将dna固定在载体上的方法

专利名称：将dna固定在载体上的方法
技术领域：
本发明涉及将DNA固定在固体支持物上的方法，该方法可用于制备DNA微阵列等。本发明还涉及按照所述方法将DNA固定其上的材料以及用所述材料检测靶核酸的方法。
背景技术：
随着分析包括人类在内的生物体基因组计划的进展，逐渐阐明了各种生物基因组的结构。同时，为了利用关于基因组的大量信息开发药物、或者保持或改善健康，分析基因组功能的技术也得到发展。为此，DNA芯片技术成为引人瞩目的主要技术之一。DNA芯片是一种微阵列(DNA阵列)，其中许多不同基因或DNA片段排列并固定在固体支持物例如载玻片上。DNA芯片作为极大地加快分析基因的表达、突变或多态性的手段非常有用。
为了制备DNA芯片，必需将DNA固定在支持物上。固定DNA的已知方法一般分为两类。
一类方法是其中DNA在通过共价键与支持物连接的接头顶端上化学合成的，例如见Science，251767-773(1991)和Nucleic AcidsResearch，201679-1684(1992)所述。这样的方法可用于固定可合成而且其序列已知的DNA(寡核苷酸)。据认为，该方法每个步骤的产率比常规固相合成低。此外，所述方法需要完全密封反应部位的微型装置。
另一类方法是其中例如按照Sceince，270467-470(1995)和Nucleic Acids Research，225456-5465(1994)所述，预先合成的DNA或聚合酶链式反应(PCR)制备的DNA(PCR扩增产物)通过共价键或非共价键(或静电)与支持物结合。据推测，按照这样的方法人们可固定任何DNA。但是例如在非共价键结合的情况下，难以固定短链DNA(寡核苷酸)，例如合成DNA。如果需要把长链DNA如PCR产物通过非共价键固定在支持物上，一般如下固定所述DNA使溶解于盐溶液如氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、tris-盐酸盐/EDTA(TE)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)的DNA变性，然后将其点样到用聚阳离子如聚赖氨酸或聚乙二胺包被的载玻片(支持物)上。在这种情况下，已知在随后的洗涤或与靶核酸杂交的步骤中，大量DNA脱离支持物。这一现象是降低检测靶核酸的敏感性的一个因素。
为了提高与支持物的固定效率，必需预先热变性或碱变性DNA。已知在不变性的情况下固定效率明显降低。此外，如果采用制备DNA芯片的仪器(阵列仪)将许多DNA溶液固定在载玻片上，则变性步骤使整个步骤复杂化，导致所述方法难以自动化。
通过增加需要点样到固定DNA的支持物上的溶液DNA浓度，从而增加固定DNA的绝对量。然而，因此减少对支持物的固定率，并增加所用DNA的损失。
使用制备DNA芯片的仪器(阵列仪)时，用于制备DNA阵列的DNA溶液点样体积可小于1nl。因此，某一DNA溶液在支持物表面上散开之前就可能干了，导致形成不均一斑点。
另外，如果是通过共价键结合，则必需预先在DNA中导入合适官能团。而导入官能团的方法是复杂的。
如果采用DNA芯片等检测靶核酸，则检测敏感性取决于固定在单位面积(或一个斑点)中的DNA量。因此，增加固定在斑点上的DNA量的方法，换句话说，增加固定DNA的密度的方法成为非常重要的问题。而且，点样DNA溶液同时使其均一分散的方法也非常重要。
发明目的本发明的主要目的是提供(1)将DNA固定在固体支持物上的有效方法；(2)按照所述方法制备的DNA固定在其上的材料；和(3)采用所述材料检测靶核酸的方法。发明概述本发明人进行了深入的研究而且发现，可明显增加斑点区域或单位面积的固定DNA量，其中将DNA溶解于包含至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质的缓冲液中，然后将其点样在支持物上。本发明人还发现，通过在所述缓冲液中加入表面活性剂可将DNA溶液点样在支持物上，同时使其均匀分散在所述支持物表面。本发明人进一步发现，通过应用所述固定技术可增加DNA固定率以及增加单位面积的DNA固定密度，因而可增加在严格条件下通过杂交检测靶核酸的敏感性。本发明人通过组合这些技术而创建了检测靶核酸的优良方法。从而完成了本发明。
因此，本发明提供以下方法和材料(1)将DNA固定在支持物上的方法，该方法包括使DNA与支持物在包含至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质的缓冲液中接触；(2)按照上述(1)的方法，其中所述吗啉衍生物是C1-3烷基取代的N-烷基吗啉；(3)按照上述(1)的方法，其中所述吗啉盐或吗啉衍生物是一种盐，它选自与无机酸的盐、与有机酸的盐和与脂肪酸的盐；(4)按照上述(1)的方法，其中所述碳酸盐是一种选自钠盐、钾盐、镁盐、铵盐和三乙胺盐的盐；(5)按照上述(1)的方法，其中所述缓冲液含有至少一种选自吗啉、吗啉衍生物及其盐的物质和至少一种碳酸盐；(6)按照上述(1)-(5)任一项的方法，其中所述缓冲液的pH为7-11；(7)按照上述(1)-(6)任一项的方法，其中所述缓冲液中至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质的浓度为10-500mM；
