマシァ·バィオテク社制)。用同一缓冲液再平衡后，以280nm波长的UV吸收为指标，用0-0.3M的NaCl线性浓度梯度进行洗脱，回收蛋白质级分(500ml)。层析在室温进行。通过该操作可除去菌体来源的非目标性杂质物。
将回收级分的半量(250ml)过凝胶过滤柱(SepharoseG-25M，14φ×15cm，ァマシャム·ファルマシァ·バィオテク社制)，该柱用含2mM DTT的20mM醋酸钠缓冲液，pH6.0平衡过，用同一缓冲液展开。以280nm波长的UV吸收为指标，回收蛋白质级分(380ml)。层析在室温进行。所得蛋白质级分的比活性为29.4U/mg(约0.75g)。将该级分调整为1.2mg/ml，分成小份，-80℃冻存。以后，将该保存的样品称为“纯化基因重组型转谷氨酰胺酶”。
另一方面，将上述阳离子交换色谱中残余的另一半回收级分(250ml)过上述用含2mM DTT的10mM醋酸钠缓冲液，pH6.0平衡过的凝胶过滤柱，用同一缓冲液展开。以280nm波长的UV吸收为指标，回收蛋白质级分(380ml)。层析在室温进行。用前述的超滤将所得蛋白质级分的总量浓缩到122ml。将醋酸铵的浓度调整为50mM，-80℃冷冻，进行冷冻干燥，得到大约0.75g干粉。以后，将该干粉称为“纯化基因重组型转谷氨酰胺酶干粉”。
(实施例12)应用实施例11中得到的纯化基因重组型转谷氨酰胺酶干粉，研究结构形成的中间结构(状态)的物理化学性质。将该干粉溶解到1mMEDTA水溶液中，添加尿素、DTT和磷酸钠，使其终浓度分别为8M、20mM和20mM，调pH为7.5。将之37℃孵育2小时，向其中滴入浓盐酸，调pH为4.0。用含8M尿素和20mM DTT的20mM磷酸钠，pH4.0稀释之，将变性酶浓度调整为40mg/ml。分成小份，-80℃冻存，备用。将该变性酶液融解后，向0.2ml中注入10ml稀释用缓冲液(含2mMDTT的20mM醋酸钠，pH4.0〕，搅拌均匀。其后，随时间变化测定其近UV光谱。测定时使用JascoJ-715spetropolarimeter，比色杯在近UV区选用1cm通道，在远UV区选用0.1cm的通道。测定在室温进行，波长扫描率为10nm/min。所得数据变换成每1摩尔氨基酸的CD(圆二色性)。图10是近UV的CD(圆二色性)谱。0-10min是1次扫描的数据，10-60min是5次扫描的平均数据，60-160min和170-270min是10次扫描的平均数据。由该结果可以看出，直接稀释后几乎没有高级结构形成，其后缓慢进行结构形成。60-160min和170-270min几乎显示同一波谱，这表明在近UV-CD观察到的高级结构形成延续到160min才结束。稀释后即使经过26小时(h)，在60-160min所形成的结构一点也没变化。
同时向实施例11中得到的纯化基因重组型转谷氨酰胺酶中添加尿素和磷酸钠，最终调整为含0.16M尿素和2mM DTT的20mM醋酸钠、pH4.2，静置24小时，使之在同一缓冲液中形成充分稳定的结构后，同样测定CD谱，与天然状态的比较。结果如图11所示。即便在0.16M尿素，pH4.2中，该酶也没失去天然结构(状态)。另一方面，从变性状态通过稀释而形成的结构状态(稀释后26小时)与同一缓冲液中该酶的结构状态(天然状态)有明显差异，这表明变性→稀释操作(重折叠)中形成的结构状态是与天然状态不同的“中间状态”，但稀释后状态慢慢产生变化。
由以上可以看出，近紫外区尤其是260-290nm的CD谱中，中间状态相对于天然状态的分子椭圆率为30-70％。
(实施例13)向与实施例12同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM磷酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将该溶液0.2ml注入到10ml稀释用缓冲液(含2mMDTT的20mM醋酸钠，pH4.0)中，搅拌使之均匀。为了研究稀释后结构状态的变化过程，用Superdex 75 HR10/30进行凝胶过滤分析。缓冲液用包含0.02％Tween 20的0.1M硫酸钠，pH4.0，流速0.8ml/min。随时间变化(2、10、30、60、100、160、260分及1日)分析稀释后的样品100μg。直接稀释后(2分)，检测到比天然结构(状态)下该酶的峰洗脱时间早4分钟出现的峰，与稀释后的时间经过一起，洗脱时间发生变化，这表明结构状态(大分子状态)在稀释后继续变化。
