引入二硫键的转谷氨酰胺酶的制作方法

专利名称：引入二硫键的转谷氨酰胺酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及放线菌来源的转谷氨酰胺酶的突变体蛋白。转谷氨酰胺酶(也简称为TG)通过使蛋白质之间形成交联键合而产生凝胶状物质，因此在 食品加工等方面有广泛的应用。转谷氨酰胺酶突变体TG的热稳定性、pH 稳定性得以提高，这使得提高TG的保存稳定性、在高温下进行反应、扩大 可进行反应的pH成为可能，从而该酶在新领域的应用成为可能。
背景技术：
转谷氨酰胺酶是催化蛋白质的肽链内的？羧酰胺基的酰基转移反应的 酶。该酶作用于蛋白质时可引起s-(Y-Glu)-Lys交联形成反应、Gln通过脱酰 胺化而转变为Glu的取代反应。作为转谷氨酰胺酶，目前已知有动物来源 的谷氨酰胺酶和微生物来源的谷氨酰胺酶。前者是Ca^依赖性酶，分布在 动物的脏器、皮肤、血液等中。例如，豚鼠肝脏转谷氨酰胺酶(非专利文献 1)、人表皮角蛋白细胞转谷氨酰胺酶(非专利文献2)、人凝血因子XIII(非专 利文献3)等。关于后者，在链霉菌属(Streptomyces)的细菌中发现了非Ca2+ 依赖性的酶。实例包括灰肉色链霉菌(Streptomyces griseocarneus) NBRC 12776、肉桂色链霉菌(Streptomycescinnamoneus)NBRC 12852、茂原链霉菌 (Streptomyces mobamensis) NBRC 13 819等。这其中，将在茂原链霉菌的变 体的培养上清中发现的转谷氨酰胺酶称为 MTG (Microbial Transglutaminase,微生物转谷氨酰胺酶)。而且，在利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) NRRL B-3446中也发现了非Ca"依赖性转谷氨酰胺酶(专利文献1)。 肽图谱分析和基因结构分析的结果表明，这些微生物产生的转谷氨酰胺酶 的一级结构与动物来源的酶之间完全不具有同源性(专利文献2)。MTG是由331个氨基酸构成的分子量约38,000的单体蛋白(非专利文 献4)。 MTG是从上述菌类等的培养物通过纯化操作来生产的，因此在供给 量、效率等方面存在问题。此外，人们还尝试了通过基因工程方法进行转 谷氨酰胺酶的生产。已经报告了下述方法利用大肠杆菌(E.coli)、酵母等(专利文献3);使用大肠杆菌以蛋白质包涵体形式表达 MTG后，用蛋白质变性剂使该包涵体可溶化，再经过脱变性剂处理而复性， 从而生产有活性的MTG的方法(专利文献4);用谷氨酸纟奉4干菌 (Corynebacterium glutamicum)分泌表达MTG的方法(专利文献5)。与动物来 源的转谷氨酰胺酶不同，以MTG为代表的微生物来源的转谷氨酰胺酶是非 Ca^依赖性的，因此在果冻(if U—)等凝胶化食品、酸乳酪、干酪或凝胶状 化妆品等的生产和食用肉类的肉质改善等方面有所应用(专利文献6)。此外， 该酶还应用于热稳定微胶嚢的原材料、固定化酶载体等的生产等，是工业 实用性强的酶。关于酶反应条件，例如对于凝胶化食品，酶反应时间短则 不凝固，相反，反应时间过长则过硬，无法作为商品。所以，当将MTG用 于果冻等凝胶化食品、酸乳酪、干酪或凝胶状化妆品等的生产或食用肉类 的肉质改善等方面时，通过调节底物和酶的浓度、反应温度、反应时间来 制作目的产物。然而，随着利用MTG的食品或试剂等的多样化，有些情况 下仅依靠调节浓度、温度、时间等，无法制作出目的产品，这样就有必要 对MTG的酶活性进行改进。已知野生型MTG(野生型MTG是指天然存在的、未发生氨基酸序列的 修饰的MTG)在pH约4 10之间是稳定的，虽然可以认为其在比较宽的pH 范围内是稳定的，但它在极端酸性或碱性条件下的反应仍是困难的。此外， 野生型MTG的最适温度为约55°C,在很高的温度下进行反应也是困难的。 此外，即使是在比该最适温度低的温度下，长时间的温育也会导致酶活性 降低。因此，可以认为，如果存在pH稳定性、热稳定性等提高的突变体转 谷氨酰胺酶，则有望将转谷氨酰胺酶应用于新的用途。目前为止，MTG主要应用于食品领域。但其已经显示出应用于纤维、 化学合成品(照相胶片、鞣皮)、饲料、化妆品、药物等各种用途的可能性。在纤维领域，已知使用转谷氨酰胺酶进行羊毛的改性。即，已知通过 使用转谷氨酰胺酶处理羊毛，能够在保持质感的同时赋予防缩性、抗起球 性和疏水性(专利文献8)。可以认为当将转谷氨酰胺酶用于羊毛时，如果 能够高温短时间地实施与角蛋白的反应，则有望实现增大单位时间的处理 量，从而提高生产效率，因此在产业上是有用的。鞣皮(皮& & L)是指对动物的皮(hide/skin)实施由多个工序组成的处 理、加工，从而将皮加工成为具有耐久性、柔软性的革，该加工是使用65铬是有害的，不宜排放到环境中，因此亟需开发替代方法。关于转谷氨酰胺酶在鞣皮中的应用，专利文献9中公开了在鞣皮中可以使用微生物来源的转谷氨酰胺酶，但并没有实际作用于皮的实施例，尚未达到实用化。使用6价铬的交联是在pH3 4进行的， 因此希望转谷氨酰胺酶最好也能在该pH下反应，然而由于MTG不耐酸性， 实际应用中存在困难。由上可见，在纤维加工、鞣皮等用途中，提高转谷氨酰胺酶的热稳定 性(即耐热性)使其在高温下短时间内结束反应，和提高其pH稳定性使其能 够在酸性范围进行反应，是人们所期望的。如上所述，作为改良、提高转谷氨酰胺酶的酶活性的方法，除了对反 应条件进行研究以外，还包括例如对转谷氨酰胺酶自身的改性，即提高转 谷氨酰胺酶的热稳定性、提高pH稳定性等。例如，通过提高热稳定性，可 望进一步扩展适用对象，提高反应速度等。