钠/质子反向转运载体基因的制作方法

专利名称：钠/质子反向转运载体基因的制作方法
专业领域本发明涉及一种从植物中得到的新的Na+/H+反向转运载体(antiporter)及其编码DNA，本发明还涉及它们的生产方法和用途。
背景技术：
植物的耐盐性对于农业和环境保护都很重要。如今，地球上三分之一的土地被认为是干旱土地。而且，由于耕地和绿地都在不断地荒漠化，据推测将来干旱土地的比例还将提高。预测表明，2050年时世界人口将达到现在的1.5倍，因此所致的需求量上升带来严重问题，迫切急需开发可在不适于耕种的，特别是干旱的土地上生长的栽培作物，以及可在上述土地上使用的栽培技术。在干旱土地上，与农业伴随的问题是盐的积累。在干旱天气中，土壤的蒸发蒸腾作用超过降水，以及在需要大量排水的土地上持续的灌溉，均使含有盐分的地下水位加速上升而在地表沉积，导致大量盐分积累。从古代的实例可知，这种情况造成的结果是一些地方变得不可能进行耕种，底格里斯-幼发拉底文明的结束就是代表。直到今天，这类问题仍在发生。因此，在干旱以及盐分积累的土地上进行农业革新，来增强植物的耐盐性是非常重要的(Toshiaki Tanno(1983)，Kagaku to Seibutsu 21439-445“作物的耐盐性及其机制”；Yasutaka Uchiyama(1988)，Kagaku toSeibutsu 26650-659“盐环境的农业利用”)。
有两种与盐压力相关的压力作用于植物，即渗透压和离子压。渗透压是一种作用方式与脱水作用力相同的压力。这种压力是由于植物周围存在高盐度环境，形成了高渗透压而产生的，其阻止植物吸收水分并同时使植物失水。众所周知，植物中存在一种可避免渗透压的机制。与这一功能有关的核心物质是一些离子(诸如K+、Na+、Cl-，有机酸等等)以及称作相溶性溶质的物质。这里的术语“相溶性溶质”指诸如糖、脯氨酸(一种氨基酸)、甘氨酸甜菜碱(一种季氨化合物)等物质，这些物质在细胞中即使积累到高浓度也不会干扰合成途径或抑制酶的活性。植物细胞积累这些物质，这些物质反过来使植物维持与外界的渗透压平衡(Manabu Ishitani，Keita Arakawa和Tetsuko Takabe(1990)，植物的化学调节.25149-162，“植物耐盐性的分子机制”)。
关于植物避免离子压力的机制几乎没有取得什么进展。植物细胞吸收过量的Na+导致胞内酶反应被抑制，并最终造成代谢紊乱(ToruMatoh(1997)，植物的化学调节.32198-206，“植物的耐盐机制”)。因此，很有必要从细胞中清除掉累积的Na+或者将之隔离入一些细胞器如液泡中。根据假设，Na+/H+反向转运载体(钠/质子反向转运载体)在此过程中起核心作用。植物细胞的Na+/H+反向转运载体被认为既存在于细胞膜上也存在于液泡膜上。他们利用由H+泵(H+-ATP酶和H+焦磷酸酶)(即一种运输H+的元件)在生物膜两边形成的pH梯度作为能量，将存在于细胞质中的Na+运出细胞或运入液泡。再者，根据假设，与高浓度盐接触的植物不得不在细胞间保持足够高的Na+/K+比，通过Na+/H+反向转运载体在液泡内积累Na+来维持胞内外的渗透压平衡。
对动物、酵母、细菌等生物存在胞质膜上的Na+/H+反向转运载体进行了仔细检查。在动物细胞的胞质膜上，H+由Na+/H+反向转运载体携带，通过利用由Na+/K+-ATP酶形成的膜间Na+浓度梯度，来维持细胞中的H+平衡。因此认为，反向转运载体与胞内pH调节、细胞体积的控制以及Na+的胞质膜跨膜运输等活动密切相关(Orlowski，J.和Grinstein，S.(1997)，生物化学杂志.27222373-22376；Aronson，P.S.(1985)，生理学年鉴(Ann.Rev.Physiol.)47545-560)。Na+/H+反向转运载体存在于动物的各种细胞中，已有六种同工型(NHE1～6)得到报道(Orlowski，J.和Grinstein，S.(1997)，生物化学杂志.27222373-22376)。