(8)按照上述(1)-(7)任一项的方法，其中所述DNA为寡核苷酸、多核苷酸或其衍生物；(9)按照上述(1)-(8)任一项的方法，其中所述缓冲液中的DNA浓度为0.1-2.0mg/ml；(10)按照上述(1)-(9)任一项的方法，其中所述缓冲液还含有至少一种盐；(11)按照上述(1)-(10)任一项的方法，其中所述缓冲液还含有至少一种表面活性剂；(12)按照上述(1)-(11)任一项的方法，其中所述支持物由玻璃或石英制成，或者为通过处理玻璃或石英表面制得的一种材料；(13)按照上述(12)的方法，其中用硅烷偶联剂或聚阳离子处理所述表面；(14)按照上述(1)-(13)任一项的方法，其中在不变性的情况下固定所述DNA；(15)按照上述(14)的方法，其中所述DNA为双链DNA；(16)将DNA固定在支持物上的方法，该方法包括使DNA和支持物在包含至少一种表面活性剂的缓冲液中接触；(17)按照上述(16)的方法，其中所述表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂；(18)按照上述(17)的方法，其中所述表面活性剂选自蔗糖单葵酸酯、蔗糖单月桂酸酯和毛地黄皂苷；(19)按照上述(16)-(18)任一项的方法，其中所述缓冲液中含有至少一种选自以下的物质吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐；(20)按照上述(19)的方法，其中所述缓冲液的pH为7-11；(21)按照上述(19)或(20)的方法，其中所述缓冲液中至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质的浓度为10-500mM；(22)按照上述(16)-(21)任一项的方法，其中所述DNA为寡核苷酸、多核苷酸或其衍生物；
(23)按照上述(16)-(22)任一项的方法，其中所述缓冲液中的DNA浓度为0.1-2.0mg/ml；(24)按照上述(16)-(23)任一项的方法，其中所述缓冲液还包括至少一种盐；(25)按照上述(16)-(24)任一项的方法，其中所述支持物由玻璃或石英制成，或者为一种通过处理玻璃或石英表面制得的材料；(26)按照上述(25)的方法，其中用硅烷偶联剂或聚阳离子处理所述表面；(27)按照上述(16)-(26)任一项的方法，其中在不变性的情况下固定所述DNA；(28)按照上述(27)的方法，其中所述DNA为双链DNA；(29)DNA固定在其上的一种材料，它为按照上述(1)-(28)任一项定义的方法制得的材料；(30)按照上述(29)的材料，其中所述DNA为双链DNA；(31)一种检测靶核酸的方法，该方法包括采用上述(29)或(30)定义的DNA固定其上的材料检测靶核酸；(32)按照上述(31)的方法，包括在严格条件下使DNA固定其上的材料与所述靶核酸杂交；(33)按照上述(32)的方法，其中在不使所述固定DNA变性的严格条件下使固定在所述材料上的DNA与所述靶核酸杂交；(34)双链DNA固定在支持物上的一种材料，它可用于在不使所述固定DNA变性的严格条件下与靶核酸进行杂交；(35)用于固定DNA的缓冲液，它含有至少一种选自以下的物质吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐；(36)用于固定DNA的缓冲液，它含有至少一种表面活性剂；和(37)用于固定DNA的缓冲液，它含有至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质以及至少一种表面活性剂。附图简述

图1为阐明加入表面活性剂对点样的影响的图。
图2为阐明加入表面活性剂对点样的影响的图。本发明详述在本发明中包含至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质(下文简称为基本缓冲组分)的缓冲液可以是例如包含这样的基本缓冲组分的生化研究常规使用的缓冲液。
作为基本缓冲组分的吗啉、吗啉衍生物及其盐的实例包括但不限于吗啉、C1-3烷基取代的N-烷基吗啉(例如N-甲基吗啉、N-乙基吗啉或N-丙基吗啉)以及其与无机酸(例如盐酸或碳酸)、有机酸(例如乙酸、乳酸或柠檬酸)或脂肪酸(例如月桂酸或硬脂酸)的盐。
作为基本缓冲组分的碳酸盐包括但不限于碳酸与碱金属、碱土金属、铵或有机胺的盐，例如碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、碳酸铵或碳酸三乙胺。
这样的基本缓冲组分可单独使用，或者可联合使用2种或2种以上的组分。在一个实施方案中，联合使用吗啉、吗啉衍生物及其盐中的任意一种和任意一种碳酸盐。
在本发明中使用的缓冲液的pH调节为优选7-11、更优选8-10。
所述缓冲液的盐浓度优选为10-500mM、更优选50-200mM。
在本发明中，所述缓冲液除了上述基本缓冲组分之外还可含有其它盐，例如氯化钠。本发明的缓冲液可含有一种或多种表面活性剂。使用的表面活性剂不限于具体某一表面活性剂。可优选使用任何表面活性剂，前提是加入它可调节所述DNA溶液均匀分散在所述支持物表面上。
在另一实施方案中，本发明提供将DNA固定在支持物上的方法，该方法包括在含至少一种表面活性剂的缓冲液中使DNA与支持物接触。
