专利名称：源自微生物的转谷氨酰胺酶的制备方法
背景技术：
本发明涉及使用浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)(以下略作S.lividans)的宿主-载体体系，通过基因重组方法分泌生产源自放线菌的转谷氨酰胺酶的方法。通过本发明分泌生产的转谷氨酰胺酶被广泛地应用于食品加工和医药等领域中。
通过本发明分泌生产的转谷氨酰胺酶是催化蛋白质肽链内的γ-羧酰胺基的酰基转移反应的酶。该酶作用于蛋白质时，通过ε-(γ-Glu)-Lys架桥形成反应，引起Gln脱酰胺化后转换为Glu的反应。这种转谷氨酰胺酶可用于果子冻等凝胶化食品、酸乳酪、干酪、或凝胶状化妆品等的制造和改善肉类食品的肉质等(特开平1-50382)。另外，该酶可用于制造热稳定性的微胶囊的材料、固定化酶的载体等，因此是产业上利用率高的酶。
到目前为止，已知有源自动物和微生物的转谷氨酰胺酶(微生物转谷氨酰胺酶以下略作“MTG”)。前者是依赖于钙离子的酶，分布在动物的脏器、皮肤、血液等，例如豚鼠肝脏转谷氨酰胺酶(K.Ikuraet al.Biochemistry 27，2898(1988))、人表皮角质细胞转谷氨酰胺酶(M.A.Phillips et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，9333(1990))、人凝血因子XIII(A.Ichinose et al.Biochemistry25，6900(1990))等。
作为源自微生物的转谷氨酰胺酶，例如在链轮丝菌属(Streptoverticillium)细菌中发现的钙非依赖性转谷氨酰胺酶。这样的细菌，例如有灰肉色链轮丝菌(Streptoverticilliumgriseocarneum)IFO 12776、肉桂链轮丝菌肉桂亚种(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.cinnamoneum)(以下略作S.cinnamoneum)IFO 12852、茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)(以下略作S.mobaraense)IFO 13819等(特开昭64-27471)。肽谱和基因结构解析的结果表明，微生物生成的这些转谷氨酰胺酶的一级结构与源自动物的转谷氨酰胺酶完全没有同源性(欧洲专利公开公报0481504 A1)。
源自微生物的转谷氨酰胺酶(MTG)由于是从上述菌类的培养物经纯化制备的，所以在供给量、效率等方面都存在问题。此外，正在尝试通过基因工程方法来制备转谷氨酰胺酶。关于转谷氨酰胺酶蛋白质及其基因，例如已在特开昭64-27471；Biosci.Biotech.Biochem.，58，82-87(1994)；Biosci.Biotech.Biochem.，58，88-92(1994)，特开平5-199883；Biochimie，80，313-319(1998)；Eur.J.Biochem.，257，570-576(1998)；WO 96/06931、WO 96/22366等文献中报道过。其中，例如有利用浅青紫链霉菌、米曲霉菌(Aspergillusoryzae)、大肠杆菌(Escherichia coli)(以下略作E.coli)等宿主-载体体系表达生产的报道。除此之外，还有在大肠杆菌、酵母等微生物中分泌表达(特开平5-199883)的方法，以及通过大肠杆菌将MTG以非活性融合蛋白质包涵体形式表达后，再用蛋白质变性剂溶解，经去除变性剂使其复性来生产有活性的MTG的方法(特开平6-30771)的报道。然而，按照以往方法由微生物分泌表达时，存在着其表达量非常少的问题。而关于转谷氨酰胺酶在链霉菌中的分泌生产，作为具体分泌蓄积量有记载的例子，虽然有利用浅青紫链霉菌作为宿主，通过基因重组方法导入源自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因的报道，但其分泌量只有0.1mg/l左右(Biosci.Biotech.Biochem.，58，82-87(1994)，特开平5-199883)。
发明公开本发明的目的在于，提供在链霉菌属细菌中大量分泌生产转谷氨酰胺酶来大量制备转谷氨酰胺酶的方法。