第一个从酵母中克隆到的此类基因是来自于裂殖酵母(粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))的基因(sod2)，该基因是作为一个与Na+的运输及耐盐性相关的基因被克隆的(Jia，Z.P.，McCullough，N.，Martel，R.，Hemmingsen，S.和Young，PG.(1992)，欧洲分子生物学组织杂志111631-1640)。另外，从芽殖酵母(酿酒酵母)以及Zygosaccharomyces rouxii中发现一个与这个基因高度相同的基因(分别命名为NHA1和ZSOD2)(Prior，C.等(1996)，FEBS Letter.38789-93；Watanabe，Y.等(1995)，酵母.11829-838)。从大肠杆菌中也分离到了两个不同的Na+/H+反向转运载体基因(nhaA，nhaB)，都与Na+的运输和耐盐性紧密相关(Karpel，R.等(1988)，生物化学杂志.26310408-10410；Pinner，E.等(1994)，生物化学杂志.26926274-26279)。关于植物，已在藻类等中检测了此类活性(Katz，A.等(1989)，生物化学及生物物理学学报.9839-14)。
另一方面，植物中仅限于液泡膜上反向载体活性的报道。迄今已知，液泡膜上的Na+/H+反向转运载体与生长在高盐度环境里的盐生植物的耐盐性有关(Matoh，T.等(1989)，植物生理学.89180-183；Hassidim，M.等(1990)，941795-1801；Barkla，B.J.等(1995)，植物生理学.109549-556)，也与耐高盐的甜土植物如大麦和甜菜等的耐盐性有关(Hassidim，M.等(1990)，植物生理学.941795-1801；Blumwald，E.等(1987)，植物生理学.8530-33；Garbarino，J.和DuPont，F.M.(1988)，植物生理学.86231-236；Garbarino，J.和DuPont，F.M.(1989)，植物生理学.891-4；Staal，M.等(1991)，植物生理学82179-184)。上述发现表明，Na+/H+反向转运载体与植物的耐盐性紧密相关。已有好几个关于液泡膜上Na+/H+反向转运载体特征的报道。反向转运载体对Na+活性的Km值大约为10mM，与哺乳动物细胞膜上的相似(Blumwald，E.等(1987)，植物生理学.8530-33；Garbarino，J.和DuPont，F.M.(1988)，植物生理学.86231-236；Orlowski，J.(1993)，生物化学杂志.26816369-16377)。再者，已知Na+运载蛋白的特异性抑制剂氨氯吡嗪脒及其衍生物，可以竞争性的方式抑制在植物液泡膜上和哺乳动物胞质膜上的Na+/H+反向转运载体(Blumwald，E.等(1987)，植物生理学.8530-33；Orlowski，J.(1993)，生物化学杂志.26816369-16377；Tse，C.M.等(1993)，生物化学杂志.26811917-11924；Fukuda，A.等(1998)，植物细胞生理学.39196-201)。这些发现揭示了，植物液泡膜和哺乳动物胞质膜上的Na+/H+反向转运载体之间具有相似特征。如上所述，已有多种关于植物中的Na+/H+反向转运载体活性的报道，然而，尽管已作了各种各样的试验，但仍缺乏对于实质部分也就是基因及其蛋白的分析(Katz，A.等(1989)，生物化学及生物物理学报.9839-14；Barkla，B.和Blumwald，E.(1991)，美国科学院学报Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8811177-11181；Katz，A.，Kleyman，T.R.，和Pick，U.(1994)，生物化学.332389-2393)。
最近，从拟南芥属克隆到了一个基因，推测该基因编码一种与已知Na+/H+反向转运载体具有氨基酸序列同源性的蛋白；但是，这一基因的功能还未确定(M.P Apse等(1998)，“第11届国际植物膜生物学讨论会”最后议程和摘要集，Springer；C.P.Darley等(1998)，“第11届国际植物膜生物学讨论会”最后议程和摘要集，Springer)。
从植物中分离得到的Na+/H+反向转运载体基因的实例，仅限于从上述一种双子叶植物－－拟南芥中分离到的那些。到目前为止，还没有从包括诸如具有工业应用价值的作物水稻、玉米等物种在内的单子叶植物纲中分离到此类基因的报道。
发明公开在所有重要的作物中，水稻是一种耐盐性较差的作物。150mM的NaCl可将水稻的生长抑制一半，相比之下，大麦是一种高度耐盐的作物，将其生长抑制到同样水平所需的NaCl浓度是250mM。Garbarino等曾经报道，通过在根部液泡中积累Na+来抑制Na+向茎干的流动，可能提高大麦的耐盐性(Garbarino，J.和DuPont，F.M.(1988)，植物生理学.86231-236)。在证实上述情况的过程中，发现经过盐处理以后，大麦根部液泡膜上的Na+/H+反向转运载体活性将提高。还发现大麦中该活性远远高于水稻(Garbarino，J.和DuPont，F.M.(1988)，植物生理学.86231-236；Fukuda，A.Yazaki，Y，Ishikawa，T.，Koike，S.和Tanaka，Y.(1998)，植物细胞生理学.39196-201)。
