一种高效发酵绿色木霉制备纤维素酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效发酵绿色木霉制备纤维素酶的方法。采用方法的要点是将绿色木霉接种于察氏培养基上活化，挑取单菌落接种于液体活化培养基中扩大培养得到种子液，按照体积比1:10～20的接种量接种于液体产酶培养基中，40至60目毛竹粉5～20g/L作为发酵底物，液体发酵72～120h制备纤维素酶。该方法稳定、高效，特别适用于绿色木霉发酵产纤维素酶。本发明针对绿色木霉生理特性优化得到一套高效液体发酵工艺，可以获得高酶活力的纤维素酶；同时提出资源化利用毛竹原料作为纤维素酶诱导底物，制备高附加值生物酶制剂，是高值化利用毛竹资源的一条创新思路，可切实提高我国竹区农民的经济收入，具有重要的现实意义。
【专利说明】一种高效发酵绿色木霉制备纤维素酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备纤维素酶的方法，特别涉及一种高效发酵绿色木霉制备纤维素酶的方法，属于生物化学中微生物培养【技术领域】。
【背景技术】
[0002]纤维素酶是一组能够水解纤维素分子链的葡萄糖苷键使其转化成葡萄糖的多组分酶的总称，是几种具有不同酶活力的酶复合物，主要包括外切纤维素酶、内切纤维素酶、
葡萄糖苷酶等。纤维素需要这些酶的共同出现并协同作用、共同催化才能被完全降解。 利用纤维素酶将纤维素转化为食品、能源、化工材料，对解决人类面临的诸多资源、环境问题具有极大的现实意义。
[0003]当前阻碍人类广泛高效利用纤维素酶的瓶颈，一是缺少纤维素酶高产菌，二是发酵产酶工艺仍待进一步优化。目前用于生产纤维素酶的微生物菌种较多的是丝状真菌， 其中，酶活力较强的菌种为木霉属、曲霉属和青霉属，特别是绿色木霉及其近缘菌株较为典型，是公认较好的纤维素酶生产菌。此外，反刍动物依靠瘤胃微生物可消化纤维素，如瘤胃细菌和热纤梭菌等，但产量和活性较低。国内外纤维素酶的制备方法主要有固体发酵法和液体发酵法两种。固体发酵设备投资少，但占地面积大、易染杂菌、生产稳定性较差，而且技术不易掌握，难以进行扩大化生产，目前我国多数企业仍采用固体发酵工艺制备纤维素酶；液体发酵具有生产稳定性高、技术易掌握、便于工业化生产等优势，但因纤维素酶为诱导酶，采用玉米秸、麦秸、稻草等作为诱导物，效果并不十分理想，因此企业纷纷采用价格昂贵的木材作为原料，大大增加了企业生产成本，制约了纤维素酶生产技术的推广和应用。
[0004]在发酵微生物制备纤维素酶领域，中国专利(ZL200810023480.8) “一种提高纤维素酶产量的里氏木霉培养方法”在里氏木霉产酶过程中调节通风量，使产酶主要阶段溶解氧浓度在20~30%，以利于菌体生长，产出的纤维素酶较固定通风量产酶的滤纸酶活提高30%，产酶时间缩短14% ;中国专利(ZL200510009000.9) “高活性纤维素酶及其制造方法”以担子菌CGMCCN0.1294作为生产菌种，灭菌接入三角瓶液体菌种，进行液体深层发酵， 经过滤、浓缩和喷雾干燥制成纤维素酶粉，测定产酶活力为40000u/g，且过程稳定性好、不易染菌、便于大规模工业化生产；中国专利(ZL200610002014.2) “微生物发酵生产低温纤维素酶的方法”将产生纤维素酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好，经过扩大培养、发酵产酶，根据不同需要和使用对象，将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备不同活性、纯度和剂型的纤维素酶制剂；美国专利(US61110732) “Hosts an`d fermentation processes for cellulase production”将经过基因改性的丝状真菌作为培养菌种，以 25~100wt%的半纤维素来源醇糖和0~75wt%的葡萄糖、丙三醇或者二者的混合物作为碳源，发酵制备同时含有纤维素酶和半纤维素酶活力的复合酶。美国专利(US60920942) “Process for producing cellulase”将长枝木霉、木素木霉、黑曲霉、木曲霉通过不同培养和发酵工艺，同时制备纤维素酶和槐糖脂两种产品。截至目前，还未见到利用毛竹原料作为诱导底物，高效发酵绿色木霉制备纤维素酶的相关工艺技术出现。
【发明内容】
[0005]为了解决目前微生物发酵制备纤维素酶工艺过程的菌种产酶效率低、固体发酵稳定性差、诱导底物效果不理想等实际问题，同时资源化利用我国丰富、价格低廉的毛竹资源，制备高附加值生物酶制剂，本发明目的是提供一种高效发酵绿色木霉制备纤维素酶的方法。