本发明的方法是大量制备转谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，利用放线菌链霉菌的宿主-载体体系，使用源自放线菌的转谷氨酰胺酶基因，即，用信号肽区和前体结构区以及成熟基因结构区、以及调控该转谷氨酰胺酶基因表达的其原有的(天然的)启动子区构建在链霉菌属细菌内可高效表达的表达型质粒，然后将该表达型质粒导入链霉菌属细菌，通过培养，使带有前体结构部分的转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶原)在初期至中期阶段分泌，在培养后期通过源自链霉菌属细菌的蛋白酶等将前体结构部分切除，获得成熟型(活性型)的转谷氨酰胺酶。
附图的简单说明
图1表示表达用质粒pUJ-MTG的构建顺序。
实施发明的最佳方式根据本发明的方法，利用链霉菌属细菌作为宿主-载体体系，制作在转谷氨酰胺酶基因原有的启动子下游结合含有前体结构部分的转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶原)基因的表达构建物，然后将该表达构建物导入链霉菌属细菌内进行表达，分泌到菌体外的转谷氨酰胺酶原再用该链霉菌属细菌自身生成的蛋白酶等切除前体结构部分，就可大量得到成熟型(活性型)转谷氨酰胺酶。
已知分泌型蛋白质一般以前肽或前肽原形式翻译后，经翻译后修饰成为成熟型蛋白质。即，一般以前肽或前肽原形式翻译后，切除信号肽(前导部分)后转变为成熟肽或肽原，肽原再经蛋白酶处理，切除前体部分后转变为成熟型肽。转谷氨酰胺酶就是这样一种蛋白质。在本说明书中，带有信号肽和前体部分两者的转谷氨酰胺酶、即初级翻译产物有时称之为“前转谷氨酰胺酶原”，而没有信号肽但带有前体部分的称之为“转谷氨酰胺酶原”。转谷氨酰胺酶原的前体部分有时也称之为“前体结构部分”或简单称之为“前体结构”，在本说明书中蛋白质的“前体结构部分/前体结构”和“前体部分”之间可互换使用。因此，“转谷氨酰胺酶原”也称之为“附加了前体结构部分的转谷氨酰胺酶”。
在本说明书中，所谓“切除”前体部分的蛋白质是指通过切断肽键切除构成前体部分的至少一个以上的氨基酸的蛋白质，其中包括该蛋白质N末端区与天然成熟型蛋白质的N末端区完全一致的蛋白质，也包括只要具有该蛋白质活性，与天然蛋白质相比N末端多出一个以上源自前体部分的氨基酸的蛋白质和与天然成熟型蛋白质相比氨基酸序列短的蛋白质。在本说明书中，“成熟型转谷氨酰胺酶”和“活性型转谷氨酰胺酶”表示相同的含义。
本发明使用的基因构建物一般在适当的位置具有包括启动子、编码前转谷氨酰胺酶原的核酸片段、以及目的蛋白基因在链霉菌属细菌中表达所必需的调控序列等的适当序列。可用于构建该构建物的载体没有特别限制，只要在链霉菌属细菌中能够发挥作用即可，可以是质粒等在染色体外自主增殖的载体，也可以是整合到细菌染色体的载体。优选源自链霉菌属细菌的质粒。这样的质粒，例如pIJ702(J.Gen.Microbiol.，129，2703-2714(1983))及其改良后的质粒等。
在本发明的方法中，在链霉菌属细菌中表达转谷氨酰胺酶基因时使用的启动子是放线菌的转谷氨酰胺酶基因原有的启动子。然而，在某些情况下无法确定启动子区，这是由于与大肠杆菌相比放线菌中的启动子的共有序列还不明确的缘故。在这样的情况下，可以利用包括完全覆盖转谷氨酰胺酶的结构基因以及调控其表达所需启动子区的5′上游区的基因片段。
本发明可利用的转谷氨酰胺酶基因没有特别限定，优选使用源自肉桂链轮丝菌IFO 12852、灰肉色链轮丝菌IFO 12776、茂原链轮丝菌IFO 13819、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)[WO 96/06931]等放线菌的分泌型转谷氨酰胺酶基因。其中，特别优选的是源自肉桂链轮丝菌或茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因，并与这些转谷氨酰胺酶基因原有的(天然的)启动子一起使用。
序列表序列号1给出了本发明人等测定的含有源自肉桂链轮丝菌IFO 12852的转谷氨酰胺酶基因部分5′上游区的全长碱基序列，序列号2给出了该碱基序列编码的氨基酸序列。据推测，氨基酸序列中从第1位到第32位的序列是前导部分序列，第33位到第86位的序列为前体部分序列，第87位到第416位的序列为成熟型转谷氨酰胺酶序列。
另外，序列号3给出了含有源自茂原链轮丝菌IFO 13819的转谷氨酰胺酶基因部分5′上游区的全长碱基序列，序列号4给出了该序列编码的氨基酸序列。氨基酸序列中从第1位到第31位的序列是前导部分序列，第32位到第76位的序列为前体部分的序列，第77位到第407位的序列为成熟型转谷氨酰胺酶序列。