另一方面，将在实施例11中获得的纯化基因重组型转谷氨酰胺酶在含0.16M尿素和2mM DTT的20mM醋酸钠、pH4.0中透析24小时，在稀释用缓冲液中形成充分稳定的结构后进行同样地分析(参照图12)。峰的洗脱时间与天然状态的无变化，该酶在0.16M尿素pH4.0的条件下没有丧失天然状态。通过稀释形成的结构在经过足够的时间后，其峰的洗脱时间与天然状态的一致，但峰形依然有明显的差异。这表明通过稀释形成的中间状态随时间的变化其构造状态也发生变化，最终没达到与天然状态同样的结构，保留在结构形成中的中间状态。
(实施例14)向与实施例12同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM磷酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为15mg/ml。将该溶液0.2ml注入到10ml稀释用缓冲液(含2mM DTT的20mM醋酸钠，pH4.0)中，搅拌使之均匀。测定该溶液在280nm处激发的Trp荧光的λmax随时间的变化(30秒及0.5、1、1.5和2小时)。从刚稀释后(30秒)开始，观察λmax转蓝(351.5→344nm)随时间的变化，显示结构慢慢紧凑化(结构形成进行)的过程。稀释后即便经过足够的时间，λmax与天然状态的(340.0nm)也不一致，这表明通过稀释而形成的结构状态与天然状态有明显的差异。
另一方面，将在实施例11中获得的纯化基因重组型转谷氨酰胺酶在含0.16M尿素和2mMDTT的20mM醋酸钠、pH4.0中透析24小时，在稀释用缓冲液中形成充分稳定的结构后，同样进行Trp荧光的λmax测定时，λmax与天然状态的没有变化，这表明该酶在0.16M尿素pH4.0的条件下能够维持天然结构(状态)(参照表4)。这些结果表明，通过稀释形成的中间状态随时间的变化其构造状态也发生变化，最终没达到与天然状态同样的结构，保留在结构形成中的中间状态。
表4
(实施例15)向与实施例12同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM磷酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为15mg/ml。将该溶液0.2ml和ANS(8-苯胺萘-1-磺酸，终浓度20μM)注入到10ml稀释用缓冲液(含2mM DTT的20mM醋酸钠，pH4.2)中，搅拌使之均匀。其后，在激发波长400nm、荧光波长470nm处测定ANS荧光强度随时间的变化(1分，0.5、1、1.5、2小时)，结果如表5所示。结果是，从刚稀释后(1分)开始到2小时，可观察到随时间的变化，荧光强度降低(1387→974)，这显示了蛋白质表面露出的疏水性区域慢慢消失的过程。但是稀释后即便经过足够的时间，ANS荧光强度也降不到天然状态的荧光强度，这表明通过稀释而形成的结构状态与天然状态有明显的差异。
另一方面，将在实施例11中获得的纯化基因重组型转谷氨酰胺酶在含0.16M尿素和2mM DTT的20mM醋酸钠、pH4.0中透析24小时，在稀释用缓冲液中形成充分稳定的结构后，同样进行ANS荧光强度测定时，与天然状态比较荧光强度有若干上升，其变化不大(56→162)，这表明该酶在0.16M尿素pH4.0的条件下能够维持天然状态。这些结果表明，通过稀释形成的中间状态随时间的变化其构造状态也发生变化，最终没达到与天然状态同样的结构，保留在结构形成中的中间状态。
表5
(实施例16)向与实施例12同样制备的变性酶溶液中滴入浓盐酸，调整pH为4.0。用含8M尿素和20mM二硫苏糖醇(DTT)的20mM磷酸钠，pH4.0将之稀释，将变性酶溶液的浓度调整为40mg/ml。将该溶液0.2ml注入到10ml稀释用缓冲液(含2mM DTT的20mM醋酸钠，pH4.0)中，搅拌使之均匀，进行非变性PAGE。用市售的NuPAGE Tris-Acetate 7％胶(Novex)，His-Mes pH6.1缓冲液系统进行电泳。结果如图13所示。稀释后该酶的迁移率与天然状态的有明显差异，这表明通过稀释而形成的结构状态与天然状态有差异。