[0006]为实现上述目的，本发明的技术方案是采用以下步骤:
[0007]I)将未经活化的绿色木霉在无菌环境中以无菌水溶解，采用平板划线法将菌种接种于察氏培养基上，在24~32°C的恒温培养箱中培养72~168h，至生长出单菌落，得到经过活化的绿色木霉；
[0008]2)将步骤I)得到的经过活化的绿色木霉在无菌环境中挑取单菌落，接种于液体活化培养基中，在24~32°C、180~260r/min的恒温振荡器中培养48~72h，得到扩大培养的种子液；
[0009]3)将步骤2)得到的扩大培养的种子液按照体积比1:10~20的接种量接种于液体产酶培养基中，按照60%的装入量装入发酵罐中，产酶培养制备纤维素酶，控制发酵液pH 值3~7、发酵温度24~32°C、通气量1:0.4~1.2、发酵时间72~120h，得到的发酵液在 4000r/min的冷冻离心机中离心IOmin,采用截留分子量100~500k的聚醚砜膜浓缩使其浓度提升20倍，得到纤维素酶。
[0010]所述的液体活化培养基配方为:葡萄糖10~20g/L、蛋白胨I~2g/L、 Tween800.2~0.4g/L、硫酸铵I~2g/L、磷酸二氢钾I~3g/L、硫酸镁0.1~0.3g/L、氯化钙0.1~0.3g/L、尿素0.4~0.8g/L、占液体活化培养基总体积10~20%的Mandels营养盐、溶剂为PH=3~7的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min。
[0011]所述的液体产酶培养基配方为:葡萄糖4~6g/L、40至60目毛竹粉5~20g/L、 Tween800.2~0.6g/L、硫酸铵I~3g/L、磷酸二氢钾3~5g/L、硫酸镁0.3~0.5g/L、氯化钙0.3~0.5g/L、尿素0.8~1.2g/L，占液体产酶培养基总体积0.1~0.3%的Mandels微量元素、溶剂为pH=3~7的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min。
[0012]与【背景技术】相比，本发明具有的有益效果是:
[0013]本发明在发酵制备纤维素酶的微生物菌种中引入绿色木霉，针对绿色木霉的生理特性优化得到一套高效液体发酵工艺，在此工艺下可以获得高酶活力的纤维素酶；`同时提出资源化利用毛竹原料作为纤维素酶的诱导底物，制备高附加值生物酶制剂，是高值化利用毛竹资源的一条创新思路，符合国家发展循环经济政策，并可切实提高我国竹区农民的经济收入。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是实施例3经过察氏培养基活化生长出单菌落的绿色木霉照片；
[0015]图2是依据实施例3的工艺条件，在不同发酵时间段制备的纤维素酶的CMC酶活。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。[0017]实施例1:
[0018]I)将未经活化的绿色木霉在无菌环境中以无菌水溶解，采用平板划线法将菌种接种于察氏培养基上，在24°C的恒温培养箱中培养72h，至生长出单菌落，得到经过活化的绿色木霉；
[0019]2)将步骤I)得到的经过活化的绿色木霉在无菌环境中挑取单菌落，接种于液体活化培养基中，在24°C、180r/min的恒温振荡器中培养48h,得到扩大培养的种子液；(液体活化培养基配方:葡萄糖10g/L、蛋白胨lg/L、Tween800.2g/L、硫酸铵lg/L、磷酸二氢钾lg/L、 硫酸镁0.lg/L、氯化钙0.lg/L、尿素0.4g/L、占液体活化培养基总体积10%的Mandels营养盐、溶剂为PH=3的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min)
[0020]3)将步骤2)得到的扩大培养的种子液按照体积比1:10的接种量接种于液体产酶培养基中，按照60%的装入量装入发酵罐中，产酶培养制备纤维素酶，控制发酵液PH值3、发酵温度24°C、通气量1:0.4、发酵时间72h，得到的发酵液在4000r/min的冷冻离心机中离心 lOmin，采用截留分子量IOOk的聚醚砜膜浓缩使其浓度提升20倍，得到纤维素酶(a)。(液体产酶培养基配方:葡萄糖4g/L、40至60目毛竹粉5g/L、Tween800.2g/L、硫酸铵lg/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化钙0.3g/L、尿素0.8g/L，占液体产酶培养基总体积0.1% 的Mandels微量元素、溶剂为pH=3的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min)