本发明使用的基因构建物导入链霉菌属细菌的方法没有特别限定，可以利用通常使用的方法，例如原生质体法(Gene，39，281-286(1985)；特开平3-251182)、电穿孔法(Bio/Technology，7，1067-1070(1989))等方法。得到的转化体可以按照通常使用的方法和条件进行培养。例如，培养上述微生物的培养基可以使用含有碳源、氮源和无机离子的普通培养基。进而为了获得高增殖率，可添加维生素、氨基酸等有机微量营养素，聚胨、酵母提取物等天然材料。作为碳源，可以适当地使用可溶性淀粉、葡萄糖或蔗糖等碳水化合物，有机酸，醇类以及其他碳源。培养控制在好氧条件下，pH5.0～8.5、温度15℃～37℃等适当的范围内进行，培养1天～2周左右。
作为氮源，可以使用氨气、氨水、铵盐和其他氮源。作为无机离子，根据需要可以适当使用镁离子、磷酸根离子、钾离子、铁离子以及其他离子。通过在上述条件下培养转化体，使前转谷氨酰胺酶原在菌体内大量生成，并以转谷氨酰胺酶原形式分泌到菌体外，然后通过链霉菌属细菌本身在该培养条件下分泌生成的蛋白酶在培养基中进行切割，结果使得成熟型(活性型)转谷氨酰胺酶大量蓄积在培养液中。
通过本发明分泌生产的转谷氨酰胺酶根据其各种特性，可以按照业内人士熟知的方法从培养后的培养基中分离纯化。例如，通过离心分离除去菌体后，再通过硫酸铵或乙醇沉淀、离子交换色谱、亲合色谱、高速液相色谱、等电聚焦电泳、凝胶过滤等适宜的已知方法，或通过组合这些方法进行分离纯化。
实施例实施例1.源自肉桂链轮丝菌IFO 12852的转谷氨酰胺酶基因的获得源自肉桂链轮丝菌CBS683.68的转谷氨酰胺酶基因的序列已经测定(Biochimie.，80，313-319(1998))。参考该序列，合成序列号5和6所示的引物，通过PCR法从按照斋藤、三浦的方法(Biochim.Biophys.Acta.，72，619(1963))制备的肉桂链轮丝菌IFO12852的染色体DNA中扩增成熟转谷氨酰胺酶序列的编码区域。在PCR反应中使用Pyrobest DNA聚合酶(宝酒造社制)，反应条件遵循该说明书提供的方案。(序列号5)5’-TCCGATGACCGGGAAACTCCTCCCGCCGAG-3’(序列号6)5’-CGGCCAGCCTTGCTCCACCTTGGCGGGGGC-3’<序列表说明>序列号5用于扩增源自肉桂链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因的PCR引物序列号6用于扩增源自肉桂链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因的PCR引物然后，约960bp的DNA扩增片段用Random Primer DNA LabelingKit Ver.2(宝酒造社制)和[α-32P]dCTP，按照说明书附带的方案进行反应，制备DNA探针。用制备的探针和肉桂链轮丝菌IFO 12852的染色体DNA，按照《分子克隆》第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，冷泉港实验室出版，p9.31(1989))记载的方法进行Southern blot杂交，可以确认用限制酶BamHI切出的约3.5kb的片段中存在着转谷氨酰胺酶基因。用EASYTRAP Ver.2(宝酒造社制)由琼脂糖凝胶电泳回收BamHI消化肉桂链轮丝菌IFO 12852的染色体DNA得到的约3.5kb的片段，将该片断插入到pUC18的BamHI位点后，导入大肠杆菌JM109(宝酒造社制)的感受态细胞，制作文库。使用先前制备的转谷氨酰胺酶的DNA探针，按照《分子克隆》第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，冷泉港实验室出版，p1.90(1989))记载的一般程序进行菌落杂交，进行文库的筛选，获得携有转谷氨酰胺酶基因片段的克隆质粒的菌株，从该菌株回收质粒，取名为pB3.5。
在测定pB3.5的克隆片段的碱基序列时，可以确认肉桂链轮丝菌IFO 12852的转谷氨酰胺酶基因与肉桂链轮丝菌CBS683.68的转谷氨酰胺酶基因具有大致相同的碱基序列。另外，转谷氨酰胺酶基因的插入方向为pUC18的多克隆位点中由EcoRI至HindIII的方向。使用Di-Terminator Cycle Sequencing kit(PE Applied Biosystems公司制)和DNA测序仪373(PE Applied Biosystems公司制)测定碱基序列。