在该方法中使用的表面活性剂不限于具体某一表面活性剂。可优选使用任何表面活性剂，前提是固定时加入它可调节所述DNA溶液均匀分散在所述支持物表面上。
根据其组成表面活性剂分为非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂等。在本发明中可使用它们中任何一种，前提是它们具有上述活性。例如在本发明中可使用以下表面活性剂。非离子表面活性剂Nonidet P-40、Triton X-100、Tween-20、n-辛基-β-D-葡萄糖苷、n-庚基-β-D-硫代葡萄糖苷、n-辛基-β-D-硫代葡萄糖苷、n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷、蔗糖单葵酸酯、蔗糖单月桂酸酯、毛地黄皂苷、庚酰基-N-甲基葡糖胺(glucamide)(MEGA-7)、辛酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-8)、壬酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-9)、葵酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-10)、N，N-二[3-D-葡萄糖氨基丙基(gluconamidopropyl)]胆胺(cholamide)(BIGCHAP)和N，N-二[3-D-葡萄糖氨基丙基]脱氧胆胺(脱氧-BIGCHAP)。阴离子表面活性剂脱氧胆酸、胆酸钠、Sarkosyl和十二烷基硫酸钠(SDS)。两性表面活性剂3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲基铵(ammonio)]-1-丙磺酸盐(CHAPS)和3-[3-(胆酰胺基)二甲基铵]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)。在本发明中特别优选使用非离子表面活性剂。
以使DNA溶液均匀分散在支持物表面上的浓度范围使用所述表面活性剂。例如，尽管不是用它来限制本发明，但是可以0.001-0.1％终浓度使用所述表面活性剂。
在存在表面活性剂的情况下用于将DNA固定在支持物上的缓冲液不限于具体某一种缓冲液，前提是它适合用于固定。例如，优选使用含有至少一种选择吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质的缓冲液。可使用缓冲液中的缓冲组分的类型、浓度、pH等如上所述。根据需要固定的DNA和将使用的支持物可进行适当选择。
为了固定在支持物上，当采用溶解于含有上述表面活性剂的缓冲液中的DNA固定时，使DNA溶液均匀分散在支持物表面上，使得所形成斑点的分散减少。当将如上所述制备的DNA固定其上的材料用于检测靶核酸时，可获得比常规更可靠的定量数据。加入表面活性剂可增加固定在支持物上的DNA量，使得可以更高敏感性检测靶核酸。
本发明包括含有上述组分的用于固定DNA的缓冲液。
本文使用的DNA包括但不限于从细胞或组织中提取的多核苷酸、体外酶学合成的DNA如PCR扩增产物、化学合成寡核苷酸及其衍生物。所述DNA可以是单链或双链DNA。本文使用的寡核苷酸是指较短的DNA。尽管不是用来限制本发明，但是寡核苷酸表示6-100个碱基长度的DNA。本发明的寡核苷酸优选使用8-50个碱基长度的DNA。多核苷酸是指较本文所述寡核苷酸长的DNA。
所述衍生物不限于具体某一种衍生物，前提是它具有使得能够固定在支持物表面上的修饰。在5’末端具有导入的官能团如氨基或巯基的DNA为范例DNA。
固定在支持物上的本发明的DNA不限于具体某一种DNA，前提是它能够与靶核酸杂交。单链DNA和双链DNA二者均可优选使用。当使用双链DNA时，可在用合适方法变性为单链DNA后用于与靶核酸杂交。
固定DNA的浓度优选为0.05-5.0mg/ml、更优选0.1-2.0mg/ml。
用于固定DNA的本发明支持物不限于具体某一种支持物，前提是它由基本上不溶解的材料制成。这样的材料实例包括纸、尼龙、纤维素、诸如硝酸纤维素的纤维素衍生物、塑料和诸如聚碳酸酯、聚苯乙烯和聚丙烯的塑料衍生物、磁性金属或非磁性金属、石英和玻璃。所述材料可以是有孔、表面光滑、聚合或非聚合材料。
在本发明中使用的支持物不限于由所述材料构成的支持物。任何能够用作DNA芯片或生物传感器的载体的支持物均可使用，前提是它们能够保持DNA固定在所述支持物表面上。例如，可优选使用在其表面具有亲水或疏水官能团的支持物，所述官能团例如为羟基、氨基、巯基、醛基、表氧基、羧基或酰基。这样的官能团可以原样或者以合适的衍生物使用。例如如果为羧基，它可以诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯的活化酯衍生物使用。
所述支持物包括其表面具有作为支持物材料性质的官能团的支持物。
如果通过表面处理可使其表面具有亲水或疏水官能团，则可以没有限制地使用支持物表面没有亲水或疏水官能团的支持物。
通过表面处理制得的这样的支持物实例包括通过用市售硅烷偶联剂如氨基烷基硅烷、用聚阳离子如聚赖氨酸或聚乙二胺、或用氨基烷基硅烷和戊二醛处理石英或玻璃制得的支持物。可从Sigma市售获得具有导入如上所述官能团的载玻片。
下面详细描述将DNA固定在支持物上的本发明方法。