此外，通过提高pH稳定性，将 有可能在更广泛的pH范围下进行酶反应或保存。这在工业化方面也会是有 利的。为了改良MTG的耐热性和/或pH稳定性，必须制备MTG的突变体， 并对其活性等进行评价，找出优异的突变体、即耐热性和/或pH稳定性有 所提高的突变体。对突变体的制备而言，对野生型的基因进行操作是必要 的，因此，能够制备基因重组蛋白质就成为了 一个必要条件。对MTG而言， 已经建立了使用谷氨酸棒杆菌的分泌表达系统(专利文献5)。棒状杆菌的分泌表达系统已知的有Sec系统和Tat系统。Sec系统的特 征是蛋白质以形成高级结构前的状态被分泌；而Tat系统的特征是蛋白质在 细胞内形成高级结构后，透过细胞膜而被分泌(J. Biol. Chem. 25; 273(52): 34868-74， 1998)。 Sec系统广泛存在于从大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等原核生 物直至酵母、霉菌乃至人类等真核生物中，是最主要且常规的蛋白质分泌 途径。而Tat系统可以有效地分泌Sec系统难以分泌的异种蛋白质(专利文 献10)。对于MTG而言，使用Sec系统、Tat系统中的任何一个均可进行分 泌，因此，当由于》务饰而造成使用Sec系统分泌困难时，也可以尝试用Tat 系统进行分泌。内部的疏水性核心的堆积或者稳定二级结构中的a螺旋等的方法；或者排 除导致蛋白质结构不稳定的因子的方法。为了通过二硫键的导入来提高蛋 白质的稳定性，有必要探索适于导入半胱氨酸的位置。专利文献1特表平10-504721号公报专利文献2欧洲专利公开公报0 481 504 Al专利文献3特开平5-199883号公报专利文献4特开平6-30771号公报专利文献5国际公开第2002/081694号小册子专利文献6特开昭64-27471号公报专利文献7特开2001-321192号公报专利文献8特开平3-213574号公报专利文献9美国专利6,849,095号说明书专利文献10国际公开第2005/103278号小册子非专利文献1 K.Ikuraetal., Biochemistry, 27, 2898， 1988非专利文献2 M.A. Phillips etal., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A， 87， 9333， 1990非专利文献3 A. Ichi簡eetal.， Biochemistry, 25， 6900， 1986 非专利文献4T. Kanajietal., Journal of Biological Chemistry. 268, 11565, 199
发明内容发明所要解决的问题本发明的目的是提供与野生型(以下亦简称WT)转谷氨酰胺酶相比耐 热性和/或pH稳定性有所提高的转谷氨酰胺酶突变体蛋白，使得高温下短 时间的酶反应和/或更宽的pH范围的酶反应成为可能，从而提供适用于纤 维加工、鞣皮等的转谷氨酰胺酶。解决问题的手段本发明者为解决上迷问题进行了深入研究，结果发现，通过在WT转 谷氨酰胺酶蛋白的氨基酸序列中的特定位置上导入突变使之成为可形成二 硫键的半胱氨酸，可以制备耐热性和/或pH稳定性提高的转谷氨酰胺酶突变体蛋白，从而完成了本发明。概括说来，本发明列举如下。[1] 一种蛋白质，其具有转谷氨酰胺酶活性，且具有下述(A)、 (B)、 (C)或(D) 的氨基酸序列(A) 在SEQ ID NO: 2中具有选自下述a) i)中的至少1种突变的氨基酸 序列a) 第7位和第58位被取代成半胱氨酸、b) 第46位和第318位被取代成半胱氨酸、c) 第93位和第112位被取代成半胱氨酸、d) 第106位和第213位被取代成半胱氨酸、e) 第160位和第228位被取代成半胱氨酸、f) 第2位和第282位一皮取代成半胱氨酸、g) 第2位和第283位被取代成半胱氨酸、h) 第3位和第283位被取代成半胱氨酸、i) 第17位和第330位被取代成半胱氨酸；(B) 在(A)的序列中，除了 a) i)的突变以外，还具有1个 数个残基的取 代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(C) 在下述氨基酸序列中的选自与SEQ ID NO: 2的a) i)相对应的位置 中的至少1个位置上具有突变的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10和12中的氨基酸序列，或者与选自SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 10和12中的氨基酸序列具有70%以上的同源性且具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的氨基酸序列；或(D) 在(C)的序列中，除了与SEQIDNO: 2的a) i)中所述的位置相对应 的位置的突变以外，还具有1个 数个残基的取代、缺失、添加和/或插入的 氨基酸序列。[2]编码上文[l]所述的蛋白质的多核苷酸。[3]包含上文[2]所述的多核苷酸的重组载体。[4]用上文[3]所述的重组载体转化过的宿主细胞。[5] —种生产上文[l]所述的蛋白质的方法，其特征在于，培养上文[4]所述的宿主细胞，并收集具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质。[6] —种加工底物蛋白质的方法，包括使上文[l]所述的蛋白质、釆用上文[5]作用于所述底物蛋白质的步骤。[7]上文[6]所述的方法，其中，底物蛋白质的加工在40。C 100。C进行。 [8]上文[6]所述的方法，其中，底物蛋白质的加工在pH3 4的条件下进行。发明的效果根据本发明，通过对WT转谷氨酰胺酶的修饰，能够提供耐热性和/或 pH稳定性有所提高的转谷氨酰胺酶。进一步，通过使用耐热性和/或pH稳 定性有所提高的转谷氨酰胺酶，能够提供新产品和新技术。附图简要说明