序列号1和2分别给出了测定的碱基序列和该碱基序列编码的氨基酸序列。据推测，氨基酸序列中第1位到第32位的序列是前导部分的序列，第33位到第86位的序列为前体部分的序列，第87位到第416位的序列为成熟型转谷氨酰胺酶的序列。实施例2.转谷氨酰胺酶基因表达用质粒的构建1)质粒载体(pIJ702)的获得pIJ702的制备按照[J.Bacteriol.，162，406-412(1984)；J.Bacteriol.，169，1929-1937(1985)]的方法进行。具体来说，浅青紫链霉菌66用pIJ702转化后获得的浅青紫链霉菌3131(ATCC 35287)(J.Gen.Microbiol.，129，2703-2714(1983))在以下的条件，于30℃培养2天。[YEME培养基+0.5％甘氨酸+50μg/ml硫链丝菌肽]0.3％ 酵母提取物0.5％ 蛋白胨0.3％ 麦芽提取物0.1％ 氯化镁1.0％ 葡萄糖34.0％ 蔗糖0.5％ 甘氨酸0.10％ 50mg/ml硫链丝菌肽溶液(Sigma二甲基亚砜溶液)(pH7.0)将在上述条件下培养的培养基200ml离心分离(12,000g，4℃，10分钟)，用50mM Tris-HCl(pH8.0)-5mM EDTA-50mM NaCl洗涤后，将得到的菌体悬浮于10ml的50mM Tris-HCl(pH8.0)-10mMEDTA-25％蔗糖(以下略作“TE-蔗糖”)溶液中。然后加入含有30mg/ml溶菌酶(Sigma)的TE-蔗糖2ml和0.25M EDTA 4ml，于37℃温育30分钟后，加入20％ SDS 2ml，再加入5M NaCl 5ml，缓慢搅拌后，于0℃温育过夜。然后，向离心分离(100,000g，4℃，40分钟)得到的上清中加入30％聚乙二醇6000并使之终浓度为10％，于0℃温育4.5小时。然后离心分离(900g，4℃，5分钟)，将沉淀溶解于10mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM EDTA-50mM NaCl中。然后加入将16.8g氯化铯和浓度为10mg/ml的溴乙锭溶解于10mM Tris-HCl(pH8.0)-1mM EDTA(以下略作“TE”)中制备得到的溶液1.2ml，通过离心分离(1,300g，室温，15分钟)去除残余物后，再进行离心分离(230,000g，20℃，12小时)。离心后在紫外线照射下，分离提取质粒DNA层，用TE饱和的丁醇反复进行3次萃取操作，除去溴乙锭。再用TE于4℃透析过夜后，用TE饱和的酚萃取一次、用氯仿·异戊醇萃取2次，回收水层。然后加入1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)溶液和2倍体积的乙醇，于-80℃静置30分钟，通过离心分离(12,000g，4℃，15分钟)回收沉淀，用70％乙醇洗涤后，进行干燥，溶解于200μl TE中。得到大约10μg的质粒DNA。2)构建表达用质粒首先制作在放线菌(Streptomyces)和大肠杆菌两者中都可复制的穿梭载体。用SacI和PstI酶切放线菌多拷贝质粒pIJ702(约5.8kb)，制备除去了mel(酪氨酸激酶基因)启动子区的大小为5.1kb的片段。然后用HindIII和PstI酶切整合了蛋白酶抑制剂SSI(Streptomyces subtilisin inhibitor)和抗菌肽(apidaecin)基因融合体的pOSΔB-Ap1(约7.9kb)(Appl.Environ.Microbiol.，60，3566-3572(1994))，制备约2kb的片段。再用EcoRI酶切大肠杆菌的多拷贝型质粒pUC18(宝酒造社制)，用T4 DNA聚合酶(宝酒造社制)进行平末端化后，进行自身连接，选择没有被EcoRI切断的质粒，再制备用SacI和HindIII酶切的2.7kb的片段。
接下来将pIJ702的SacI-PstI 5.1kb片段和pOSΔB-Ap1的HindIII-PstI 2kb片段以及pUC18的SacI-HindIII 2.7kb片段3者连接，构建穿梭载体-pUJS(约9.8kb)。
再用HindIII和EcoRI酶切pUJS，回收8.6kb大片段。用HindIII和EcoRI酶切整合了(1)中克隆的肉桂链轮丝菌IFO 12852转谷氨酰胺酶基因的pB3.5(约6.2kb)，回收3.5kb的HindIII-EcoRI片段。构建将该3.5kb的HindIII-EcoRI片段插入到pUJS的HindIII和EcoRI位点的pUJ-MTG(约12.1kb)。