将需要固定的DNA原样或用碱变性或热变性后溶解在含有上述基本缓冲组分的缓冲液中。该缓冲液任选含有中性盐和/或表面活性剂。
利用微量进样器、微量分散器或制备DNA芯片的仪器将恒定体积的所制得的含所述DNA的缓冲液点样在支持物(例如载玻片)上。将DNA点样在其上的支持物在湿化的培养箱中温育例如1小时。然后通过紫外线照射使DNA交联。用0.2％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液洗涤支持物，然后用蒸馏水洗涤并干燥。
按照上述固定方法固定的DNA在洗涤或杂交步骤期间的脱离可较常规固定方法少。而且，使用所述固定方法可提高斑点区域或单位面积的DNA固定率。换句话说，可增加固定在单位面积的DNA密度。因此，与常规方法相比，采用具有按照上述方法固定的DNA的支持物，可提高检测靶核酸的敏感性。
此外，在本发明方法中不需要变性的情况下可进行固定，与变性固定相比，本发明方法的固定效率与其相同，对于常规方法而言点样前的变性是必不可少的。
如下可评价DNA与支持物的固定率将标记荧光物质(例如罗丹明)的DNA固定在支持物上，采用荧光成象分析仪如FMBIO II Multi-View(Takara Shuzo)检测支持物上的斑点发出的荧光强度。按照以下方程1可计算固定率。
方程1固定率(％)＝100×(固定并洗涤后支持物上的斑点荧光强度)/(固定后斑点的即时荧光强度)例如如下可测定固定DNA的密度。固定标记荧光物质(例如罗丹明)的DNA。可用荧光成象分析仪如FMBIO II Multi-View测量DNA固定在其中的斑点发出的荧光强度。根据所用的荧光标记DNA量和荧光强度制成的校准曲线可计算斑点中的固定DNA量。
例如采用荧光成象分析仪通过测量斑点面积，可测定固定在单位面积的DNA量，即固定DNA的密度。
或者，按照本发明DNA固定方法将预定量DNA溶液点样在支持物上，检测固定率。根据测得的固定率和点样的DNA量可计算固定DNA量。例如采用显微镜可测量所形成斑点面积。根据固定DNA量和如上所述测定的面积也可以确定固定的DNA密度。
本发明还包括如上所述制得的DNA固定其上的材料。
本发明也包括采用DNA固定其上的材料检测靶核酸的方法。在该方法中，使DNA固定其上的材料与靶核酸在严格条件下杂交。
本文使用的严格条件是指Molecular cloning，A laboratory manual，第二版，第9.47-9.51页(1989，Cold Spring Harbor Laboratory)所述的条件。例如在如下的严格条件下使作为DNA的寡核苷酸固定其上的材料与靶核酸杂交，不过所述条件可随许多因素而不同，其中包括靶核酸与固定DNA杂交的部分的碱基序列长度。根据杂交部分的长度计算Tm值。在高离子强度的溶液(例如6×SSC或6×SSPE)中，在低于计算Tm值20-25℃的温度下进行杂交。通常优选在低于Tm值12-20℃的温度下进行洗涤，同时改变随后洗涤步骤中的洗涤缓冲液的盐浓度。
对于非寡核苷酸的DNA即多核苷酸固定其上的材料而言，严格条件是指Molecular cloning，A laboratory manual，第二版，第9.52-9.55页(1989)所述的条件，例如使多核苷酸与靶核酸杂交，在没有限制的情况下于68℃洗涤。
靶核酸不限于具体某种核酸。例如可使用任何核酸作靶，筛选与固定在支持物上的DNA中的靶核酸杂交的DNA。
按照本发明，可使用没有变性DNA而使DNA固定其上的支持物，用于在不用变性的情况下进行杂交。
此外，本发明提供以下这样的材料其中双链DNA固定在支持物上，而且它可用于不用碱变性或热变性所述固定DNA、在严格条件下与靶核酸杂交。
按照如下方法可制备这样的材料其中包括点样溶解于例如吗啉缓冲液或碳酸盐缓冲液的双链DNA等步骤，但是不是用它来限制本发明。本发明包括其中双链DNA固定在支持物上而且可用于在不用变性的严格条件下与靶核酸杂交的所有材料。
因此，采用将DNA固定在支持物上的本发明方法或DNA固定其上的本发明材料可简化将DNA固定在支持物上以用所述材料检测靶核酸的一系列步骤。
这样的简化步骤不仅可提高操作时间效率或应用试剂的操作效率，而且可减少因为变性使DNA与支持物的脱离以及增加检测靶核酸的敏感性。
如上所述，通过采用将DNA固定在支持物上的本发明方法，可增加固定在支持物单位面积的DNA量，可增加固定率或固定DNA的密度。按照所述方法可提供DNA固定其上的材料，其中固定在支持物单位面积的DNA量增加而且固定率或固定DNA密度增加。此外，通过采用所述材料可提高检测靶核酸的敏感性。
实施例下述实施例进一步详细阐明本发明，而不能将其解释为限制本发明范围。
实施例1用于DNA的溶剂对固定PCR扩增产物的影响(1)荧光标记的PCR扩增产物的制备将包含人转铁蛋白受体基因的质粒DNA(GenBank登录号×01060，4738bp)用作模板，通过PCR扩增该基因约1kb的片段。用于此PCR的两种引物的碱基序列见SEQ ID NO1和2。在用罗丹明X(PE Biosystems，下文称为ROX)于5’末端荧光标记后使用SEQ IDNO1引物。
