一种抗人组织转谷氨酰胺酶2的单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗人组织转谷氨酰胺酶2的单克隆抗体及其应用。本发明建立了一株大鼠杂交瘤细胞株，大鼠抗人组织转谷氨酰胺酶2（tGM2）杂交瘤细胞XK-1，CCTCC NO:C201312。该杂交瘤细胞分泌产生一种抗人组织转谷氨酰胺酶2(tGM2)的单克隆抗体,该单克隆抗体蛋白对组织转谷氨酰胺酶2（tGM2）有特异抑制作用，能有效抑制小鼠tGM2的酶活性，恢复基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，具有治疗肝纤维化的作用。CCTCC NO: C2013122013.01.14
【专利说明】一种抗人组织转谷氨酰胺酶2的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的单克隆抗体，还涉及一种抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的单克隆抗体在治疗小鼠肝纤维化中的应用。
【背景技术】
[0002]肝硬化是一种常见的慢性肝病，是肝严重纤维化的结果，将导致肝功能的逐步丧失，其病因包括肝病毒感染，酒精滥用以及其他因素。肝纤维化也为肿瘤的发生提供了环境，它不仅能激活肿瘤细胞，也能促进肿瘤的转移。2006年全国肝炎流性病学调查结果显示，我国人群乙型肝炎表面抗原携带率为7.18%，估算约有4.57亿人曾感染过乙肝病毒，其中9300万人为HBsAg携带者，其肝硬化和肝癌的发生率很高。肝癌目前在中国癌症死亡率上排名第二。我国每年因慢性肝病及肝硬化造成的经济损失估计为5000亿元人民币。在美国大约有4百万人患有慢性肝炎，并且肝癌的死亡率排名第八。每年因慢性肝病及肝硬化造成的经济损失估计为16亿美元。然而国际上有效治疗肝纤维化的方法是缺乏的。针对这一严峻现状，迫切需要研究和开发一种有效的治疗肝纤维化的创新方法。
[0003]肝纤维化起源于肝细胞外基质(ECM)过多的的交叉连接，这种连接就造成了肝组织刚度的增加并且不可逆转。在多个ECM交联酶中，组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)已被发现是一个很重要的因子，出现在包括肝硬化在内的各种组织纤维化的发病机制中。为了对抗tGM2的活性，具有烷基化功能的小分子抑制剂已经被研发。然而，它们的烷基化功效和组织接触性较差，妨碍了这些小分子抑制剂的治疗应用。我们的研究数据表明，肝纤维化是出现在免疫耐受的状态下。在此状态下基质金属蛋白酶(MMPs )的表达被抑制，免疫监视系统受损，组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的表达及酶活性增加，最终导致纤维组织过度增生和肿瘤的生长。
[0004]已有的发现给我们一个启示:如果能制备出一种单克隆抗体，既能抑制tGM2的酶活性，又能激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)，恢复基质金属蛋白酶在纤维化组织表面的表达和活性，将会大大促进纤维化的溶解和消退。基于这个理念，我们已成功地建立了一株抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的单克隆抗体。该抗体不仅能体外抑制人tGM2的酶活性，而且在小鼠模型中能恢复基质金属酶(MMPs)的表达，降低肝纤维化的程度，已显示出该抗体的治疗功效。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是在于提供了一种抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的单克隆抗体，该单克隆抗体由大鼠抗人组织转谷氨酰胺酶2(tGM2)杂交瘤细胞M-Ι分泌，所针对的靶标位点位于人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的酶活性位点内，在小鼠和人等多种物种间高度保守。该抗体显示出高度的特异性，并能有效地抑制组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的酶活性。