以上的构建顺序如
图1所示。
用pUJ-MTG转化得到的转化体大肠杆菌AJ13669保藏于通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国305-8566茨城县筑波市东1丁目1-3)，保藏日期为1999年10月14日，保藏号为FERMP-17602；根据布达佩斯条约，该菌种于2000年8月28日转为国际保藏，保藏号为FERM BP-7287。实施例3.浅青紫链霉菌TK24的转化浅青紫链霉菌TK24是源自浅青紫链霉菌66的菌株，带有链霉素抗性(链霉菌的基因操作(Genetic manipulation ofStreptomyces)，实验室指南D.A.Hopwood et al.，p266，1985，Thejohn Innes Foundation Norwich)。本菌株是由D.A.Hopwood(JohnInnes Institute，Colney Lane，Norwich NR4 7UH，U.K.)提供的，可以从D.A.Hopwood实验室获得。
按照[特开平3-25118；Hunter，I.S.，“DNA克隆”实用方法2，Glover，D.M.(编著)，IRL出版(1985)；链霉菌的基因操作，实验室指南D.A.Hopwood et al.，p104，1985，The john InnesFoundation Norwich]的方法，将浅青紫链霉菌TK24原生质体化，然后进行转化。具体来说，将浅青紫链霉菌TK24于YEME培养基+0.5％甘氨酸中30℃培养2天。将200ml培养液进行离心分离(1,300g，室温，10分钟)，得到的菌体悬浮于72ml的0.35M蔗糖溶液中。
然后将该悬浮液进行离心分离(1,300g，室温，10分钟)，再将菌体悬浮于含有1mg/ml的溶菌酶(Sigma)的P缓冲液60ml中，于30℃温育2.5小时，用脱脂棉过滤，去除残余物。对得到的滤液进行离心分离(1,300g，室温，10分钟)，用P缓冲液25ml反复洗涤2次后，将沉淀悬浮于1ml P缓冲液中，作为原生质体悬浮液。[P缓冲液]TES[N-Tris(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸] 5.73g蔗糖 103g氯化镁2.03g硫酸钾0.5g氯化钙3.68g微量元素溶液 2ml/L(pH7.4)另外，配制1％磷酸二氢钾溶液，在临用前每100ml P缓冲液中加入1ml。[微量元素溶液]1L溶液中含有以下物质氯化锌 40mg氯化铁200mg氯化铜 10mg氯化锰 10mg硼酸四钠盐 10mg钼酸铵 10mg接着按照下述步骤，用转谷氨酰胺酶基因表达质粒pUJ-MEG(约12.1kb)转化浅青紫链霉菌TK24的原生质体悬浮液。
将下述物质缓慢混合，于室温静置2分钟。
DNA溶液(0.2μg/μl) 20μl浅青紫链霉菌TK24的原生质体悬浮液 100μl0.35M蔗糖溶液 20μl含有20％聚乙二醇1000的P缓冲液 1.5ml进行离心分离(1,700g，室温，10分钟)，收集沉积物，用P缓冲液反复洗涤2次，悬浮于1ml P缓冲液中后，将该悬浮液涂布于下述R-2琼脂培养基上，每份为200μl。[琼脂培养基]1)R-2/A硫酸钾 0.5g/l氯化镁 20.2g/l氯化钙 5.9g/l葡萄糖 20.0g/l脯氨酸 6.0g/l酪蛋白氨基酸0.2g/l微量元素溶液 4ml琼脂 44.0g/l2)R-2/BTES11.5g/l酵母提取物 10.0g/l蔗糖203g/l(pH7.4)3)1％KH2PO4分别配制1)2)3)，在制作平板培养基时将R-2/A和R-2/B混合，再与1％ KH2PO4溶液混合，混合比例为最终体积200m中混合有1ml的1％ KH2PO4溶液。
涂布了转化体的R-2琼脂培养基于30℃温育18小时后，加入含有200μg/ml的硫链丝菌肽的P缓冲液1ml，将琼脂的整个表面覆盖，再于30℃温育7天，得到菌落。从得到的菌落提取质粒，确认有目的质粒的导入。实施例4.转谷氨酰胺酶基因的表达和分泌生产将转化体pUJ-MEG/浅青紫链霉菌TK24在含有10μg/ml硫链丝菌肽的Tripton-Soya Broth(DIFCO公司制)液体培养基4ml中30℃培养3天，再将该培养液1ml接种到100ml上述液体培养基(500ml体积的坂口烧瓶)中，于30℃培养2周。每隔一定时间取培养液样品，进行SDS-PAGE，之后用特开平6-046855记载的抗转谷氨酰胺酶抗体，于《分子克隆》第2版(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，冷泉港实验室出版，p18.60(1989)记载的条件进行蛋白印迹(Westernblot)。结果表明，培养7～10天时可以确认有附加前体结构部分的转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶原)的分泌生产(约40-50mg/l)，进一步继续培养时，与转谷氨酰胺酶原经加工后的成熟转谷氨酰胺酶分子量几乎相同的转谷氨酰胺酶的生成量增大，培养2周时蓄积了约40～50mg/l的成熟型转谷氨酰胺酶。