同时，将在实施例11中获得的纯化基因重组型转谷氨酰胺酶中添加尿素和醋酸钠溶液，最终调整为含0.16M尿素和2mMDTT的20mM醋酸钠、pH4.0，同样进行非变性PAGE。溶剂变化前后迁移率没有变化，这表明该酶在0.16M尿素pH4.0的条件下能够维持天然状态。
实施例11-16所示的结果显示(1)水性溶剂中，酸性条件下，用变性剂稀释而形成的结构状态是复杂的化合物；(2)其状态是随时间变化的；(3)最终保留到与天然结构不同的“中间状态”。再者，实施例9和10(4)优选适当设定稀释条件，通过诱导中间状态，可提高向天然状态的回收率。
发明效果根据本发明中使用的上述重折叠方法，可工业化将由基因重组微生物生产的变性状态的酶与天然状态的转谷氨酰胺酶基本上具有同等酶活性，即具有转谷氨酰胺酶活性的高纯度的转谷氨酰胺酶。且无需特殊纯化，可直接与天然状态的转谷氨酰胺酶同样广泛使用于食品等各种领域。
尤其是，通过在酸性溶液中稀释，优选将pH保持在一定状态下进行稀释处理后调整到中性范围，制备出具有有效促进从变性状态的转谷氨酰胺酶，经过上述结构形成的中间结构，到目的高级结构形成这样酶活性的酶。
还提供具有形成上述结构的中间结构的中间体。
权利要求
1.具有酶活性的转谷氨酰胺酶的制备方法，其特征在于将变性状态的转谷氨酰胺酶付诸至少包含下述工序(a)和(b)的工序(a)将该变性状态的酶形成中间结构的工序，所述的中间结构是形成在水性溶剂中、酸性条件下具有酶活性的结构的中间结构；以及(b)将已经形成可形成上述结构的中间结构的酶形成高级结构的工序，所述的高级结构是在水性溶剂中、pH值中性范围内具有酶活性的高级结构。
2.权利要求1的方法，其中工序(a)中在该酶分子内半胱氨酸残基的巯基是游离的，在形成在水性溶剂中，酸性条件下具有酶活性的结构的中间结构时，在溶解状态下将该酶在酸性条件下稀释。
3.权利要求1的方法，其中工序(b)中的水性溶剂包含形成具有酶活性的高级结构的促进剂。
4.权利要求1的方法，在工序(b)之后包含工序(c)，即会合该酶中无活性的酶，作为凝集物进行分离的工序。
5.权利要求1的方法，其中工序(a)中，将该酶溶解到水性溶剂中，其中工序(b)中的中性范围是指将工序(a)中得到的酶溶液的pH值上升到中性范围。
6.权利要求2的方法，其中工序(a)中将变性状态的酶的酸性溶液稀释成酸性时，在15℃以下的低温下进行稀释，所稀释的蛋白质浓度不到10mg/ml。
7.权利要求1的方法，其中工序(a)中的水性溶剂包含蛋白质变性剂。
8.权利要求1的方法，其中形成所述结构的中间结构在近紫外区域的CD谱相对于天然状态的有30-70％的分子椭圆率。
9.具有酶活性的转谷氨酰胺酶的制备方法，其特征在于，将变性状态的转谷氨酰胺酶在水性溶剂中酸性条件下溶解，其后将该酶溶液调整到中性范围，生成具有酶活性的酶。
10.通过将变性状态的转谷氨酰胺酶置于水性溶剂中酸性条件下，可得到具有以下(d)-(g)所示特征的蛋白质(d)用异羟肟酸方法对转谷氨酰胺酶进行活性测定，它具有15-25U/mg的比活性；(e)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，分子为36000-40000；(f)近紫外区域的CD谱相对于天然状态的有30-70％的分子椭圆率；以及(g)用His-Mes、pH6.1的缓冲液系统进行非不变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移比天然状态的慢。
全文摘要
通过包括至少下述工序(a)和(b)的工序将变性状态的转谷氨酰胺酶制备为具有酶活性的转谷氨酰胺酶:(a)将该变性状态的酶形成中间结构的工序,所述的中间结构是形成在水性溶剂中、酸性条件下具有酶活性的结构的中间结构;以及(b)将已经形成上述结构形成的中间结构的酶形成高级结构的工序,所述的高级结构是在水性溶剂中、pH值中性范围内具有酶活性的高级结构。因此能有效地对基因重组微生物生产的变性状态的转谷氨酰胺酶进行重折叠,使之与天然状态的转谷氨酰胺酶基本上具有同等酶活性,即能够工业性制备具有转谷氨酰胺酶活性的高纯度的转谷氨酰胺酶。还提供形成上述结构的中间结构的中间体。
文档编号C12N9/10GK1334867SQ99816257
公开日2002年2月6日 申请日期1999年12月24日 优先权日1998年12月28日
发明者横山敬一, 小野邦夫, 江岛大辅 申请人:味之素株式会社 被以下专利引用 (1),