图1显示了各突变体在所示温度下加热10分钟后的残存活性(％)。 图2显示了在50。C加热1、 2和3小时后的T7-E58 (7/58)突变体的残存 活性(％)。图3显示了在各pH区域中T7-E58 (7/58)突变体的残存活性(。/c)。 图4显示了 MTG与各种放线菌来源TG的氨基酸序列的比对。保守的 氨基酸残基用*表示。图5显示了各突变体在60。C加热10分钟后的残存活性(％)。 图6显示了各突变体在6(TC加热10分钟后的残存活性(％)。 图7显示了在pH3、pH6、pH12保持1小时后，各突变体的残存活性(％)。实施发明的最佳才莫式以下，具体地说明本发明。转谷氨酰胺酶广泛应用于明月交、干酪、酸 乳酪、豆腐、鱼糕(蒲鋅)、火腿、香肠、面条等食品的生产以及食用肉类的 肉质改善等方面(特开昭64-27471号)。此外，该酶还在产业上用于各种目 的，例如用于热稳定的微胶嚢的原材料、固定化酶载体等的生产等。转谷 氨酰胺酶催化蛋白质分子的肽链内的谷氨酰胺残基的y-羧基酰胺基的酰基 转移反应。如果以蛋白质分子中的赖氨酸残基的s-氨基作为酰基受体进行 作用，则在蛋白质分子中及分子间形成s-(y-G1u)-Lys键。 大体分为动物来源的Ca"依赖性转谷氨酰胺酶和微生物 来源的非Ca"依赖性转谷氨酰胺酶。作为微生物来源的TG，已知由放线菌来源的TG。各种放线菌来源的TG的核苷酸序列和氨基酸序列的代表例如 下表所示。表1放线菌核芬酸序列氨基酸序列茂原链霉菌SEQIDNO:lSEQ ID NO:2肉桂色链霉菌SEQ ID NO:3SEQ ID NO:4新霉素链霉菌SEQ ID NO:5SEQ ID NO:6(Streptomyces fradiae)Streptomyces ladakanumSEQ ID NO:7SEQ ID NO:8利迪链霉菌SEQ ID NO:9SEQ ID NO: 10Streptomyces platensisSEQIDNO:llSEQ ID NO: 12使用除此以外的转谷氨酰胺酶同源物，也可以才艮据本"i兌明书中记载的 方法获得耐热性和/或pH稳定性有所提高的突变体蛋白。具体地说，转谷 氨酰胺酶因微生物的种或抹的不同，其序列有时会存在若干差异，因此， 可以加以修饰以获得本发明的突变体蛋白的转谷氨酰胺酶的氨基酸序列不 限于上述氨基酸序列2、 4、 6、 8、 10和12,只要是具有转谷氨酰胺酶活性 的蛋白质，并且只要是与SEQIDNO: 2、 4、 6、 8、 10或12具有70%、优 选80%、更优选90%、特别优选95%以上、最优选98%以上的同源性的蛋 白质，通过如后文所述的方法实施比对，确定对应的氨基酸残基，就可以 在相应氨基酸残基处导入突变，获得本发明的突变体。而且，此处所称"同 源性"是指同一性。同源性分析例如可以采用"Genetyx ver. 7 (Genetyx Corporation)"的缺省 参数来计算。而且，如下所述的多核苷酸也能够用于本发明的突变体蛋白的制备 所述多核苷酸与所述SEQIDNO: 1、 3、 5、 7、 9或11所述的核香酸序列 的互补序列或与能够由这些序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码 具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质。这里，所谓"严格条件"是指，例如，同源性高的核芬酸序列之间，例 如具有80、 90、 95、 97或99%以上的同源性的核苷酸序列之间发生杂交，10而同源性低于上述的核苷酸序列之间不发生杂交的条件，具体而言，可以列举出在与常规Southern杂交的洗涤条件即60°C 、 lxSSC， 0,1%SDS, 优选0.1xSSC、 0.1%SDS，更优选68。C、 O.lxSSC、 0.1%SDS相当的盐浓度 和温度下，洗涤1次更优选2~3次的条件等。作为探针，也可以使用SEQIDNO: 1、 3、 5、 7、 9或11的核苷酸序 列的部分序列。这样的探针可以以基于该核苷酸序列制备的寡核苷酸为引 物，并以包含SEQIDNO: 1、 3、 5、 7、 9或11的核苷酸序列的DNA片段 为模板，通过PCR来制作。例如，当使用300bp左右长度的DNA片段作 为探针时，作为杂交的洗涤条件可以列举出50°C、 2xSSC、 0.1%SDS。转谷氨酰胺酶例如可以通过对用微生物等(包括后述的转化体)表达、分 泌的产物实施分离、回收、纯化等工序来获得。此外，还可以以表达在微 生物等中的状态使用。所谓"转谷氨酰胺酶活性"，是指如上文所述的那样，形成蛋白质中的 谷氨酰胺残基与赖氨酸残基之间的交联的活性。该转谷氨酰胺酶活性可以 以从微生物等分离、纯化的TG的形式来测定，也可以以表达在微生物中等 的状态来测定。转谷氨酰胺酶活性可以采用氧肟酸根(八,K 口年廿乂 一卜)法 (J.Biol.Chem., 241， 5518-5525, 1966)来测定。氧肟酸根法中的转谷氨酰胺酶活性单位定义如下。即，以千氧羰基-L-谷氨酰胺酰甘氨酸和羟胺作为底物进行反应，在三氯乙酸存在下将生成的 氧月亏酸转化为铁络合物，然后用525nm的吸光度测定它的量。这样根据氧 肟酸的量制作标准曲线，将1分钟生成1微摩尔的氧肟酸根的酶量定义为 转谷氨酰胺酶活性单位的1个单位。