[0006]本发明还有一个目的是在于提供了一种大鼠抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)杂交瘤细胞该杂交瘤细胞可分泌抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的单克隆抗体，该细胞已于2013年I月14日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:大鼠抗人组织转谷氨酰胺酶2(tGM2)杂交瘤细胞XK-1，保藏编号:CCTCC NO:C201312，地址:中国武汉武汉大学。
[0007]本发明最后一个目的是在于提供了一种用抗人转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的单克隆抗体在制备治疗小鼠肝纤维化药物中的应用。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施:
[0009]一、靶标抗原决定簇的设计和多肽的合成:
[0010]利用文献检索和蛋白质氨基酸序列分析， 申请人:在转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的酶活性区域发现了一段高度保守的氨基酸序列，其序列为SEQ ID N0:1所示。该序列在小鼠、大鼠和人类之间高度保守。 申请人:按此序列进行了多肽的合成(由美国NeoB1lab公司合成)。多肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,简称KLH)进行偶联(由美国NeoB1lab公司合成)，作为免疫原去免疫大鼠。
[0011]二、抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)单克隆抗体的制备:
[0012]A、SD大鼠的免疫
[0013]用KLH-多肽偶联蛋白作为抗原免疫3只年龄为12周的SD大鼠。250ug抗原溶解于无菌的磷酸缓冲液里，并且在50°C水浴锅里加热30分钟，然后与福氏完全佐剂混和，制成均匀的油乳状物，并将抗原油乳状物注射于大鼠的腹腔。3周之后，用同样的方法将抗原与福氏不完全佐剂混匀，并注射于大鼠的腹腔。再过3周，用同样的方法将抗原与福氏不完全佐剂混匀，并注射于大鼠的腹腔。在最后一次免疫之后2周，通过眼球周边采血和酶联标记方法来确定KLH-多肽偶联蛋白的免疫成功。
[0014]B、细胞融合
[0015]在确定免疫成功之后一个月，作加强免疫。将200ug KLH-多肽偶联蛋白抗原经尾静脉注射于阳性大鼠。2天后，另取非免疫大鼠，制备滋养层细胞。4天后，处死被免疫的大鼠，用无菌剪刀与镊子取出脾脏，用PH7.4，0.1mol / L磷酸缓冲液洗去血液，用无菌的针头在无菌培养皿中将脾脏扎成多孔，淋巴细胞被释放于无血清的DMEM培养液里，最后用无血清的DMEM培养液制成细胞悬浮液，即为免疫大鼠脾淋巴细胞亲本，备用。取2X 17个IR983F大鼠骨髓瘤细胞(购自上海都宜生物科技公司)与18个免疫大鼠脾淋巴细胞于50ml离心管中，混匀于无血清的DMEM培养液中，300g离心5分钟，吸去上清液，重复2次。最后轻弹管底，使沉淀的细胞松动，于37度水浴中保温，并于I分钟内轻轻滴加Iml 50%PEG融合剂(Sigma公司)，同时轻轻弹动细胞60?90秒，然后于I分钟内滴加2ml无血清DMEM培养液，随后于2分钟内加入20毫升无血清的DMEM的培养液。离心300g，5min,吸去上清液，然后再用含20%小牛血清的HAT-DMEM培养液稀释至100ml，制成细胞悬浮液，以每孔10ul均匀分加于10块96孔细胞培养板中。然后于37度，C02培养箱中培养12-15天。期间，更换HAT细胞培养液4次。培养后期，若培养孔中培养液出现淡黄色，在观察确认有细胞克隆存在之后，可取出一部分培养液进行抗体检测。