(2)测试缓冲液的制备以及固定DNA的方法制备溶液，以便稀释以下组合物至特定浓度，并用作表1所示的各种测试缓冲液。20×SSC含3M氯化钠的0.3M柠檬酸钠溶液。TE含1mM EDTA的10mM tris-盐酸盐(pH 8.0)。PBS采用PBS片(Takara shuzo)制成。100mM柠檬酸盐缓冲液通过混合100mM柠檬酸溶液与100mM柠檬酸钠溶液，将pH调节到特定值而制成。500mM碳酸盐缓冲液通过混合500mM碳酸钠溶液和500mM碳酸氢钠溶液，将pH调节到特定值而制成。500mM吗啉缓冲液用稀盐酸将500mM N-甲基吗啉的pH调节至特定值而制成。50mM硼酸盐缓冲液用2N氢氧化钠将含50mM氯化钾的50mM硼酸溶液的pH调节至特定值而制成。
将荧光标记的PCR扩增产物以0.7mg/ml(1μM)浓度溶解于各溶液中。获得的溶液用作DNA溶液。将所述DNA溶液各0.2μl点样在用变性或没有变性的氨基烷基硅烷(Sigma)处理的载玻片上。将载玻片风干后，在湿化培养箱中于37℃温育1小时。
用60mJ紫外线照射载玻片，然后将其在一种溶液中浸泡15分钟以封闭游离氨基。如下制备所述溶液将5g琥珀酸酐(Nacalai Tesque)溶解于315ml N-甲基-2-吡啶酮(Nacalai Tesque)溶液中，进一步向其中加入35ml 0.2M硼酸盐缓冲液(pH8.0)。最后，用0.2％SDS溶液洗涤载玻片2分钟，然后用蒸馏水洗涤，并在室温下干燥。使所述载玻片进行如下的严格杂交条件。将含0.2％SDS的4×SSC点样在所述载玻片的点样DNA的区域。用盖玻片盖住斑点，使其中没有气泡。用封蜡(seal)严密封闭载玻片，将载玻片在37-40℃温育2-6小时。在去除封蜡后，将载玻片以含0.1％SDS的0.2×SSC洗涤30分钟，然后以0.2×SSC洗涤30分钟并干燥。
(3)固定率的测定在固定以及杂交条件下处理后立即用荧光成象分析仪FMBIO IIMulti-View检测荧光强度。根据相应的荧光强度值计算固定率。结果见表1。表1

如表1所示，证实与采用常规溶剂SSC、PBS或TE观测到的固定率相比，采用吗啉缓冲液或碳酸盐缓冲液点样DNA时观测到的固定率明显提高。
实施例2吗啉缓冲液和碳酸盐缓冲液的pH和缓冲盐浓度对固定PCR扩增产物的影响(1)吗啉缓冲液和碳酸盐缓冲液的pH对固定PCR扩增产物的影响使用作为吗啉缓冲液的N-甲基吗啉盐酸盐(表2的NMM)和碳酸盐缓冲液。
将PCR扩增产物溶解于各NMM缓冲液(pH7-10)和碳酸盐缓冲液(pH9.5-10.5)中。按照实施例1所述进行固定。根据荧光强度确定固定率。结果见表2。表2

如表2所示，观测到宽范围pH(7.0-9.9)的NMM缓冲液的固定率均高。关于碳酸盐缓冲液，证实其固定率在宽范围pH(9.5-10.5)是稳定的。
(2)吗啉缓冲液和碳酸盐缓冲液的盐浓度对固定PCR扩增产物的影响使用以上(1)中描述的NMM缓冲液(pH9.5)和碳酸盐缓冲液(pH9.5)进行检测。所检测的相应缓冲液的盐浓度见表3。按照以上(1)所述进行固定以及检测固定率。结果见表3。表3

如表3所示，观测到宽范围盐浓度(10mM-500mM)的NMM缓冲液的固定率均高。同样观测到宽范围盐浓度(10mM-200mM)的碳酸盐缓冲液的固定率也高。
实施例3支持物的表面处理对固定PCR扩增产物的影响将PCR扩增产物以1μM浓度溶解于以下一种缓冲液中50mMN-甲基吗啉盐酸盐(NMM)缓冲液(pH8.0或9.0)或50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5或10.5)。将0.2μl获得的各溶液点样在进行了表4所示各种表面处理的载玻片上，即用氨基烷基硅烷(Sigma)处理的载玻片、用聚赖氨酸(Sigma)处理的载玻片和用氨基烷基硅烷和戊二醛处理的载玻片。使用氨基烷基硅烷处理的载玻片在2.5％戊二醛水溶液浸泡1小时、用蒸馏水洗涤3次并风干，从而制得用氨基烷基硅烷和戊二醛处理的载玻片。
另一方面，采用没有处理的载玻片作为对照进行相似的固定。
按照实施例1所述测定固定率。结果见表4。表4

如表4所示，证实与用没有处理的载玻片观测到的固定率相比，用氨基烷基硅烷或聚赖氨酸处理的载玻片观测到的固定率增高。同样证实与没有处理的载玻片观测到的固定率相比，用氨基烷基硅烷和戊二醛处理的载玻片观测到的固定率增高。
实施例4寡核苷酸的固定采用DNA合成仪合成以下寡核苷酸具有与实施例1使用的SEQID NO1引物相同碱基序列、其5’末端与ROX连接的20个长度碱基的寡核苷酸(下文称为ROX寡聚物)；于5’末端和3’末端分别与具有6个碳的亚烷基链的烷基氨基接头(PE Biosystems)和ROX连接的寡核苷酸(下文称为ROX氨基寡聚物)。用50mM N-甲基吗啉盐酸盐(NMM)缓中液(pH9.5)或50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)以10μM浓度溶解这两种合成DNA，将其用于检测按照实施例3所述进行各种表面处理的载玻片上的固定情况。
另一方面，检查用TE缓冲液溶解的DNA作对照的固定情况。
使用氨基烷基硅烷(AAS)处理的载玻片以及氨基烷基硅烷和戊二醛处理的载玻片。
在本实施例中，将DNA固定其上、然后洗涤的载玻片进一步浸泡在PBS与含0.25％硼氢化钠(Wako Pure Chemical Industries)的100％乙醇的3∶1混合液中5分钟，然后如上所述洗涤并干燥，以使支持物上的醛基和DNA的氨基之间的共价键形成的Schiff碱还原为稳定的胺。