该测定方法的详细内容已有报导(参照 例如特开昭64-27471号公报等)。"WT(野生型)转谷氨酰胺酶"，是指未导入氨基酸序列突变的天然存在 的转谷氨酰胺酶。当与WT转谷氨酰胺酶的耐热性和/或pH稳定性相比较， 转谷氨酰胺酶突变体蛋白的耐热性和/或pH稳定性有所"提高"时，该突变体 蛋白是本发明的优选突变体。本说明书中，"耐热性(即热稳定性)的提高"，是指即使在不适合长时间 (例如约10分钟以上)使用WT转谷氨酰胺酶的温度范围(由于长时间的温 育，WT转谷氨酰胺酶的活性显著降低的温度)，例如约50。C以上、优选约55。C以上、优选约6(TC以上、更优选约65r以上、更优选约68。C以上的温 度，酶的活性也能够更长时间地保持。即，"耐热性的提高"，是指当将转谷 氨酰胺酶如上所述范围内的温度(例如约50°C、约55。C、约60。C、约65。C、 约68。C)长时间(例如约1小时、约2小时、约3小时)温育时，其活性降低 的比例，与WT相比有所减小。本发明的转谷氨酰胺酶突变体蛋白是例如在65。C加热IO分钟后、残存 活性为1%以上、3%以上、优选10°/。以上、更优选20%以上的蛋白质。本说明书中，"pH稳定性的提高"，是指在不适合使用WT转谷氨酰胺 酶的pH区域(WT转谷氨酰胺酶的活性显著降低的pH)、例如pH约为4以 下的酸性区域(优选pH为约.3~4)、或者例如pH约为10以上的碱性区域， 酶的活性仍能保持。本发明的优选突变体转谷氨酰胺酶特别地是在酸性区 域的稳定性有所提高的转谷氨酰胺酶。在本发明中，为了提高MTG的耐热性和/或pH稳定性，在MTG基因 中导入变成能够形成二硫键(SS键)的半胱氨酸残基的突变。关于导入突变 的位置，可以如下述地确定。对于MTG成熟体区域中的一级序列上相隔10 个残基以上的2个残基，计算它们在立体结构中的Cp原子间的距离，提取 出距离在5A以内优选4.5A以内的配对(pair)。对于这些配^j",如果其中 任一方的侧链通过氢键与其它残基存在相互作用，或者形成疏水性核，则 形成SS键的修饰可能会破坏原有的稳定性，因此将其从对象中排除。导入突变后，确认碱基序列。突变的导入可以采用各种公知方法，例 ^口可以^f吏用Stratagene 乂>司的QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit等 来简便地进行。本发明的转谷氨酰胺酶突变体蛋白是具有下述氨基酸序列的蛋白质 在SEQIDNO: 2中，(A)具有选自下述a) i)中的至少1种突变的氨基酸序 列a) 第7位和第58位被取代成半胱氨酸，b) 第46位和第318位被取代成半胱氨酸，c) 第93位和第112位被耳又代成半胱氨酸，d) 第106位和第213位被取代成半胱氨酸，e) 第160位和第228位被取代成半胱氨酸，f) 第2位和第282位被取代成半胱氨酸，h) 第3位和第283位被取代成半胱氨酸，i) 第17位和第330位;故取代成半胱氨酸；或者，(B)除了上述突变以外，还具有1个 数个残基的取代、缺失、添加 和/或插入的氨基酸序列。而且，具有下述氨基酸序列的蛋白质也在本发明 的范围内(C) 在选自SEQIDNO: 4、 6、 8、 10和12的氨基酸序列中的选自与 SEQ ID NO: 2的a) i)对应的位置中的至少1个位置上具有突变(取代成半 胱氨酸)的氨基酸序列，或者在与选自SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 10和12 的氨基酸序列具有70%以上(优选80%以上、更优选90%以上、特别优选95% 以上、最优选98%以上)的同源性、且具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的氨 基酸序列中，在选自与SEQ ID NO: 2的a) i)相对应的位置中的至少1个 位置上具有突变(取代成半胱氨酸)的氨基酸序列；或者(D) 在(C)的序列中，除了与SEQ ID NO: 2的a) i)中所述的位置对应 的位置上的突变(被取代成半胱氨酸)以外，还具有1个 数个残基的取代、 缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。上述(B)的氨基酸序列，具体而言是除了选自a) i)中的至少l种突变以 外，在a) i)中所示的各个位置和/或这些位置以外的位置上具有1个~数个 残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。这同样适用于上述(D) 的氨基酸序列。在本说明书中，选自SEQIDNO: 4、 6、 8、 10和12的氨基酸序列中 的"对应"于上述位置的位置，是通过将这些序列与SEQIDNO: 2的氨基酸 序列进^"比对来确定的。此外，还可以将本说明书所示以外的转谷氨酰胺 酶同源物的氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸序列进行比对，来确定"对 应"的位置，并向该位置导入突变。例如，在将SEQIDNO: 2与其它序列 进行比对时导入了缺口的情况下，应该注意以上所述的位置有可能前后偏 移。关于对应的位置，可以参照例如图4。作为氨基酸序列的比对中使用的算法，可以列举NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)、 Karlin等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)所述 的算法[该算法整合在NBLAST和XBLAST程序(versionNucleic Acids Res.