[0016]C、杂交瘤细胞的筛选:
[0017]用酶联免疫标记的方法筛选抗体表达为阳性的杂交瘤细胞克隆。将合成的多肽抗原(非KLH偶联的多肽)溶解于0.05M碳酸缓冲液(PH9.6)，浓度为10ug/ml，包被于96孔聚苯乙烯板，4°C过夜。用磷酸缓冲液(PBS )洗涤3次之后，用0.5%BSA溶液封闭96孔板，37 °C，I小时。待测杂交瘤培养上清加入96孔板，37°C，培育I小时，然后用磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，再加入过氧化物酶(HRP)偶联的抗大鼠IgG的二抗(GE Healthcare公司)，37°C，培育30分钟。用磷酸缓冲液(PBS) +0.1%吐温(Tween-20)洗涤4次，用四甲基联苯胺(TMB)显色，经酶标仪定量测定，以确定产生抗多肽单抗的阳性孔。
[0018]经检测确定为产生抗tGM2多肽抗体的阳性孔细胞，先转移至24孔培养板培养扩增，用酶联免疫标记的方法再次确认阳性的杂交瘤细胞克隆，然后转移细胞至T25培养瓶中培养扩增。将阳性的杂交瘤细胞克隆冻存，同时挑选5个抗体表达水平最高的克隆进行再克隆，并经全面鉴定与分析，最后才能获得抗tGM2多肽的单克隆杂交瘤细胞系，由此获得了一株抗人tGM2的单克隆杂交瘤细胞，该细胞已于2013年I月14日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:大鼠抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)杂交瘤细胞》(-1，保藏编号=CCTCC N0:C201312，地址:中国武汉武汉大学。
[0019]该杂交瘤细胞与一般的杂交瘤细胞相似，属于悬浮培养细胞，可在RPMI 1640，10%FBS培养基中培养，细胞周期约为17小时。杂交瘤细胞向培养基中分泌抗tGM2的单克隆抗体，抗体浓度可达到25pg/ml。
[0020]D、抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)单克隆抗体的纯化制备:
[0021]抗人tGM2的单克隆抗体可通过诱发腹水瘤进行生产，其过程如下:向健康的SD大鼠腹腔注射Iml降植烷(Pristane)，饲养2周后，向大鼠腹腔接种5 X 16个杂交瘤细胞，饲养9?11天后即可明显产生腹水，待腹水量达到最大限度时，用毛细管抽取腹水，一般可得50ml左右。腹水经1000rpm/min离心1min,弃去上层脂肪层，收集中层腹水,_80°C保存备用。
[0022]抗人tGM2的单克隆抗体的分离纯化:收集的腹水经生理盐水4倍稀释后，加入等体积的饱和硫酸铵溶液(PH=7.4)混合均匀，4°C沉淀I小时。然后8000rpm/min离心30分钟。收集沉淀，并重新溶解于等体积的生理盐水中，再加入饱和硫酸铵溶液(PH=7.4)，使其体积占总体积的45%,4°C沉淀I小时。经8000rpm/min离心30分钟后,将沉淀重新溶解于适量的生理盐水中，_20°C保存备用。
[0023]利用Amersham Pharmacia B1tech 公司的 protein G 亲和层析柱(5ml, HiTrapprotein G HP)进行亲和层析。上样前，用20mM, pH=7.6的磷酸缓冲液平衡protein G亲和层析柱。吸取2ml经饱和硫酸铵盐析的样品，缓慢上样。待样品完全进入层析柱后，用20mM，pH=7.6的磷酸缓冲液洗脱杂蛋白，流速为0.5ml/min。杂蛋白洗脱完之后，用10mM, pH=3.2的柠檬酸缓冲液洗脱抗体蛋白，流速为lml/min，每管收集1ml。每只收集管中预先加有100ul，pH=9.0的IM Tris-HCL缓冲液，用来中和洗脱液至pH=7.0。经UV_280nm检测收集到的第二洗脱峰即为要纯化的抗体蛋白。然后，经超滤，浓缩即得高浓度的抗tGM2的单克隆抗体。抗体纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，纯度大于96%。