[0021]实施例2:
[0022]I)将未经活化的绿色木霉在无菌环境中以无菌水溶解，采用平板划线法将菌种接种于察氏培养基上，在28°C的恒温培养箱中培养108h，至生长出单菌落，得到经过活化的绿色木霉；
[0023]2)将步骤I)得到的经过活化的绿色木霉在无菌环境中挑取单菌落，接种于液体活化培养基中，在28°C、220r/min的恒温振荡器中培养60h，得到扩大培养的种子液；(液体活化培养基配方:葡萄糖15g/L、蛋白胨1.5g/L、Tween800.3g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.2g/L、尿素0.6g/L、占液体活化培养基总体积15%的 Mandels营养盐、溶剂为pH=5的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min)
[0024]3)将步骤2)得到的扩大培养的种子液按照体积比1:15的接种量接种于液体产酶培养基中，按照60%的装入量装入发酵罐中，产酶培养制备纤维素酶，控制发酵液pH值5、 发酵温度28°C、通气量1:0.8、发酵时间96h，得到的发酵液在4000r/min的冷冻离心机中离心lOmin，采用截留分子量300k的聚醚砜膜浓缩使其浓度提升20倍，得到纤维素酶(b)。 (液体产酶培养基配方:葡萄糖5g/L、40至60目毛竹粉10g/L、Tween800.4g/L、硫酸铵2`g/ L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁0.4g/L、氯化钙0.4g/L、尿素1.0g/L,占液体产酶培养基总体积
0.2%的Mandels微量元素、溶剂为pH=5的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min)
[0025]实施例3:
[0026]I)将未经活化的绿色木霉在无菌环境中以无菌水溶解，采用平板划线法将菌种接种于察氏培养基上，在30°C的恒温培养箱中培养144h，至生长出单菌落，得到经过活化的绿色木霉；
[0027]2)将步骤I)得到的经过活化的绿色木霉在无菌环境中挑取单菌落，接种于液体活化培养基中，在30°C、240r/min的恒温振荡器中培养72h，得到扩大培养的种子液；(液体活化培养基配方:葡萄糖20g/L、蛋白胨2g/L、Tween800.3g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化钙0.2g/L、尿素0.8g/L、占液体活化培养基总体积15%的Mandels营养盐、溶剂为pH=5的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min)
[0028]3)将步骤2)得到的扩大培养的种子液按照体积比1:15的接种量接种于液体产酶培养基中，按照60%的装入量装入发酵罐中，产酶培养制备纤维素酶，控制发酵液PH值5、发酵温度30°C、通气量1: 1、发酵时间108h，得到的发酵液在4000r/min的冷冻离心机中离心 lOmin，采用截留分子量300k的聚醚砜膜浓缩使其浓度提升20倍，得到纤维素酶(C)。(液体产酶培养基配方:葡萄糖6g/L、40至60目毛竹粉15g/L、Tween800.4g/L、硫酸铵1.5g/ L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.4g/L、尿素1.2g/L，占液体产酶培养基总体积 0.15%的Mandels微量元素、溶剂为pH=5的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min)
[0029]实施例4:
[0030]I)将未经活化的绿色木霉在无菌环境中以无菌水溶解，采用平板划线法将菌种接种于察氏培养基上，在32°C的恒温培养箱中培养168h，至生长出单菌落，得到经过活化的绿色木霉；
[0031]2)将步骤I)得到的经过活化的绿色木霉在无菌环境中挑取单菌落，接种于液体活化培养基中，在32°C、260r/min的恒温振荡器中培养72h，得到扩大培养的种子液；(液体活化培养基配方:葡萄糖20g/L、蛋白胨2g/L、Tween800.4g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾3g/L、 硫酸镁0.3g/L、氯化钙0.3g/L、尿素0.8g/L、占液体活化培养基总体积20%的Mandels营养盐、溶剂为PH=7的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min)