， 25: 3389-3402(1997))]、 Needleman等，J. Mol. Biol,, 48: 444-453 (1970)所述的算法[该算法装载在GCG软件包中的GAP程序 中]、Myers和Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)所述的算法[该算法整合在 作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(version 2.0)中]、Pearson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)所述的算法[该算法整 合在GCG软件包中的FASTA程序中]等。除茂原链霉菌来源的转谷氨酰胺酶(MTG)以外，对于确认了与该酶的氨 基酸序列同源性且具有转谷氨酰胺酶活性的酶，或者对于预计具有与该酶 类似的立体结构且具有转谷氨酰胺酶活性的酶，它们的修饰完全可以基于 MTG的立体结构来实施。在MTG中，对于底物特异性等的改变有效的氨 基酸取代，预测在肉桂色链霉菌、利迪链霉菌(特表平10-504721号)等微生 物来源的亲缘酶中也是有效的。就本发明的突变体蛋白而言，只要获得的转谷氨酰胺酶突变体蛋白具 有转谷氨酰胺酶活性，特别是只要其耐热性和/或pH稳定性有所提高即可， 可以只具有1对上述变成半胱氨酸的突变，也可以组合具有多对上述变成 半胱氨酸的突变。这样的蛋白质可以采用本领域公知的方法来制备。对于上述的取代、缺失、添加和/或插入没有特殊限制，只要获得的转 谷氨酰胺酶突变体蛋白具有转谷氨酰胺酶活性，特别是只要其耐热性和/或 pH稳定性有所提高即可。这样的突变体蛋白所具有的取代、缺失、添加和 /或插入的数目理想地为1个 数个残基(1 30个、优选1~15个、更优选1~5 个、3或者2个残基)，但只要该突变体蛋白具有转谷氨酰胺酶活性，特别 是其耐热性和/或pH稳定性有所提高，可以包含任意数目的氨基酸的取代、 插入、增加、缺失。例如，当该突变为取代时，因为预计使用类似氨基酸 来取代(即保守氨基酸取代)不易对蛋白质的功能造成影响，所以优选使用类 似氨基酸来取代。这里，"类似氨基酸"是指在物理化学性质方面类似的氨 基酸，包括例如芳香族氨基酸(Phe、 Trp、 Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、 Leu、 Ile、 Val)、极性氨基酸(Gln、 Asn)、碱性氨基酸(Lys、 Arg、 His)、酸性氨基 酸(Glu、 Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、 Thr)、小侧链氨基酸(Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Met)等分类在同组中的氨基酸。保守氨基酸取代的具体例子是本技术 4贞i或/^^口的。本发明还提供编码本发明的转谷氨酰胺酶突变体蛋白的多核苦酸(称为14本发明的多核苷酸)。这样的多核苷酸可以采用本领域公知的方法(例如本说 明书中记载的方法)取得。使用合适的限制酶，将该多核苷酸插入载体，能 够获得重组载体。本发明的重组载体中使用的载体骨架，可以根据其目的(例如克隆、蛋 白质的表达)适宜地选择和使用，或者可以适宜地选择和使用与载体要导入 的宿主细胞(优选微生物)相匹配的载体骨架。当该重组载体为表达载体时， 该表达载体包含与合适的启动子可操作连接的本发明的多核苷酸，优选在 本发明的多核苷酸的下游包含转录终止信号即终止子区域。而且，还可以 进一步包含用于选择转化体的选择标记基因(药物抗性基因、补全营养缺陷 型突变的基因等)。此外，还可以包含编码可用于分离、纯化表达出的蛋白 质的标签序列的序列等。此外，载体可以重组到对象宿主细胞的基因组中。载体可以釆用例如感受态细胞法、原生质体法、磷酸4丐共沉淀法、聚 乙二醇法、锂法、电穿孔法、显微注射法、脂质体融合法、粒子枪法等公 知的转化技术导入对象宿主细胞内。本发明还提供用这样的重组载体转化过的宿主细胞(以下也称本发明的 转化体)。作为宿主细胞，可以列举大肠杆菌和放线菌等原核细胞、以及酵 母等真核细胞。在希望表达蛋白质的情况下，该宿主细胞为适合蛋白质生 产、且能够以有功能的形式表达本发明的突变体蛋白的宿主细胞。本发明 的转化体可以采用上述转化技术获得。任何已经开发出可使用的重组载体 系统的微生物均可用作宿主细胞，但作为优选的宿主细胞，可以列举大肠 杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母、芽孢杆菌属细菌、各种放线菌等，但不限于 此。培养的温度、时间、培养基组成、pH、搅拌条件等可以根据培养的转化体 适宜选择。本发明的转谷氨酰胺酶突变体蛋白可由本发明的转化体来表达。转谷 氨酰胺酶突变体蛋白可以从该转化体中分泌出来^吏用，也可以从该转化体 分离、纯化出来使用，还可以以包含该突变体蛋白的转化体的形式直接使 用。蛋白质的分离、纯化可以按照本身公知的方法来实施此外，本发明的转谷氨酰胺酶突变体蛋白，可以以前体的形式表达， 然后用合适的蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶)处理使其成为成熟体；或者可以使前体和蛋白酶在同时对象宿主细胞中表达来获得成熟体。所得转化体的培养、以及转谷氨酰胺酶突变体蛋白的分离、纯化例如可以如下地进行。将含卡那霉素的CM2G培养基分装在试管中。向其中接 种转化体，30。C进行24小时的前培养。