相反地，在水稻中即使经过盐的处理，活性也不会上升(Fukuda，A.Yazaki，Y.，Ishikawa，T.，Koike，S.和Tanaka，Y.(1998)，植物细胞生理学.39196-201)。此外，已知水稻中Na+从根部向茎干的运输量要比芦苇(Phragmites)中的高，芦苇是与水稻同属禾本科、但比水稻的耐盐性更强的植物(Matsushita，N.和Matoh，T.(1991)，生理学和植物(Physiol.Plant)83170-176)。因此，根部液泡膜上Na+/H+反向转运载体活性的强度可能与水稻耐盐性密切相关。这些报道表明，通过提高水稻根部的Na+/H+反向转运载体活性，可能会提高水稻的耐盐性。因此，就需要分离可能会提高水稻中Na+/H+反向转运载体活性的基因。
这种情况是本发明的动因，本发明的目标之一是提供一种来自单子叶植物纲，优选水稻的Na+/H+反向转运载体，其编码基因，以及它们的生产方法和用途。本发明提供了所述基因在生产耐盐植物方面的应用，其为本发明优选应用。
本发明人鉴定了一个水稻花序cDNA克隆，通过在GeneBank高等植物数据库中的碱基序列分析，发现该cDNA克隆与从芽殖酵母的Na+/H+反向转运载体(NHX1)基因同源。利用这一序列作为探针，本发明人最近成功地克隆了该全长基因，命名为“OsNHXl”，推测该基因编码水稻的Na+/H+反向转运载体。
分离的OsNHXl的cDNA约为2.3kb，推测其编码一个有535个氨基酸的蛋白质(

图1)。根据氨基酸疏水性分析，发现该蛋白含有12个跨膜区域(图2)。
经检测发现，从OsNHXl推测的氨基酸序列，与NHXl以及哺乳动物的Na+/H+反向转运载体(NHE)的氨基酸序列具有显著的一致性(表1)。特别地，在被认为是参与离子运输的跨膜区域中发现了高度一致性(图3)。
根据为迄今已报道的各种Na+/H+反向转运载体所作的树状图(图4)，可证明这三种蛋白(芽殖酵母的NHXl、哺乳动物的NHE6、以及OsNHXl)构成了一个群。由于已有关于NHXl蛋白在晚期内体表达的报道(Nass，R.和Rao，R.(1998)，生物化学杂志.27321054-21060)以及发现NHE6蛋白也可在细胞内表达(Numata，M.，Petrecca，K.，Lake，N.和Orlowski J.(1998)，生物化学杂志.2736951-6959)，因此也可预期本发明中的OsNHXl蛋白在细胞器如液泡中表达，并且在液泡膜的Na+运输中起重要作用。
再者，本发明人通过利用农杆菌方法将分离到的OsNHXl基因转入水稻愈伤组织并使之再分化，成功地获得了转基因植物。
本发明涉及一种来自于单子叶植物纲的新的Na+/H+反向转运载体以及编码该反向转运载体的DNA，本发明还涉及生产和使用，尤其是利用该反向转运载体生产耐盐植物的方法。更具体地说，本发明提供了(1)选自下组DNA，该组包括(a)一种DNA，其编码含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质；(b)一种DNA，其包括SEQ ID NO1所示碱基序列的编码区。
(2)一种编码来自单子叶植物纲的Na+/H+反向转运载体的DNA，其选自
(a)一种DNA，其编码含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质，所述序列中已取代、删除、插入和/或添加了一个或多个氨基酸；(b)一种DNA，其在严谨条件下可与包含SEQ ID NO1所示碱基序列的DNA杂交；(3)在(2)中的DNA，其中的单子叶植物纲是指属于禾本科的植物；(4)一种载体，其包含(1)或(2)中的DNA；(5)一种转化细胞，其含有(1)或(2)中的DNA或含有(4)中的载体；(6)在(5)中的转化细胞，其中的细胞是一种植物细胞；(7)一种由(1)或(2)中的DNA编码的蛋白质；(8)一种生产(7)中蛋白的方法，其包含如下步骤培养(5)中的转化细胞，以及从该细胞或其培养物上清中回收表达的蛋白质；(9)一种包含有(6)中转化细胞的转化植物；(10)在(9)中的转化植物，其中的植物是一种单子叶植物；(11)在(10)中的转化植物，其中的植物是属于禾本科的植物；(12)在(11)中的转化植物，其中的植物是水稻；(13)一种转化植物，其为(9)～(12)中任一转化植物的后代或克隆；(14)一种用来培植(9)～(13)中任一转化植物的材料；(15)一种可与(7)中蛋白结合的抗体；(16)一种可与SEQ ID NO1中所示DNA杂交的核酸分子，且该分子的链长度至少15个核苷酸。