[0024]三、抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的单克隆抗体在制备治疗小鼠肝纤维化药物中的应用，其应用过程是:
[0025]A、小鼠肝纤维化模型的建立:
[0026]通过反复注射th1acetamide (TAA) (0.2mg/g体重,一周两次,共注射8周)建立小鼠肝硬化模型。图1，双荧光免疫染色显示，tGM2在小鼠正常肝脏里几乎没有表达，然而，在纤维化肝里，tGM2的表达明显增加，并显示出与纤维化的I型胶原桥梁相并存。更重要的是，小鼠肝硬化模型中tGM2在纤维化肝组织中的分布与在人肝硬化肝内的分布情况很相似(见图1)。
[0027]B、抗人转谷氨酰胺酶2的单克隆抗体在小鼠肝纤维化模型上的治疗效果:
[0028]小鼠被重复注射TAA (0.2mg/g体重，2次/周，共8周)。8周之后，小鼠明显地失去体重，肝纤维化症状出现。肝纤维化小鼠被分成两组。第一组为实验组(21只小鼠)，将被注射抗人tGM2的抗体，抗体的剂量分别是每只小鼠0.005晕克,0.02晕克或者0.1晕克，每种剂量注射7只小鼠。第二组为对照组(7只小鼠)，将被注射正常的大鼠IgG，剂量为0.1毫克。第三组为空白组(7只小鼠)，小鼠没有经过TAA和抗体的注射。在最后一次TAA注射后两天，经过腹腔注射抗tGM2的抗体或正常的大鼠IgG。5天之后，再注射一轮抗体。再过5天，小鼠被杀，治疗效果被评估。
[0029]图2A显示了天狼星红(Sirius Red)染色的结果，与对照组比较，肝纤维化结締在抗tGM2抗体治疗组(0.1毫克)显著减少。图2B显示，纤维化标志分子α-平滑肌肌动蛋白(α -SM)的表达也随着抗tGM2抗体剂量的增加而减少。图2C显示，在对照组受抑制的MMP9的表达得到部分恢复,然而在实验组抗tGM2的抗体的注射大大地增强MMP9的表达水平。这与小鼠肝纤维化的消退相一致。动物实验表明，抗人组织转谷氨酰胺酶的抗体蛋白作为药物能有效抑制组织转谷氨酰胺酶的酶活性，大大促进肝纤维化的消融，为治疗人肝纤维化、肝硬化提供了新的途径。
[0030]四、与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0031]目前国内治疗肝纤维化的常用药物包括秋水仙碱、干扰素、熊去氧胆酸等。秋水仙碱通过抑制微管蛋白聚合，干扰细胞的胶原分泌，刺激胶原酶的活性，增加胶原的降解，来减轻肝纤维化程度，但往往引起恶心、呕吐、食欲降低、腹泻、便秘和腹胀，有强的毒副作用。干扰素能抑制肝星状细胞的激活、增殖，具有抗肝纤维化的作用，但会引起发热，大药量可致可逆性血细胞减少，以白细胞和血小板减少为主，红细胞减少，药量大毒副作用强。熊去氧胆酸在长时间用药后肝纤维化改善程度不高。在国外，具有烷基化功能的抑制肝纤维化的小分子抑制剂已经被研发。然而，它们的烷基化功效和组织接触性较差，妨碍了这些小分子抑制剂的治疗应用。目前，临床上需要更加理想更加安全、有效的的抗肝纤维化的新药。人组织转谷氨酰胺酶2(tGM2)在人肝纤维化的过程中，起了重要作用。抗人组织转谷氨酰胺酶2的单克隆抗体，能特异地抑制人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的酶活性，作为大分子药物，较常规药物显示出许多优异性:(1)首先是该单克隆抗体的靶向性，像导弹似的，能定向地击中靶目标，特异性地结合人纤维化肝组织表面的转谷氨酰胺酶2 (tGM2)，抑制该酶的活性，阻止肝进一步纤维化，同时，该抗体对其他正常的人体组织器官有很少的结合，因而毒副作用小；(2)该抗体亲和力强，小剂量的抗体就能发挥其疗效，减少对人体组织器官的毒副作用；(3)通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)，该抗体能将基质金属蛋白酶(MMPs)聚集到纤维化肝的表面，直接溶解纤维化的细胞外介质，恢复肝的弹性和功能；