向每个坂口烧瓶中分装含卡那霉素 和CaC03的MM培养基50ml，对前培养液进行传代，继续培养。对培养液 进行离心后，用滤器过滤上清，使用SephadexG25(M)将溶剂更换为20 mM 磷酸緩沖液、pH7.0。添加相当于转谷氨酰胺酶的1/100量的枯草杆菌蛋白 酶，30。C反应16小时，活化转谷氨酰胺酶。使用Sephadex G25(M)，将活 化的溶液交换成阳离子交换色谱的平衡用緩冲液。接着，全部上样于用相 同缓冲液充分平衡的阳离子交换柱(Resource S 6 ml; GE Healthcare bioscience公司制造)。用相同緩沖液进行再平衡后，以波长280nm处的UV 吸收为指标通过0-0.5 M NaCl的直线浓度梯度进行洗脱，分级出NaCl浓 度为200mM附近洗脱出的蛋白质级分。测定级分的活性、蛋白量，回收除 比活性低的级分之外的比活性基本相同的峰顶附近的级分。对于所回收的 级分，使用Sephadex G25(M)将溶剂更换为20 mM磷酸缓沖液、pH6.0。使 用20mM磷酸緩冲液、pH6.0将所得样品的浓度稀释为约lmg/ml,使用之 前在-8(TC保存。本发明还提供使用本发明的转谷氨酰胺酶突变体蛋白或表达该蛋白的 转化体来加工底物蛋白质的方法。作为能够成为转谷氨酰胺酶的底物的蛋 白质，可以列举具有转谷氨酰胺酶能够接近的谷氨酰胺残基和/或赖氨酸残 基的蛋白质。该方法能够适用于希望在不适合使用WT转谷氨酰胺酶的温 度范围和/或pH区域实施蛋白质的交联反应的各种用途(纤维加工、鞣皮等)。例如，本发明的突变体蛋白可以用于在约40。C 约IO(TC、优选约50 °0约IO(TC、更优选约55。C 约IO(TC、更优选约6(TC 约IO(TC、进一步 更优选约65。C 约IO(TC实施的反应。特别是，纤维加工中采用的高温处理 是在至少约65。C的温度实施的，因此本发明的突变体蛋白适于在该纤维加 工中使用。此外，本发明的突变体蛋白可以在pH为约4以下、pH优选约3 约4 的条件下实施的反应中使用。特别是，在鞣皮中优选在pH3 4实施酶反应， 所以本发明的突变体蛋白适于在该鞣皮中使用。本发明的导入了能够形成二硫键的突变的突变体(二硫键导入突变体))的肽图谱分析，来 确认半胱氨酸残基的导入。肽图谱分析可以参考文献(J. Biol. Chem.， 268， 16, 11565-11572, 1993)所述的方法来实施。二硫键的形成可以根据用二硫 苏糖醇等还原剂进行还原后突变体的耐热性降低、基于MS分析的分子量变 化等来确认。实施例以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。在本说明书和附图中，当以缩写符号表示氨基酸等时，各种表示系以 IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Commission on Biochemical Nomenclature) 的缩写符号或本领域中惯用的缩写符号为基础。实施例1 MTG的二硫(SS)键导入突变体蛋白的制备MTG不具有SS键。因而，研究了在MTG中导入SS键能否提高耐热 性。导入SS键的位置是如下地确定的。对于MTG成熟体区域中的一级序 列上相隔IO个残基以上的2个残基，计算其Cp原子间的距离，提取出距离 在5A以内，优选4.5A以内的配对。对于这些配对，如果其中任何一方残 基的侧链通过氬键与其它残基存在相互作用、或者形成疏水性核心，则由 于存在因形成SS键的修饰而破坏原有的稳定性的可能而将该配对从对象中 排除。从其中选出6组推测为能够形成SS键的配对。将这6组分成两类， 每类3个组。即，D46-S318、 E93-V112、 A106-D213这3个配对的温度因 子的值较大(Cp原子的值为约40A2以上)。T7-E58、 A140-P190、 A160-G228 这3个配对的温度因子不是特别高，但存在于分子的较外侧。突变导入方 法是将MTG成熟体区域中的2个位置取代为Cys。取代方法是这样的使用Stratagene公司的QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit,按厂商推荐的方法在前体TG表达质粒pPSPTGl 1 (App. Env. Micro.， 2003， 69, 301 l-3014)中导入突变。突变是否已导入通过4吏用 ABI PRISM Cycle Sequencing Kit、按厂商推荐的方法进行碱基序列分析来确菌)。电穿孔按文献(FEMS Microbiol. Lett, 53, 299-303, 1989)记载的方法实施。将舍25吗/ml卡那霉素的CM2G培养基分装在试管中，每管3ml。在 其中接种突变抹，在3(TC进行24小时的前培养。将含25吗/ml卡那霉素、 5mM DTT和50g/L的CaC03的MM培养基分装在坂口烧瓶中，每个烧瓶 50ml,传代2.5ml的前培养液，30。C培养48小时。A140-P190、 A160-G228 配对的突变体TG的分泌为微量。对于可见TG分泌的其余4个配对的培养 液进行离心(10，000rpm 、 IO分钟)，然后用滤器过滤上清，4吏用 SephadexG25(M)将溶剂更换为20mM磷酸緩沖液、pH7.0。添加相当于MTG 的1/100量的枯草杆菌蛋白酶，3(TC反应16小时，以活化MTG。使用 Sephadex G25(M)，将活化后的溶液交换成阳离子交换色镨的平衡用緩冲液 (20mM乙酸钠緩冲液，pH5.5)。接着，全部上样于用相同緩冲液充分平衡 的阳离子交换柱(Resource S 6 ml; GE Healthcare bioscience ^>司制造)。