按照实施例3所述检测固定率。结果见表5。表5

AAS氨基烷基硅烷；GA戊二醛。
如表5所示，证实使用NMM缓冲液或碳酸盐缓冲液均提高ROX氨基寡聚物和氨基烷基硅烷和戊二醛处理的载玻片组合的固定率。另一方面，不管固定寡核苷酸的类型或支持物的表面处理的情况如何，其中使用TE的对照的固定率均低。
实施例5通过杂交检测靶核酸利用杂交检测靶核酸(1)固定DNA采用在实施例1中使用的包含人转铁蛋白基因(4738 bp)的质粒DNA作为模板，利用分别具有SEQ ID NO1和3、1和4、1和5、1和2或1和6的碱基序列的引物对通过PCR扩增0.1kb、0.2kb、0.5kb、1.0kb和1.5kb的DNA片段。将各PCR扩增产物以1μM浓度溶解于50mM N-甲基吗啉盐酸盐缓冲液(pH9.5)中。作为对照，用3×SSC或TE以相似方法制备DNA溶液。将0.2μl各制备的DNA溶液点样在氨基烷基硅烷处理的载玻片上。按照实施例1所述使载玻片进行固定以固定DNA。
(2)与靶核酸杂交化学合成具有SEQ ID NO1碱基序列而且在5’末端标记ROX的寡核苷酸。将该寡核苷酸以1μM浓度溶解于含0.2％SDS的4×SSC中。获得的溶液用作靶核酸溶液。将此溶液于95℃加热2分钟，然后快速冷却。使3-5μl溶液点样在上述(1)中固定了DNA的载玻片上。用盖玻片盖住载玻片，使其中没有气泡。用封蜡严密封闭载玻片，将载玻片在37-40℃温育2-6小时。在去除封蜡后，将载玻片以含0.1％SDS的0.2×SSC洗涤30分钟，然后以0.2×SSC洗涤30分钟并干燥。
(3)检测靶核酸将载玻片置于FMBIO II Multi-View中阅读图象并测定荧光强度。结果见表6。表6

如表6所示，证实与用SSC或TE点样观测到的结果相比，用NMM缓冲液点样的DNA杂交后的荧光强度明显增强。
实施例6加入表面活性剂对点样的影响通过点样含不同表面活性剂(阳离子、阴离子和非离子表面活性剂)的DNA溶液制备微阵列，以研究加入的表面活性剂对点样DNA溶液的量和点样斑点的形状的影响。
简单地说，如下制备含荧光物质的DNA溶液混合终浓度为0.15mg/ml鲑精DNA(Funakoshi)、0.1μM Cy5-dUTP(AmershamPharmacia)、200mM氢氧化钠、300mM醋酸钠和0.1％表7所示的不同表面活性剂中的一种。此外，制备具有上述相同组分但是没有加入表面活性剂的含荧光物质的DNA溶液，作为对照。对于各所述DNA溶液，采用装备有针头直径130μm的针头的GMS 417阵列仪(GeneticMicroSystems)在以下载玻片表面上点样40个斑点MAS包被的载玻片(Matsunami Glass，下文称为MAS)、氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)-包被的载玻片(Matsunami Glass，下文称为APS)或聚-L-赖氨酸(PLL)包被的载玻片(Matsunami Glass，下文称为PLL)。点样后立即用聚焦激光荧光显微镜GMS 418阵列扫描仪(Genetic MicroSystems)对载玻片进行读数，以评价斑点形状。采用图象分析软件ImaGene(BioDiscovery)根据上述的图象读数确定各斑点的荧光强度。计算40个斑点测得的信号强度的平均值。计算值见表7。相应斑点的典型形状见图1。当点样没有加入Cy5-dUTP的如上所述制备的DNA溶液，而且采用GMS 418阵列扫描仪以相同检测敏感度阅读信号时，所述斑点没有检测到荧光。表7

由表7可见，对于各表面处理载玻片，只有当加入某一种表面活性剂时，与作为对照没有加入表面活性剂所观测到的强度相比，斑点的荧光强度(即点样DNA溶液的量)增加。例如，当加入脱氧胆酸、肌氨酰、SDS、Nonidet P-40或Triton X-100时，DNA溶液点样量增加，而使用CTAB或苯扎氯铵时，DNA溶液点样量没有增加。使用吐温-20时APS载玻片的点样量没有增加。如图1所示，对于观测到DNA溶液点样量增加的斑点，观测到其斑点大小增加，说明信号检测的有效象素数量增加。对部分表面活性剂或载玻片观测到斑点信号强度的异质性。
进一步检测了更多类型的表面活性剂。具体地说，主要采用表8所示的非离子表面活性剂如上所述研究了点样DNA溶液的量和斑点的形状。结果总结于表8和图2。采用这些表面活性剂，当没有加入Cy5-dUTP时也没有检测到明显斑点。表8

由表8可见，与没有加入表面活性剂的对照相比，在点样加入了表面活性剂的含荧光物质的DNA溶液时，无论哪种类型的载玻片，几乎在所有情况下，点样DNA溶液量均增加。如图2所示，在观测到点样DNA溶液量增加的斑点中观测到斑点大小增加，说明信号定量的有效象素数量增加。加入这些表面活性剂之一时，所有载玻片的斑点信号强度的异质性均减少。这些结果证实保留在支持物上的DNA溶液量增加，而且通过在DNA溶液中加入这样的表面活性剂形成均匀斑点，均匀斑点才能有效定量所保留的DNA产生的信号。
实施例7加入表面活性剂对PCR扩增产物的固定和检测靶核酸的敏感性的影响检测几种表面活性剂对固定核酸的效率和检测靶核酸与固定核酸杂交的敏感性的影响，所述几种表面活性剂在实施例6中证实明显有效改善斑点的形状和点样DNA溶液量。