(4)作为大分子药物,单克隆抗体的制备工艺已成熟,工艺便捷，生产成本可以很低，极具产业化价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为一种小鼠肝硬化模型的双荧光法免疫染色示意图。
[0033]双荧光法免疫染色显示，纤维化标志分子胶原蛋白I和组织转谷氨酰胺酶2(tGM2)共存于小鼠肝纤维化部位。
[0034]图2为一种抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)单克隆抗体在小鼠肝纤维化模型上的治疗效果示意图。
[0035]抗人组织转谷氨酰胺酶2的单克隆抗体，通过恢复基质金属蛋白酶MMP9的活性，消减了小鼠肝纤维化。(A)天狼星红(Sirius Red)染色的结果显示，肝纤维化结締在抗人tGM2单克隆抗体的治疗下显著减少；(B)纤维化标志分子α -平滑肌肌动蛋白(a _SMA)的表达随着抗体剂量的增加而减少；(C)抗人tGM2抗体的治疗显著增强MMP9的表达水平。
[0036]图3为一种抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)单克隆抗体对tGM2的酶活性抑制示意图。
[0037]以人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)的酶活性部位为靶标的大鼠单克隆抗体，在体外能有效地抑制其转氨酶的活性。(A)抗人组织转谷氨酰胺酶2的单克隆抗体有效地抑制了tGM2所催化的生物素化的多肽底物与多聚赖氨酸的交联；(B)显示了人tGM2的功能结构示意图和酶活性位点，以及来自于酶活性位点的多肽抗原位点。
[0038]图4为一种人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)在肝硬化病人的肝样本上的表达示意图。
[0039]染色结果显示，人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)在肝硬化病人的肝纤维化部位有显著性的过量表达。(A)免疫荧光染色显示，人tGM2与纤维化标志分子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)共存于人肝纤维化部位；(B)天狼星红(Sirius Red)染色的结果；(C)显示肝硬化组织中人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)，α -平滑肌肌动蛋白(a -SMA)和胶原蛋白I的mRNA表达水平有显著增加。
[0040]图5为一种纤维化肝的免疫抑制和基质金属蛋白酶缺失的示意图
[0041]小鼠肝纤维化模型的研究结果显示，在肝纤维化部位，基质金属蛋白酶(MMPs)的表达受到到抑制，并出现免疫耐受。(A)在TAA处理后，正常肝的谷丙转氨酶(ATL)水平增加6倍，但纤维化肝的ATL水平没有显著变化；(B)在急性损伤的条件下，与纤维化肝相比，正常肝受到的损伤程度更严重；(C)与正常肝相比，纤维化肝的胶原蛋白I mRNA的表达水平增高了 4倍；(D)在急性损伤后，正常肝的基质金属蛋白酶MMP9的表达水平显著增加，而在纤维化肝MMP9的表达水平没有显著变化；(E)和(F)在急性损伤后，正常肝的TNF- α和IL-1 β的表达水平都显著增加，而在纤维化肝TNF-α和IL_1 β的表达水平没有显著变化。
【具体实施方式】