[0032]3)将步骤2)得到的扩大培养的种子液按照体积比1:20的接种量接种于液体产酶培养基中，按照60%的装入量装入发酵罐中，产酶培养制备纤维素酶，控制发酵液pH值7、 发酵温度32°C、通气量1: 1.2、发酵时间120h，得到的发酵液在4000r/min的冷冻离心机中离心lOmin，采用截留分子量500k的聚醚砜膜浓缩使其浓度提升20倍，得到纤维素酶(d)。 (液体产酶培养基配方:葡萄糖6g/L、40至60目毛竹粉20g/L、Tween800.6g/L、硫酸铵3g/ L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.5g/L、尿素1.2g/L，占液体产酶培养基总体积
0.3%的Mandels微量元素、溶剂为pH=7的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min)
[0033]测定实施例1、2、3、4制备得到的四种纤维素酶的CMC酶活。表1为由实施例1、2、
3、4制备的四种纤维素酶CM`C酶活的测定结果。由表1中数据可知，采用本发明所述的制备方法获得的纤维素酶(a)、(b)、(c)、(d)的CMC酶活分布在2110~2640IU/mL，均具有较高的纤维素酶活力，说明本发明涉及方法符合高效发酵制备纤维素酶的技术范畴。
[0034]如图1，从实施例3经过察氏培养基活化生长出单菌落的绿色木霉照片可看出，其为气生绿色菌丝，菌丝较长而直，侧枝较少，在生长的中后期收缩而产生孢子丝，孢子小，呈卵圆形。如图2，依据实施例3的工艺条件，在72~120h的发酵过程中，得到的纤维素酶 CMC酶活先升后降，在108h达到最高酶活2640IU/mL，因此实施例3的最佳产酶发酵时间定为 108h。
[0035]表1
[0036]
【权利要求】
1.一种高效发酵绿色木霉制备纤维素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤:1)将未经活化的绿色木霉(Trichodermaviviride)在无菌环境中以无菌水溶解,采用平板划线法将菌种接种于察氏培养基(czapck)上，在24~32°C的恒温培养箱中培养72~ 168h，至生长出单菌落，得到经过活化的绿色木霉；2)将步骤I)得到的经过活化的绿色木霉在无菌环境中挑取单菌落，接种于液体活化培养基中，在24~32°C、180~260r/min的恒温振荡器中培养48~72h，得到扩大培养的种子液；3)将步骤2)得到的扩大培养的种子液按照体积比1:10~20的接种量接种于液体产酶培养基中，按照60%的装入量装入发酵罐中，产酶培养制备纤维素酶，控制发酵液pH值3~7、发酵温度24~32°C、通气量1:0.4~1.2、发酵时间72~120h，得到的发酵液在4000r/ min的冷冻离心机中离心IOmin,采用截留分子量100~500k的聚醚砜膜浓缩使其浓度提升20倍，得到纤维素酶。
2.根据权利要求1所述的一种高效发酵绿色木霉制备纤维素酶的方法，其特征在于: 所述的液体活化培养基配方为:葡萄糖10~20g/L、蛋白胨I~2g/L、Tween800.2~0.4g/ L、硫酸铵I~2g/L、磷酸二氢钾I~3g/L、硫酸镁0.1~0.3g/L、氯化钙0.1~0.3g/L、尿素0.4~0.8g/L、占液体活化培养基总体积10~20%的Mandels营养盐、溶剂为pH=3~7 的磷酸缓冲液(PBS)，120°C高压蒸汽灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的一种高效发酵绿色木霉制备纤维素酶的方法，其特征在于:所述的液体产酶培养基配方为:葡萄糖4~6g/L、40至60目毛竹粉5~20g/L、 Tween800.2~0.6g/L、硫酸铵I~3g/L、磷酸二氢3~5g/L、硫酸镁0.3~0.5g/L、氯化钙0.3~0.5g/L、尿素0.8~1.2g/L，占液体产酶培养基总体积0.1~0.3%的Mandels微量元素、溶剂为pH=3~7的PBS，120°C高压蒸汽灭菌20min。
【文档编号】C12R1/885GK103497941SQ201310393491
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月1日 优先权日:2013年9月1日
【发明者】姚菊明, 庄源, 张勇, 崔建梅 申请人:浙江理工大学