用相 同缓冲液进行再平衡后，以波长280nm处的UV吸收为指标通过0 — 0.5 M NaCl的直线浓度梯度进行洗脱，分级出NaCl浓度为200 mM附近洗脱出的 蛋白质级分。测定级分的活性、蛋白量，回收除比活性低的级分之外的比 活性基本相同的峰顶附近的级分。活性、蛋白量采用文献(Prot.Exp.Puri., 2002, 26， 329-335)记载的方法测定。对于回收的级分，使用Sephadex G25(M) 将溶剂更换为20mM磷酸緩沖液、pH6.0。而且，色谱全部在室温下进行。 使用20mM磷酸緩沖液、pH6.0将所得样品的浓度稀释为约lmg/ml，使用 之前在-8(TC保存。对于TG分泌为微量的A140-P190、 A160-G228突变体，尝试了用Tat 系统进行分泌。即，以使用了 TorA信号的蛋白谷氨酰胺酶分泌表达质粒 pPKT-PPG (专利文献 10)为模板，以 SEQ ID NO: 13 (5，-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3，)和 SEQ ID NO: 14 (5，-CTTCCCCCGCGCCATTGTCCGCAGTCGCACGTCGCGGCG-3,)戶斤示的 序列为引物，扩增了包含TorA信号序列及其5，上流区域的CspB启动子的 区域。SEQ ID NO: 14所述的序列包含编码TorA信号序列的C末端侧的基 因序列和编码MTG的前体序列的N末端侧的序列。此外，以前述的前体 TG 表达质粒 pPSPTGll 为模板，使用 SEQ ID NO: 15 (5,-GACAATGGCGCGGGGGAAG-3，) 和 SEQ ID NO: 16 (5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTA-3，)所示序列的引物进行 PCR，扩增了编码前体TG的基因序列。将用SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO:14所示序列的引物扩增出的PCR产物和用SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示序列的引物扩增出的PCR产物以1: 1混合作为模板，使用SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 16所示序列的引物进行重叠PCR，扩增了编码CspB 启动子、TorA信号和前体MTG的基因的融合基因。将该PCR产物用Seal 和Eco065I切断，通过琼脂糖凝胶电泳回收了约700bp的基因片段。通过 将该回收的DNA片段插入到pPKSPTGl(W001/23591中记载)的 ScaI-Eco065I区域，制备了前体TG表达质粒pPKT-PTGl 1 。采用前述方法 测定了所制备的碱基序列，确认构建了与预想一致的融合基因。
两个位置取代成Cys,制备了 A140-P1卯突变体和A160-G228突变体。取 代方法按照前述的方法进行。通过电穿孔将带有目的突变的质粒导入谷氨 酸棒杆菌。通过电穿孔将Tat分泌机构表达质粒pVtatABC导入该菌抹中。 电穿孔采用前述方法实施。将含卡那霉素25吗/ml和氯霉素5pg/ml的CM2G 培养基分装在试管中，每管3ml。向其中接种突变抹，在30'C进行24小时 的前培养。将含25|ig/ml卡那霉素、5吗/ml氯霉素和50g/L的CaC03的MM 培养基分装到坂口烧瓶中，每个烧瓶50ml，传代2.5ml前培养液，于3CTC 培养48小时。从培养液的上清出发，按照前述方法利用枯草杆菌蛋白酶进 行活化，利用阳离子交换色谱进行纯化。对于所得突变体，将溶剂更换为 20 mM磷酸緩沖液、pH6.0,使用之前在-8(TC保存。
实施例2 二硫(SS)键导入突变体的耐热性评价
耐热性评价是用加热后的残存活性进行评价的。将D46-S318(46/318)、 E93-VI 12(93/112) 、 A106-D213(106/213) 、 T7-E58(7/58)的浓度调整为 0.5mg/ml后，评价了 55。C、60。C、65。C和68。C加热10分钟后的残存活性(％)。 这些突变体中的任何一个在65°C、 68。C加热后均残留有活性，但野生型 MTG则失活(图1)。对于T7-E58(7/58)突变体，50。C加热1、 2、 3小时，采 用氧肟酸根法评价了残存活性，结果如图2所示，可见耐热性大幅提高。 进一步，将A140-P1卯(140/190)、 A160-G228(160/228)的浓度调整为0.1 mg/ml后，以60。C加热10分钟后的残存活性(％)进行了评价。只有 A160-G228的耐热性可见提高(图5)。实施例3 MTG的二硫(SS)键导入突变体蛋白的制备2 在实施例2中可见T7-E58(7/58)突变体的耐热性大幅提高，因此，进一步研 究了二硫键导入。导入SS键的位置是如下地确定的。对于MTG成熟体区 域中的一级序列上相隔10个残基以上的2个残基，计算其Cp原子间的距离， 提取出距离在5A以内的配对。对于这些配对，如果其中任何一方的残基的 侧链通过氢键与其它残基相互作用、或者形成疏水性核心，则由于存在因 形成SS键的修饰而破坏原有的稳定性的可能而将其从对象中排除。作为推 测能够形成SS键的配对，选出了使N末端附近稳定化的4组即S2-N282、 S2-G283、 D3-G283、 P17-W330。突变导入方法是将MTG的成熟体区域的 两个位置取代成Cys。带有目的突变的质粒的制备方法、保持带有目的突变 的质粒的谷氨酸棒杆菌的制备方法、培养方法均与实施例1相同。S2-N282、 S2-G283、 D3-G283与实施例1相同，从培养上清出发进行利用枯草杆菌蛋 白酶的活化和利用阳离子交换色谱的纯化。对于P17-W330，不进行利用阳 离子交换色谱的纯化，使用SephadexG25(M)将溶剂更换为20mM磷酸缓冲 液、pH6.0，以此作为才羊品。