(1)荧光标记的DNA片段的制备采用在实施例1中使用的包含人转铁蛋白基因(4738 bp)的质粒DNA作为模板，以及具有SEQ ID NO1和4碱基序列的引物通过PCR扩增0.2kb的DNA片段。在用Cy3荧光标记5’末端后，使用用于所述PCR的两种引物之一，即SEQ ID NO1引物。通过异丙醇沉淀纯化PCR扩增产物，然后冻干。
(2)DNA溶液的制备制备各含有表9所示不同表面活性剂之一的DNA溶液，以便含有以下成分。具体地说，将如上所述制备的荧光标记的PCR片段以0.15μg/μl浓度溶解于含0.1％一种所述表面活性剂、200mM氢氧化钠和30mM醋酸钠(pH5.2)的溶液中。所制得的溶液用作DNA溶液。制备没有表面活性剂的DNA溶液用作对照。
(3)点样以及固定DNA将DNA溶液点样在实施例6所述的MAS-、APS-或PLL-包被的载玻片上。点样后，使载玻片在37℃的湿化培养箱温育1小时，然后用60mJ/cm2紫外线照射，用0.2％SDS溶液洗涤一次，然后用蒸馏水洗涤两次，再后低速离心去除水分。然后将载玻片浸泡在封闭溶液中20分钟封闭游离氨基。使用前如下新鲜配制封闭溶液将2.75g琥珀酸酐溶解于160ml N-甲基-2-吡啶酮溶液中，进一步向其中加入15ml 1M硼酸盐缓冲液(pH8.0)。最后，用蒸馏水洗涤载玻片2次，离心去除水分并保存在干燥器中。
(4)靶核酸的制备按照实施例1所述扩增人转铁蛋白受体基因的1-kb片段，并通过异丙醇沉淀纯化。采用Label IT Cy5标记试剂盒(Mirus)按照附在试剂盒中的说明书用Cy5荧光标记DNA片段，然后纯化。
(5)与靶核酸杂交采用Label IT Cy5标记试剂盒附带的变性溶液和中和溶液按照附在所述试剂盒中的说明书变性和中和上述Cy5标记的DNA片段。将约10μl制得的溶液点样在所述DNA固定在上述(3)制备的各载玻片上的区域上。用盖玻片盖住斑点，使其中没有气泡。用纸质黏合剂(paperbond)(Kokuyo)封闭各盖玻片，将载玻片在65℃湿化培养箱中温育12小时。在去除纸质黏合剂和盖玻片后，将载玻片以60℃的2×SSC洗涤5分钟，然后以60℃的含0.1％SDS的0.2×SSC洗涤5分钟。然后以室温0.2×SSC洗涤载玻片并干燥。
(6)定量荧光强度和计算固定率按照实施例6所述检测斑点的荧光图象和定量荧光强度。作为与固定DNA杂交的固定DNA和靶核酸产生的荧光，分别分析于Cy3的波长检测的荧光和于Cy5的波长检测的荧光。按照实施例1所述检测固定率。结果见表9和10。表9显示于Cy5的波长检测的荧光，它代表与固定在载玻片上的DNA杂交的靶核酸的量。表10显示，根据于Cy3的波长检测的荧光强度计算载玻片上的DNA固定率。表9

表10

由表9可见，使用APS和PLL载玻片，对所检测的所有表面活性剂观测到明显增加与靶核酸杂交产生的荧光强度作用。使用MAS处理的载玻片，当点样其中加入蔗糖一月桂酸酯、蔗糖一葵酸酯、SDS或肌氨酰的DNA溶液时，观测到相似的作用。
此外，由表10可见，与没有加入表面活性剂的对照相比，在脱氧-BIGCHAP和脱氧胆酸以外的表面活性剂没有观测到因为存在表面活性剂引起的固定率变化。
根据实施例6和7的发现，证实无论什么类型的载玻片表面处理，可优选使用非离子表面活性剂，例如尤其是蔗糖一月桂酸酯、蔗糖一葵酸酯和毛地黄皂苷，以显著改善斑点的形状、点样DNA溶液量和检测靶核酸的敏感性。
实施例8表面活性剂的浓度对斑点形状和点样量的影响检测DNA溶液中的两种非离子表面活性剂的浓度对其作用的影响。据判断，这两种非离子表面活性剂即蔗糖一月桂酸酯和毛地黄皂苷优选用于改善实施例6和7中的DNA溶液点样量和斑点形状。简单地说，制备DNA溶液，以点样含不同浓度的一种所述表面活性剂的各溶液，将所述DNA溶液点样在实施例7所述的MAS-、APS-或PLL-包被的载玻片上。点样后立即评价每个斑点的荧光强度和形状。所检测的相应表面活性剂的浓度见表11。计算40个斑点测得的荧光强度的平均值。计算值见表11。表11

由表11可见，当加入浓度范围为0.001％-0.1％的蔗糖一月桂酸酯时，在各种载玻片均观测到增加点样DNA溶液量的作用。当加入浓度范围为0.025％-0.1％(MAS)、0.001％-0.1％(APS)或0.013％-0.1％(PLL)的毛地黄皂苷时同样观测到所述作用。所述斑点的形状趋向于随点样DNA溶液量的增加而改善。
按照实施例7所述使所述载玻片固定、与靶核酸杂交以及检测。结果杂交后每个斑点的固定DNA量不受所述表面活性剂浓度的影响，保持恒定不变。杂交信号的形状往往与点样后立即观测到形状相似。
工业实用性如上所述，与常规方法固定的DNA量相比，按照本发明方法，更大量的DNA可以固定在固体支持物上。按照本发明的方法可增加与支持物的固定率或固定DNA的密度。而且，采用按照本发明的固定方法制备的、DNA固定其上的材料可提高检测靶核酸方法的检测敏感性。
序列表独立文本SEQ ID NO1设计用于扩增转铁蛋白受体基因的一部分的寡核苷酸。
SEQ ID NO2设计用于扩增转铁蛋白受体基因的一部分的寡核苷酸。
SEQ ID NO3设计用于扩增转铁蛋白受体基因的一部分的寡核苷酸。
SEQ ID NO4设计用于扩增转铁蛋白受体基因的一部分的寡核苷酸。
SEQ ID NO5设计用于扩增转铁蛋白受体基因的一部分的寡核苷酸。
SEQ ID NO6设计用于扩增转铁蛋白受体基因的一部分的寡核苷酸。