本发明提供了一种来自于单子叶植物纲的新的Na+/H+反向转运载体，以及其编码DNA。由本发明人从水稻中分离的编码Na+/H+反向转运载体“OsNHXl”的cDNA的碱基序列，被展示在SEQ ID NO1中。由该cDNA编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
“OsNHXl”基因与Na+/H+反向转运载体的很多已知氨基酸序列表现出显著的一致性，尤其在涉及离子运输的位点，可观察到特别高的一致性。这一发现意味着“OsNHXl”蛋白在水稻的Na+运输中起着重要的作用。据推测，植物的Na+/H+反向转运载体参与维持高盐度压迫下植物体内的渗透压平衡。因此，预期“OsNHXl”基因尤其可应用于耐盐栽培品种的生产。
本发明不仅包括“OsNHXl”蛋白，还包括与其功能等价的蛋白。本文中“与‘ OsNHXl’蛋白功能等价的蛋白”是指目标蛋白具有Na+/H+反向转运载体的功能。Na+/H+反向转运载体的活性检测如下，如可检测因加入Na+而从生物膜囊泡(vesicle)发射出的H+(其表现为荧光的恢复)，可监控H+-ATP酶在不同生物膜囊泡间形成的H+浓度梯度(其表现为丫啶橙荧光的淬灭)(Fukuda，A.，Yazaki，Y.，Ishikawa，T.Koike，S.和Tanaka，Y.(1998)，植物细胞生理学.39196-201)。
在一个实施方案中，与“OsNHXl”功能等价的蛋白是一种突变蛋白，其已在“OsNHXl”蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO2)中取代、缺失、插入和/或添加了一个或多个氨基酸，其保持了与“OsNHXl”蛋白等价的功能。这类蛋白可按照下面例举的方法来制备。如本领域技术人员熟知的在“OsNHXl”氨基酸中诱导突变的方法。即，本领域技术人员可以通过修饰“OsNHXl”蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，而制备一种与“OsNHXl”功能等价的修饰蛋白。例如，可用定点诱变方法(Kramer，W.和Fritzx，H.-J.“经缺口型双链DNA进行寡核苷酸定点诱变”酶学方法.154350-367，1987)等提高蛋白活性。氨基酸的突变也可自然发生。本发明的蛋白包括，在“OsNHXl”蛋白的天然氨基酸序列(SEQ ID NO2)中，取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸并保持了与天然蛋白等价的功能的人工或天然衍生的蛋白。对于蛋白中将被改变的氨基酸的部分或数目没有限定，只要修饰后的蛋白保持与天然“OsNHXl”蛋白等价的功能即可。一般来讲，被修饰的氨基酸在100个以内，优选50个以内，更优选20个以内，最优选5个以内。
在另一实施方案中，与“OsNHXl”蛋白功能等价的蛋白，是一种由单子叶植物纲的DNA编码的蛋白，该DNA可与编码“OsNHXl”蛋白的DNA(SEQ ID NO1)杂交，该蛋白具有与“OsNHXl”蛋白等价的功能。这些蛋白可用本领域技术人员熟知的技术如杂交技术(Southem，E.M.分子生物学杂志，卷.98，503，1975)以及聚合酶链式反应(PCR)技术(Saiki，R.K.等.科学，卷.230，1350-1354，1985；Saiki，R.K.等.科学，卷.239，487-491，1988)等来制备。即，本领域技术人员通常可通过利用“OsNHXl”基因(SEQID NO1)的碱基序列或其部分作探针，利用可与“OsNHXl”基因碱基序列(SEQ ID NO1)特异性杂交的寡核苷酸作引物，从水稻或其它单子叶植物中分离出与“OsNHXl”基因有高度一致性的DNA，进而从该DNA获得功能与“OsNHXl”蛋白等价的蛋白。这类来源于单子叶植物纲，可通过杂交技术或PCR技术获得的，与“OsNHXl”蛋白具有等价功能的蛋白质，也包括在本发明的蛋白中。