实施例5 二硫(SS)键导入突变体的耐热性评价2
耐热性的评价是用加热后的残存活性进行评价的。将S2-N282(2/282)、 S2-G283(2/283)、 D3-G283(3/283)的浓度调整为0.1mg/ml后，评价了 60。C加 热10分钟后的残存活性(％)。与野生型相比，这些突变体中的任何一个均 可见耐热性大幅提高(图6)。对于P17-W330,因其未经纯化，故将其浓度 调整为0.1mg/ml后，评价其在60。C加热10分钟后的残存活性与野生型相 比有多大程度的上升。确认了与野生型相比，残存活性上升16%，耐热性 有所提高。
实施例6 二硫(SS)键导入突变体的pH稳定性评价
pH稳定性是用在指定的pH下4。C保持1小时后的残存活性来评价的。 具体地说，将2mg/ml的MTG和T7-E58(7/58)突变体用指定的緩冲液〔0.1M 甘氨酸緩沖液(pH3， 4, 9和10)、 20mM磷酸緩冲液(pH6)〕稀释4倍，4°C 保持1小时后，用20mM磷酸缓沖液、pH6稀释5倍，采用氧將酸根法测 定了活性。结果示于图3，以pH6处的活性为100%。由此可知在酸性区域，T7-E58突变体的pH稳定性比MTG高。
进一步，将0.4mg/ml的MTG和T7陽E58(7/58)、 S2-N282(2/282)、 S2-G283(2/283)、 D3-G283(3/283)用指定的緩冲液(0.1M甘氨酸缓沖液pH3、 0.1M磷酸钠缓沖液pH12)稀释4倍，室温保持l小时后，用0.4M磷酸緩冲 液pH6稀释2倍，采用氧肟酸根法测定了活性。结果如图7所示，以pH6 处的活性为100%。所有突变体在pH3处的耐酸性均有所提高，除2/282以 外的其它突变体在pH12处的耐碱性均有所提高。
序列表自由文本 SEQIDNO: 13: PCR引物 SEQIDNO: 14: PCR引物 SEQIDNO: 15: PCR引物 SEQIDNO: 16: PCR引物
工业实用性
根据本发明，能够提供与WT蛋白质相比较耐热性有所提高的转谷氨 酰胺酶突变体蛋白，从而使得缩短酶反应所需的时间、大量地进行处理成 为可能；此外，还能够提供pH稳定性(特别是酸性pH区域中的稳定性)有 所提高的转谷氨酰胺酶突变体蛋白，从而使得纤维加工、鞣皮等过程中所 要求的高温和/或酸性条件下的酶处理成为可能。
本申请以在日本提交的特愿2007-034916为基础，其全部内容均并入本
容均通过引用并入本说明书中，其程度相当于这些文献的所有内容全部已公开。
权利要求
1一种蛋白质，其具有转谷氨酰胺酶活性，且具有下述(A)、(B)、(C)或(D)的氨基酸序列(A)在SEQ ID NO2中具有选自下述a)～i)中的至少1种突变的氨基酸序列a)第7位和第58位被取代成半胱氨酸，b)第46位和第318位被取代成半胱氨酸，c)第93位和第112位被取代成半胱氨酸，d)第106位和第213位被取代成半胱氨酸，e)第160位和第228位被取代成半胱氨酸，f)第2位和第282位被取代成半胱氨酸，g)第2位和第283位被取代成半胱氨酸，h)第3位和第283位被取代成半胱氨酸，i)第17位和第330位被取代成半胱氨酸；(B)在(A)的序列中，除了a)～i)的突变以外，还具有1个～数个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；(C)在下述氨基酸序列中的选自与SEQ ID NO2的a)～i)相对应的位置中的至少1个位置上具有突变的氨基酸序列选自SEQ ID NO4、6、8、10和12中的氨基酸序列；或者与选自SEQ ID NO2、4、6、8、10和12中的氨基酸序列具有70％以上的同源性且具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质的氨基酸序列；(D)在(C)的序列中，除了与SEQ ID NO2的a)～i)中所述的位置相对应的位置的突变以外，还具有1个～数个残基的取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述的蛋白质的多核苷酸。
3. 包含权利要求2所述的多核苷酸的重组载体。
4. 用权利要求3所述的重组载体转化过的宿主细胞。
5. —种生产权利要求1所述的蛋白质的方法，其特征在于，培养权利要求 4所述的宿主细胞，并收集具有转谷氨酰胺酶活性的蛋白质。
6. —种加工底物蛋白质的方法，其包括使权利要求1所述的蛋白质、采用权利要求5所述的方法生产的蛋白质、或权利要求4所述的宿主细胞作用 于所述底物蛋白质的步骤。
7. 权利要求6所述的方法，其特征在于，底物蛋白质的加工在40°C 100'C进行。
8. 权利要求6所述的方法，其特征在于，底物蛋白质的加工在pH 3~4的 条件下进行。
全文摘要
耐热性和/或pH稳定性有所提高的转谷氨酰胺酶突变体蛋白，它是通过在WT转谷氨酰胺酶中引入转变为能够形成二硫键(SS键)的半胱氨酸残基的突变而获得的。
文档编号C12N15/09GK101631860SQ200880005200
公开日2010年1月20日 申请日期2008年2月14日 优先权日2007年2月15日
发明者伊达雅代, 柏木立己, 横山敬一, 田中精一, 铃木基孝, 铃木荣一郎 申请人:味之素株式会社