[0042]实施例1:多肽设计和合成
[0043]利用文献检索和蛋白质氨基酸序列分析软件， 申请人:在组织转谷氨酰胺酶2(tGM2)的酶活性区域发现了一段高度保守的氨基酸序列，其序列为SEQ ID N0.1所示。该序列在小鼠，大鼠和人类之间高度保守。 申请人:按此序列进行了多肽的合成(由美国NeoB1lab公司合成)。部分多肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,简称KLH)偶联(由美国NeoB1lab公司合成)，作为免疫原去免疫大鼠。
[0044]实施例2:抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)单克隆抗体的制备
[0045]A、SD大鼠的免疫
[0046]用KLH-多肽偶联蛋白作为抗原免疫3只年龄为12周的SD大鼠。250ug抗原溶解于无菌的磷酸缓冲液里，并且在50°C水浴锅里加热30分钟，然后与福氏完全佐剂混和，制成均匀的油乳状物，并将抗原油乳状物注射于大鼠的腹腔。3周之后，用同样的方法将抗原与福氏不完全佐剂混匀，并注射于大鼠的腹腔。再过3周，用同样的方法将抗原与福氏不完全佐剂混匀，并注射于大鼠的腹腔。在最后一次免疫之后2周，通过眼球周边采血和酶联标记方法来确定KLH-多肽偶联蛋白的免疫成功。
[0047]B、细胞融合
[0048]在确定免疫成功之后一个月，作加强免疫。将200ug KLH-多肽偶联蛋白抗原经尾静脉注射于阳性大鼠。2天后，另取非免疫大鼠，制备滋养层细胞。4天后，处死被免疫的大鼠，用无菌剪刀与镊子取出脾脏，用PH7.4，0.1mol / L磷酸缓冲液洗去血液，用无菌的针头在无菌培养皿中将脾脏扎成多孔，淋巴细胞被释放于无血清的DMEM培养液里，最后用无血清的DMEM培养液制成细胞悬浮液，即为免疫大鼠脾淋巴细胞亲本，备用。取2X107个IR983F大鼠骨髓瘤细胞(购自上海都宜生物科技公司)与18个免疫大鼠脾淋巴细胞于50ml离心管中，混匀于无血清的DMEM培养液中，300g离心5分钟，吸去上清液，重复2次。最后轻弹管底，使沉淀的细胞松动，于37度水浴中保温，并于I分钟内轻轻滴加Iml 50%PEG融合剂(Sigma公司)，同时轻轻弹动细胞60?90秒，然后于I分钟内滴加2ml无血清DMEM培养液，随后于2分钟内加入20毫升无血清的DMEM的培养液。离心300g，5min,吸去上清液，然后再用含20%小牛血清的HAT-DMEM培养液稀释至100ml，制成细胞悬浮液，以每孔10ul均匀分加于10块96孔细胞培养板中。然后于37度，CO2培养箱中培养12-15天。期间，更换HAT细胞培养液4次。培养后期，若培养孔中培养液出现淡黄色，在观察确认有细胞克隆存在之后，可取出一部分培养液进行抗体检测。
[0049]C、杂交瘤细胞的筛选:
[0050]用酶联免疫标记的方法筛选抗体表达为阳性的杂交瘤细胞克隆。将合成的多肽抗原(非KLH偶联的多肽)溶解于0.05M碳酸缓冲液(PH9.6)，浓度为10ug/ml，包被于96孔聚苯乙烯板，4°C过夜。用磷酸缓冲液(PBS )洗涤3次之后，用0.5%BSA溶液封闭96孔板，37 °C，I小时。待测杂交瘤培养上清加入96孔板，37°C，培育I小时，然后用磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，再加入过氧化物酶(HRP)偶联的抗大鼠IgG的二抗(GE Healthcare公司)，37°C，培育30分钟。用磷酸缓冲液(PBS) +0.1%吐温(Tween-20)洗涤4次，用四甲基联苯胺(TMB)显色，经酶标仪定量测定，以确定产生抗多肽单抗的阳性孔。