单子叶植物纲，优选属于禾本科的植物，可以作为通过杂交技术和PCR技术分离基因的来源植物。例如，属于禾本科的植物除水稻外，大麦(Hordeumvulgare)，小麦(Triticum aestivum)，玉米(Zea mays)等都可以选择，但不限于此。
利用上述技术分离能编码与“OsNHXl”蛋白功能等价的蛋白的方法，包括但不仅限于以下例子。例如，用32P等标记的探针(例如，包括SEQ IDNO1所示碱基序列或其部分序列的DNA)与单子叶植物纲的cDNA文库或基因组文库进行杂交。用32P标记探针进行杂交的条件中，温和条件是25℃(不含甲酰胺)，通常是在42℃下，使用杂交溶液(50％甲酰胺，5X SSPE，2X Denhard’s溶液，0.1％(w/v)SDS以及100μg/ml的鲱鱼精DNA(SambrookJ，Fritsch EF，Maniatis T(1989)，分子克隆实验室手册(冷泉港实验室.，冷泉港，纽约)，第二版))。预杂交进行的时间最少要超过一个小时，而杂交要进行24小时。对杂交后滤膜的洗涤，温和条件(低严谨度条件)是在25℃(洗涤溶液2X SSC，0.1％SDS)进行，普通条件是在42℃(洗涤溶液2XSSC，0.1％SDS)进行，严格条件(高严谨度条件)是在56℃(洗涤溶液0.1XSSC，0.1％SDS)进行。
如果按上述方法分离到的DNA编码的蛋白具有与“OsNHXl”蛋白等价的功能，该蛋白一般会表现出与“OsNHXl”蛋白氨基酸序列的高度一致性。本文中术语“高度一致性”是指一致性高于至少60％，优选高于80％，更优选高于85％，更加优选高于90％。氨基酸序列一致性是通过，例如GENETYX软件(软件开发公司)提供的同源性分析程序来计算(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.(1985)，科学.227，1435-1441)。
本发明蛋白可以通过本领域技术人员熟知的方法制备为重组蛋白或天然蛋白。重组蛋白可以通过如下方法来制备，例如，将编码本发明蛋白的DNA插入一个合适的表达载体，用此载体转染一种合适的细胞，然后从转化细胞中纯化这种蛋白，如后文述。另外，天然蛋白可以通过如下方法来制备，例如，从表达本发明蛋白的细胞(例如水稻细胞)制备细胞提取物，将其上样于附着有抗体的亲和柱，该抗体是通过用已制备好的重组蛋白或其部分肽段免疫合适的免疫动物来制备的，然后纯化结合在柱上的蛋白。
另外，本发明提供了编码上述本发明蛋白的DNA。本发明DNA包括基因组DNA、cDNA以及化学合成的DNA等等，还可以是无限制的任何DNA，只要该DNA可以编码本发明中的一种蛋白。本发明中包括的“OsNHXl”cDNA的碱基序列示于SEQ ID NO1中。
基因组DNA，及cDNA均可以按照本领域技术人员熟知的常规方法来制备。例如，基因组DNA可以通过如下方法来分离，根据本发明基因的碱基序列信息设计适合的引物进行PCR，然后利用所获扩增的DNA片段作为探针筛选基因组文库。或者，可按照同样的方法从cDNA文库中分离cDNA。
本发明中的DNA可以应用于，例如，重组蛋白的制备，以及耐盐型转化植物的产生等。通常，重组蛋白的制备是将编码本发明蛋白的DNA插入合适的表达载体，将该表达载体转入合适的细胞，培养所得转化细胞，然后纯化其表达的蛋白。
重组蛋白可以如下制备将编码本发明蛋白的DNA插入载体，通过已知的基因转移方法，如电穿孔法、磷酸钙转染法等等将所述载体转入细胞，如细菌细胞(大肠杆菌)、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等等，然后在细胞中表达该重组蛋白。在宿主细胞中表达的重组蛋白可用本领域技术人员熟知的方法纯化。例如，可使用诸如大肠杆菌中的pGEX(Pharmacia)载体将所述蛋白表达为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白，然后利用谷胱甘肽柱将之纯化(Shigeo Ohno和Yoshifumi Nishimura(1997)，“细胞工程增刊蛋白实验方案”Shujun-sha)。
此外，利用本发明DNA制备转化植物，是将编码本发明蛋白的DNA插入适合的载体，将该载体转入植物细胞，继而使所得转化的植物细胞再生。根据物种的不同，植物表达载体可通过利用农杆菌的方法转入植物细胞，或直接转入细胞。利用农杆菌的方法有，例如，Nagel等(微生物学通信.67325(1990))的方法以及Raineri等的转化水稻方法(生物/技术.833-38(1990))。有些方法是先用植物表达载体(pUC系统等，例如，pCAMBIA载体(Medical Research Council)等)转化农杆菌，接着用像叶盘法、愈伤组织法等诸如此类的标准方法将已转化的农杆菌转入植物细胞。将植物表达载体直接转入细胞的方法包括，电穿孔法、粒子枪法、磷酸钙法、聚乙二醇法等。