用附加前体结构部分的转谷氨酰胺酶(转谷氨酰胺酶原)分泌生产量多的时期的培养上清，进行SDS-PAGE，之后半干印迹(semi-dryblotting)到PVDF膜上(“用于基因克隆的蛋白质结构解析”(Analysisof Protein Structure for Gene Cloning)，东京化学同人(1993))。转移后，用考马斯亮蓝对PVDF膜进行染色、脱色并风干。切下转谷氨酰胺酶原部分，用蛋白质测序仪(型号476A，Perkin-Elmer公司制)对N末端氨基酸序列进行解析。解析结果可以确认转谷氨酰胺酶原的N末端氨基酸序列中10个氨基酸序列(Gly-Asp-Gly-Glu-Glu-Lys-Gly-Ser-Tyr-Ala-)(序列号7)。该氨基酸序列与Biochimie.，80，313-319(1998)给出的前体区序列不同，而与实施例1测定的氨基酸序列(序列号2)一致。
由本发明可在链霉菌属细菌中生成转谷氨酰胺酶，并从培养液中大量得到转谷氨酰胺酶。通过本发明的方法在培养液中蓄积的转谷氨酰胺酶，由于是通过链霉菌属细菌自身生成的蛋白酶切割的成熟型转谷氨酰胺酶，所以可以简便而且可大规模地从培养基中回收成熟型转谷氨酰胺酶。
序列表<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>源自微生物的转谷氨酰胺酶的制备方法<130>Y1H0984<140><141><150>JP 11-295649<151>1999-10-18<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1461<212>DNA<213>肉桂链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)<220><221>CDS<222>(151)..(1398)<400>1cggcggcagc cctccttgcc gccggcgcag cgacgcagga cggcgcggcc aaggccctga 60gcggcagctc gtcgcaaacc cctccatcgc gtcgtgctct cacatgccct cgtttcacga 120ggcttcacca caagggagtt attgatttcc atg cac aaa cgt cgg aga ctt ctc 174Met His Lys Arg Arg Arg Leu Leu1 5gcc ttc gcc act gtg ggt gcg gtc ata tgc acc gca gga ttc aca cct 222Ala Phe Ala Thr Val Gly Ala Val Ile Cys Thr Ala Gly Phe Thr Pro10 15 20tcg gtc agc cag gcc gcc agc agt ggc gat ggg gaa gag aag ggg tcc 270Ser Val Ser Gln Ala Ala Ser Ser Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser25 30 35 40tac gcc gaa acg cac ggc ctg acg gcg gat gac gtc gag agc atc aac 318Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn45 50 55gca ctg aac gaa aga gct ctg act ctg ggc caa cct ggc aag cct ccg 366Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro60 65 70aag gaa tta cct ccg agc gcc agc gcg ccc tcc cgg gcc ccc tcc gat 414Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser Ala Pro Ser Arg Ala Pro Ser Asp75 80 85gac cgg gaa act cct ccc gcc gag ccg ctc gac agg atg cct gag gcg 462Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Glu Ala