[0051]经检测确定为产生抗tGM2多肽抗体的阳性孔细胞，先转移至24孔培养板培养扩增，用酶联免疫标记的方法再次确认阳性的杂交瘤细胞克隆，然后转移细胞至T25培养瓶中培养扩增。将阳性的杂交瘤细胞克隆冻存，同时挑选5个抗体表达水平最高的克隆进行再克隆，并经全面鉴定与分析，获得一株抗tGM2多肽的单克隆杂交瘤细胞系。该细胞已于2013年I月14日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:大鼠抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)杂交瘤细胞XK-1，保藏编号:CCTCC NO:C201312，地址:中国武汉武汉大学。
[0052]D、抗人tGM2多肽的单克隆抗体的纯化制备:
[0053]抗人tGM2的单克隆抗体可通过诱发腹水瘤进行生产，其过程如下:向健康的SD大鼠腹腔注射Iml降植烷(Pristane)，饲养2周后，向大鼠腹腔接种5xl06个杂交瘤细胞，饲养9?11天后即可明显产生腹水，待腹水量达到最大限度时，用毛细管抽取腹水，一般可得50ml左右。腹水经1000rpm/min离心1min,弃去上层脂肪层，收集中层腹水,_80°C保存备用。
[0054]抗人tGM2的单克隆抗体的分离纯化:收集的腹水经生理盐水4倍稀释后，加入等体积的饱和硫酸铵溶液(PH=7.4)混合均匀，4°C沉淀I小时。然后8000rpm/min离心30分钟。收集沉淀，并重新溶解于等体积的生理盐水中，再加入饱和硫酸铵溶液(PH=7.4)，使其体积占总体积的45%,4°C沉淀I小时。经8000rpm/min离心30分钟后,将沉淀重新溶解于适量的生理盐水中，_20°C保存备用。
[0055]利用Amersham Pharmacia B1tech 公司的 protein G 亲和层析柱(5ml, HiTrapprotein G HP)进行亲和层析。上样前，用20mM, pH=7.6的磷酸缓冲液平衡protein G亲和层析柱。吸取2ml经饱和硫酸铵盐析的样品，缓慢上样。待样品完全进入层析柱后，用20mM，pH=7.6的磷酸缓冲液洗脱杂蛋白，流速为0.5ml/min。杂蛋白洗脱完之后，用10mM, pH=3.2的柠檬酸缓冲液洗脱抗体蛋白，流速为lml/min,每管收集1ml。每只收集管中预先加有100ul，pH=9.0的IM Tris-HCL缓冲液，用来中和洗脱液至pH=7.0。经UV_280nm检测收集到的第二洗脱峰即为要纯化的抗体蛋白。然后，经超滤，浓缩即得高浓度的抗tGM2的单克隆抗体。抗体纯度经SDS-PAGE电泳鉴定，纯度大于96%。Western Blot实验结果仅仅显示出一条80KD阳性带，说明该抗体能特异地与tGM2结合。该抗体为大鼠IgG2b亚型，抗体最高稀释可达0.5ug/mL.
[0056]实施例3:抗人tGM2单克隆抗体的功能活性的鉴定
[0057]为了检测单克隆抗体抑制tGM2的活性， 申请人:建立了一个酶促反应体系。在这个系统里，来源于人I型胶原蛋白的一段多肽先被B1tin修饰化(B1tin-LSQQIENI)，然后在tGM2的催化下被交联到多聚赖氨酸(poly-lysine)上(图3).交联反应的程度是通过avidin-HRP介导的酶促反应来监测。图3显示，随着抗tGM2的抗体浓度的增加，tGM2的转氨活性被大大抑制。
[0058]实施例4:人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)在肝硬化病人的肝样本上的表达
[0059]利用免疫荧光染色方法， 申请人:对十二例肝硬化病人的肝样本作了检验。图4A,-平滑肌肌动蛋白的染色(绿色)揭示出:不管病因如何(HCV，HBV，PBC，or HCC感染)，大多数肝硬化样本明显地存在着典型的结节性纤维化桥梁(nodular fibrotic bridges)。tGM2染色(红色)揭示:tGM2蛋白广泛地表达在纤维化桥梁里和其周围，显示出tGM2与纤维化的紧密相关。恶性的假小叶的周围也存在着tGM2阳性的纤维桥梁。图4B，天狼星红(Sirius Red)染色揭示出肝样本上的纤维結节，即肝脏疤痕。利用qRT-PCR的方法我们也检测了硬化肝的tGM2的mRNA的表达水平。图4C显示:1型胶原蛋白和-平滑肌肌动蛋白(两种典型的纤维化指标)的mRNA水平分别增加了 5倍多和2倍多。tGM2的mRNA也显著地增加了 2倍。最后，我们检测了细胞外间质tGM2的酶活性，发现硬化肝的tGM2的转氨酶活性显著增加。