对于本发明中的载体可转入什么样的植物细胞没有限制，但优选单子叶植物，尤其禾本科植物。除水稻以外，可选玉米等植物作为禾本科的植物。此外，本发明中的“植物细胞”包括各种形式的植物细胞，如悬浮培养细胞、原生质体、叶片的一部分、愈伤组织等等。
可用愈伤组织分化法(Kyozuka，J.和Shimamoto，K.(1991)，植物组织培养手册.Kluwer Academic Publishers，Bl1-16页；Toki，S.(1997)，植物分子生物学.1516-21)、利用原生质体的分化方法(Shimamoto，K.等(1989)，自然.338274-276；Kyozuka，J.等(1987)，分子普通遗传学206408-413)、以及针对所用植物的方法等，将已导入载体的转基因植物细胞再生为转基因植物。
如此产生的转基因植物与野生型植物相比，表现出更高的Na+/H+反向转运载体活性，并预测其因此将获得耐盐性。而且，一旦获得了本发明DNA转染的转化植物，就可能通过有性生殖或无性生殖从该植物体得到后代。另外，还可以通过由植物体，及其后代或克隆获得的繁殖材料(例如，种子、果实、谷穗、块茎、结节、残根、愈伤组织、原生质体等)大量生产植物。用本发明DNA转化的植物细胞、包含有这些细胞的植物体、该植物的后代和克隆以及从该植物获得的繁殖材料、其后代和克隆等均包括在本发明中。
这种比野生型高的Na+/H+反向转运载体活性可以通过Na+/H+反向转运载体的高度表达(量的变化)，或具有更高活性的Na+/H+反向转运载体的表达(质的变化)获得，或是两者同时发生的结果。
此外，本发明提供了可以与上述本发明蛋白结合的抗体。多克隆抗体和单克隆抗体都包括在本发明中。抗体的制备可用本领域技术人员熟知的方法，如Harlow等的方法(Harlow，E.和Lane，D.(1988)，抗体实验室手册。冷泉港实验室，冷泉港，纽约)进行。多克隆抗体可通过将大肠杆菌中合成的融合蛋白或合成肽作为抗原注射家兔，获得家兔的抗血清，然后经亲和层析纯化其抗血清而获得。单克隆抗体可通过将抗原注射至小鼠或大鼠，克隆并制备杂交瘤，然后对所获抗体进行亲和层析而获得。
此外，本发明还提供了可与编码本发明蛋白的DNA杂交的核酸分子，其链长度至少为15个核苷酸。这种核酸分子可以，例如，作为探针来检测或分离编码本发明蛋白的DNA，以及作为引物扩增这类DNA。这种核酸分子优选与编码本发明蛋白的DNA特异性杂交。这里使用的术语“特异性杂交”是指，在正常杂交条件下，优选在严格杂交条件下，该分子可与编码本发明蛋白的DNA杂交，而不能与编码其它蛋白的DNA杂交。
另外，这种核酸分子可用作反义寡核苷酸、核酶等，抑制本发明蛋白的表达。这种反义寡核苷酸的衍生物和修饰形式可以按该反义寡核苷酸本身相同的方式使用。这种反义寡核苷酸不必与组成DNA或mRNA给定区域的核苷酸完全互补，还可以包括一个或更多核苷酸错配，只要它能抑制蛋白的表达。可以抑制本发明蛋白表达的反义寡核苷酸或核酶可作为分析本发明蛋白功能的很有用的工具。
附图简述图1展示水稻Na+/H+反向转运载体(OsNHXl)cDNA的碱基序列和预测的氨基酸序列。氨基酸序列以单字母符号来表示。
图2展示OsNHXl蛋白的氨基酸疏水图谱。横坐标表示氨基酸残基，纵坐标表示疏水程度。推测的跨膜区域以框起来的数字来表示。
图3展示OsNHXl和其它Na+/H+反向转运载体之间的氨基酸序列比较。跨膜区域(M3～M6)表示在其序列上方。关于在氨基酸下方的符号，“*”表示所有的氨基酸都是保守的；“”和“.”表示氨基酸是相似的。“”代表的相似性比“.”所代表的更高。框起来的A代表特异性抑制剂氨氯吡嗪脒的结合位点，而框起来的B代表与哺乳动物Na+/H+反向转运载体具有高度一致性的位点。
图4展示用Clustal X(Thompson，J.D.等(1994)，核酸研究，224673-4680)(邻接法(NJ法))对Na+/H+反向转运载体进行系统发生分析的结果。
实施本发明的最佳模式本发明用以下实施例作具体的举例说明。但应理解本发明不限于这些实施例。