权利要求
1.用于将DNA固定在支持物上的方法，该方法包括在一种缓冲液中使DNA与支持物接触，所述缓冲液包含至少一种选自以下的物质吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐。
2.按照权利要求1的方法，其中所述吗啉衍生物是C1-3烷基取代的N-烷基吗啉。
3.按照权利要求1的方法，其中所述吗啉盐或吗啉衍生物是一种选自以下的盐与无机酸的盐、与有机酸的盐以及与脂肪酸的盐。
4.按照权利要求1的方法，其中所述碳酸盐是一种选自以下的盐钠盐、钾盐、镁盐、铵盐和三乙胺盐。
5.按照权利要求1的方法，其中所述缓冲液含有至少一种选自以下的物质吗啉、吗啉衍生物及其盐，以及至少一种碳酸盐。
6.按照权利要求1-5任一项的方法，其中所述缓冲液的pH为7-11。
7.按照权利要求1-6任一项的方法，其中所述缓冲液中的至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质的浓度为10-500mM。
8.按照权利要求1-7任一项的方法，其中所述DNA是寡核苷酸、多核苷酸或其衍生物。
9.按照权利要求1-8任一项的方法，其中所述缓冲液中的所述DNA浓度为0.1-2.0mg/ml。
10.按照权利要求1-9任一项的方法，其中所述缓冲液还含有至少一种盐。
11.按照权利要求1-10任一项的方法，其中所述缓冲液还含有至少一种表面活性剂。
12.按照权利要求1-11任一项的方法，其中所述支持物由玻璃或石英制成，或者为通过处理玻璃或石英表面制得的材料
13.按照权利要求12的方法，其中用硅烷偶联剂或聚阳离子处理所述表面。
14.按照权利要求1-13任一项的方法，其中在不变性的情况下固定所述DNA。
15.按照权利要求14的方法，其中所述DNA为双链DNA。
16.一种将DNA固定在支持物上的方法，所述方法包括在一种缓冲液中使DNA与支持物接触，所述缓冲液含有至少一种表面活性剂。
17.按照权利要求16的方法，其中所述表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和兼性表面活性剂。
18.按照权利要求17的方法，其中所述表面活性剂选自蔗糖一葵酸酯、蔗糖一月桂酸酯和毛地黄皂苷。
19.按照权利要求16-18任一项的方法，其中所述缓冲液含有至少一种选自以下的物质吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐。
20.按照权利要求19的方法，其中所述缓冲液的pH为7-11。
21.按照权利要求19或20的方法，其中所述缓冲液中至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质的浓度为10-500mM。
22.按照权利要求16-21任一项的方法，其中所述DNA为寡核苷酸、多核苷酸或其衍生物。
23.按照权利要求16-22任一项的方法，其中所述缓冲液中的所述DNA的浓度为0.1-2.0mg/ml。
24.按照权利要求16-23任一项的方法，其中所述缓冲液还含有至少一种盐。
25.按照权利要求16-24任一项的方法，其中所述支持物由玻璃或石英制成，或者为通过处理玻璃或石英的表面制得的材料。
26.按照权利要求25的方法，其中用硅烷偶联剂或聚阳离子处理所述表面。
27.按照权利要求16-26任一项的方法，其中在不变性的情况下固定所述DNA。
28.按照权利要求27的方法，其中所述DNA为双链DNA。
29.DNA固定在其上的一种材料，它按照权利要求1-28任一项定义的方法制得。
30.按照权利要求29的材料，其中所述DNA为双链DNA。
31.一种检测靶核酸的方法，所述方法包括采用权利要求29或30定义的、DNA固定在其上的材料检测靶核酸。
32.按照权利要求31的方法，该方法包括使DNA固定在其上的所述材料与所述靶核酸在严格条件下杂交。
33.按照权利要求32的方法，其中在所述固定DNA不变性的情况下，使固定在所述材料上的所述DNA与所述靶核酸在严格条件下杂交。
34.其中双链DNA固定在支持物上的一种材料，它可用于在不使所述固定DNA变性的情况下与靶核酸在严格条件下杂交。
35.一种用于固定DNA的缓冲液，它含有至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质。
36.一种用于固定DNA的缓冲液，它含有至少一种表面活性剂。
37.一种用于固定DNA的缓冲液，它含有至少一种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐和碳酸盐的物质以及至少一种表面活性剂。
全文摘要
一种将DNA固定在载体上的方法,其特征在于包括以下步骤:在包含一种或多种选自吗啉、吗啉衍生物、其盐及其碳酸盐的成分的缓冲液中使所述DNA与所述载体接触。
文档编号C12N15/10GK1334871SQ99816014
公开日2002年2月6日 申请日期1999年12月8日 优先权日1998年12月10日
发明者高山正范, 六嶋正知, 植田稔, 冈本幸子, 尾崎彩, 峰野纯一, 君塚房夫, 浅田起代蔵, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社 被以下专利引用 (1),