[0060]实施例5:小鼠肝纤维化模型的建立
[0061]通过反复注射th1acetamide (TAA) (0.2mg/g体重,一周两次,共注射8周)建立小鼠肝硬化模型。图1，双荧光免疫染色显示，tGM2在小鼠正常肝脏里几乎没有表达，然而，在纤维化肝里，tGM2的表达明显增加，并显示出与纤维化的I型胶原桥梁相并存。更重要的是，小鼠肝硬化模型中tGM2在纤维化肝组织中的分布与在人肝硬化肝内的分布情况很相似(见图1)。
[0062]实施例6:纤维化肝脏的免疫抑制和基质金属蛋白酶的缺失
[0063]由于急性损伤而造成的肝纤维化可以通过基质金属蛋白酶(MMPs)自发地清除。然而，由于慢性肝炎造成的肝硬化疤痕却不能得到及时溶解。这是因为纤维化肝的肝星状细胞中许多基质金属蛋白酶(MMPs)的基因被沉默化了，蛋白酶不再表达(Qin andHan, 2010)。既然在纤维化的肝星状细胞里MMPs的活性被永久地抑制，那么用于溶解纤维化的MMPs就可能来源于白细胞或骨髓衍生的淋巴细胞。大多数MMPs基因的表达是受促炎性细胞因子(TNF-aand IL-Ιβ)诱导的。事实上，从血浆ALT水平和肝出血症状表明，纤维化肝是抗TAA损伤挑战的(见图5A和5B)，而正常肝在经过TAA损伤挑战后会进入坏死。急性损伤的正常肝表达了大量的基质金属蛋白酶MMP9，而发生硬化的肝却没有显示MMP9的表达(见图OT).主要的促炎性细胞因子，TNF-α和IL-1 β，仅仅在急性损伤的肝中表达水平增高，但在纤维化的肝脏中却没有增加(见图5Ε和5F)。因此， 申请人:认为发生肝硬化的肝组织中存在着免疫抑制，而且这种免疫抑制保护了纤维化组织免受免疫系统的进攻，消除了基质金属蛋白酶的表达，并促进了肿瘤的发生和转移。
[0064]实施例7:抗人tGM2单克隆抗体在小鼠肝纤维化模型上的治疗效果
[0065]小鼠被重复注射TAA (0.2mg/g体重，2次/周，共8周)。8周之后，小鼠明显地失去体重，肝纤维化症状出现。肝纤维化小鼠被分成两组。第一组为实验组(21只小鼠)，将被注射抗人tGM2的单克隆抗体，抗体的剂量分别是0.005晕克,0.02晕克和0.1晕克,每种剂量注射7只小鼠。第二组为对照组(7只小鼠)，将被注射正常的大鼠IgG，剂量为0.1毫克。第三组为空白组(7只小鼠)，小鼠没有经过TAA和抗体的注射。在最后一次TAA注射后2天，经过腹腔注射抗人tGM2的单克隆抗体或正常的大鼠IgG。5天之后，再注射一轮抗体。再过5天，小鼠被杀，治疗效果被评估。
[0066]图2A显示了天狼星红(Sirius Red)染色的结果，与对照组比较，肝纤维化结締在抗人tGM2单克隆抗体治疗组(0.1毫克)显著减少。图2B显示，纤维化标志分子α-平滑肌肌动蛋白(α -SM)的表达也随着抗人tGM2抗体剂量的增加而减少。图2C显示，在对照组，受抑制的MMP9的表达得到部分恢复，然而在实验组，抗人tGM2抗体的注射大大地增强MMP9的表达水平。这与小鼠肝纤维化的消退相一致。
【权利要求】
1.一种杂交瘤细胞，其特征在于:大鼠抗人组织转谷氨酰胺酶2 (tGM2)杂交瘤细胞XK-1, CCTCC NO: C201312。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗体。
3.权利要求2所述抗体在制备治疗小鼠肝纤维化药物中的应用。
【文档编号】C12R1/91GK104278013SQ201310393799
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】张红军, 韩原平 申请人:武汉谐康生物科技有限公司