水稻Na+/H+反向转运载体基因的克隆对来自芽殖酵母并与Na+/H+反向转运载体(NHXl)具有一致性的序列从GeneBank的高等植物数据库进行分析。从水稻圆锥花序的cDNA文库中鉴定了一个cDNA克隆。该克隆预测的氨基酸序列与NHXl有37％的一致性。推测所获得的cDNA克隆没有全长的碱基序列。因此，利用该cDNA克隆作为探针，用从水稻(Oryza sativa L.cv Nipponbare)籽苗根制备的mRNA构建cDNA文库，用该cDNA文库作为模版，筛选具有全长插入的cDNA克隆。
将水稻种子吸水过夜，然后放在悬浮于营养液(0.5mM NH4H2PO4，1mMKNO3，0.5mM MgSO4，12.5μM Fe-EDTA，1mM CaCl2，微量营养元素)上的棉网上。在如下培养条件下培养7天白天(光强40μmolm-2s-1)30℃下14小时，夜晚25℃下10小时，湿度为75％。
从水稻籽苗根制备了Poly(A+)RNA，通过5～25％的蔗糖密度梯度离心进行大小分级分离。然后，从包含相对较大的Poly(A+)RNA级分构建了cDNA文库(Tanaka，Y.等(1989)，植物生理学.901403-1407)。利用寡聚dT作为引物，通过Gubler和Hoffman的方法(Gubler，U.和Hoffman，B.J.(1983)，基因.25263-269)，从大小分级的Poly(A+)RNA合成了双链cDNA。接着利用Asahipack GS710柱(Asahi化学工业股份有限公司，东京；2.5x50cm)，通过高效液相色谱(Tosoh，Tokyo，型号CCPD)对样品进行大小分级分离。将大于2kb的cDNA插入λgtll的EcoRI位点。
将与NHXl有一致性的cDNA克隆作为探针，利用构建好的含有cDNA文库的λ噬菌体进行噬菌斑杂交。从有信号的噬菌斑中选出有最长cDNA插入子的载体，通过将切出的cDNA插入一个pBluescript(KS+)载体(Stratagene)完成克隆。用所获克隆作为探针，对从水稻植物体中提取的RNA进行Northern杂交，根据信号大小确定所得cDNA克隆为全长cDNA。其中已插入完整基因(称之为OsNHXl)的cDNA的所有碱基序列已经得到了确定(图1)。
OsNHXl基因的碱基序列和氨基酸序列分析全长序列为2330碱基对，5′非翻译区为296个碱基对，翻译区共1608个碱基对，3′非翻译区为426个碱基对。推测该基因编码的蛋白长度为535个氨基酸，计算其分子量为59,070道尔顿。推测的氨基酸序列中有59％是疏水的，22％是中性氨基酸，还有19％是亲水氨基酸。因此，该蛋白看来像是高度疏水性的。用Kyte和Doolittle的方法(Kyte，J.和Doolittle，R.F.(1982)，分子生物学杂志.157105-132)进行疏水性分析的结果展示在图2。通过利用Tmpred程序的方法(Hofmann，K.和Stoffel，W.(1993)，Biol.Chem.Hoppe-Seyler.374166)发现了12个跨膜区。
发现从OsNHXl推测的氨基酸序列与NHXl以及哺乳动物Na+/H+反向转运载体(NHE)的氨基酸序列有显著的一致性(表1；表中NHXl来自酵母[酿酒酵母]，NHE6来自人，而NHE1～4来自大鼠。表中数值用GENETYX(10版)软件(软件开发公司)中的同源分析程序(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.(1985)，科学.2271435-1441)计算)。在跨膜区域观察到特别高的一致性，该区域被认为参与离子运输(图3)。OsNHXl氨基酸序列的一部分(SEQ IDNO.2中的83～92残基)，83LFFIYLLPPI92，在NHXl和NHE中都高度保守，推测该序列是真核Na+/H+反向转运载体的抑制剂氨氯吡嗪脒的结合位点(Counillon，L.等.(1993)，美国国家科学院学报.904508-4512)(图3A)。另外，真核生物Na+/H+反向转运载体中的第6和第7跨膜区高度保守，因此，推测其在Na+和H+的运输中起重要作用(Orlowski，J.和Grinstejn，S.(1997)，生物化学杂志.27222373-22376)。OsNHXl氨基酸序列中的第5和第6个跨膜区与这些区域表现出高度的一致性(图3B)。以上结果显示OsNHXl编码的蛋白具有Na+/H+反向转运载体的活性。