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340 345 350His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu355 360 365Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly370 375 380Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp385 390 395 400Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro405<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述用于扩增源自肉桂链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因的PCR引物<400>5tccgatgacc gggaaactcc tcccgccgag 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述用于扩增源自肉桂链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因的PCR引物<400>6cggccagcct tgctccacct tggcgggggc 30<210>7<211>10<212>PRT<213>肉桂链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)<400>7Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser Tyr Ala1 5 10
权利要求
1.一种链霉菌属细菌，其特征在于，该细菌导入了含有源自放线菌的转谷氨酰胺酶基因序列以及调控该转谷氨酰胺酶基因表达的启动子序列的基因构建物。
2.权利要求1所述的链霉菌属细菌，其中，放线菌是肉桂链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)。
3.权利要求1或2所述的链霉菌属细菌，其中，该细菌是浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)。
4.一种转谷氨酰胺酶原的制备方法，其特征在于，培养 1～3任一项所述的链霉菌属细菌，使源自放线菌的转谷氨酰胺酶原分泌到培养基中。
5.一种成熟型转谷氨酰胺酶的制备方法，其特征在于，培养权利要求1～3任一项所述的链霉菌属细菌，使源自放线菌的转谷氨酰胺酶原分泌到培养基中，然后由源自上述链霉菌属细菌的蛋白酶切去上述转谷氨酰胺酶原的前体结构部分，并回收源自放线菌的成熟型转谷氨酰胺酶。
6.权利要求4所述的方法，其中，转谷氨酰胺酶原具有序列号2的第33位甘氨酸残基到第416位脯氨酸残基的氨基酸序列。
7.权利要求5所述的方法，其中，成熟型转谷氨酰胺酶具有序列号2的第87位丝氨酸残基到第416位脯氨酸残基的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及利用微生物分泌生产转谷氨酰胺酶的方法。本发明还涉及大量制备转谷氨酰胺酶的方法,该方法的特征在于,通过培养用含有源自放线菌的转谷氨酰胺酶基因以及该基因原有的(天然的)启动子的表达质粒转化的链霉菌属细菌,在培养初期至中期使转谷氨酰胺酶原分泌,在培养后期由源自链霉菌属细菌的蛋白酶等切去前体结构部分,获得成熟型(活性型)的转谷氨酰胺酶。
文档编号C12N15/54GK1379812SQ00814437
公开日2002年11月13日 申请日期2000年10月13日 优先权日1999年10月18日
发明者田口精一, 百濑春生 申请人:味之素株式会社