表1OsNHXl与其它Na+/H+反向转运载体的氨基酸序列一致性(％)OsNHXl NHX1NHE6NHElNHE2NHE3NHE4OsNHXl10029.533.030.129.426.727.7NHXl100 36.128.629.129.332.0NHE6100 31.929.131.828.6NHEl100 48.937.145.5NHE2100 44.766.0NHE3100 44.6NHE4100按照NJ方法，制作了迄今为止已报道的各种Na+/H+反向转运载体的树状图，这些转运载体即哺乳动物NHE、芽殖酵母(酿酒酵母)NHXl和NHAl、Sod2(预测其在粟酒裂殖酵母的胞质膜上表达)、酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZSod3、大肠杆菌NhaA和NhaB、以及OsNHXl(在图中注为“OsNHXl”)，树状图揭示出其中三个，也就是NHXl、NHE6和OsNHXl构成一个群(图4)。已有报道表明NHXl蛋白在晚期内体中表达(Nass，R.和Rao，R.(1998)，生物化学杂志.27321054-21060)，NHE6蛋白也在细胞内表达(Numata，M.，Petrecca，K.，Lake，N.和Orlowski，J.(1998)，生物化学杂志.2736951-6959)。因此，预测OsNHXl蛋白是在细胞器如液泡等内表达，并且在这些细胞器的Na+运输中起重要作用。
表达水稻Na+/H+反向转运载体基因的转化水稻的产生用KpnI和NotI切出插入在pBluescript KS+(STRATAGENE)的BamHI位点的OsNHXI。然后，将OsNHXl插入pMSHl(需高度表达时)以及pMSH2(需抑制表达时)中花椰菜花叶病毒35S启动子下游，这两种载体均来自Ti质粒，且转有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因(pMSH1Kawasaki，T.等(1999)，美国国家科学院学报.9610922-10926；pMSH2多克隆位点的方向与pMSH1的相反)。利用构建好的载体，通过根癌农杆菌转化水稻愈伤组织。愈伤组织从种子诱导，以农杆菌感染后，利用潮霉素完成筛选。筛选出的愈伤组织经过分化来获得转化植物。转化和分化基本上按照Toki的方法(Toki，S.(1997)，植物分子生物学.15，16-21)来进行。
工业应用性根据本发明可以预期，分离的Na+/H+反向转运载体基因能够通过其在植物中的表达而赋予植物耐盐性。因此，通过将该基因转入诸如水稻等有用作物，由于耐盐性的提高，可以使这些作物在如干旱等土地上抵御盐的危害，从而可能有助于，如作物产量的提高。
权利要求
1.一种选自下组的DNA，该组包括(a)一种DNA，其编码含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质；(b)一种DNA，其包括SEQ ID NO1所示碱基序列的编码区。
2.一种编码来自单子叶植物纲的Na+/H+反向转运载体的DNA，该DNA选自(a)一种DNA，其编码含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质，所述序列中已取代、删除、插入和/或添加了一个或多个氨基酸；(b)一种DNA，其在严谨条件下可与包含SEQ ID NO1所示碱基序列的DNA杂交。
3.权利要求2的DNA，其中的单子叶植物纲是属于禾本科的植物。
4.一种载体，其包含权利要求1或2中的DNA。
5.一种转化细胞，其含有权利要求1或2中的DNA或含有 4中的载体。
6.权利要求5中的转化细胞，所述细胞是植物细胞。
7.一种蛋白，该蛋白由权利要求1或2中的DNA编码。
8.一种生产权利要求7中蛋白的方法，其包含如下步骤培养权利要求5中的转化细胞，以及从该细胞或其培养物上清中回收所表达的蛋白质。
9.一种转化植物，其包含权利要求6中的转化细胞。
10.权利要求9中的转化植物，所述植物是单子叶植物。
11.权利要求10中的转化植物，所述植物是属于禾本科的植物。
12.权利要求11中的转化植物，所述植物是水稻。
13.一种转化植物，该植物是权利要求9～12中任一项的转化植物的后代或克隆。
14.一种用来培植权利要求9～13中任一项的转化植物的材料。
15.一种可与权利要求7中蛋白结合的抗体。
16.一种核酸分子，其可与SE ID NO1所示DNA杂交，且该分子的链长度为至少15个核苷酸。
全文摘要
本发明成功地克隆了水稻Na
文档编号C12N15/82GK1342203SQ99816068
公开日2002年3月27日 申请日期1999年12月22日 优先权日1998年12月22日
发明者福田笃德, 田中喜之 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所