专利名称：绿色木霉真菌及其菌剂的制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病害生物防治领域，具体地说涉及一种能够防治多种植物病害的 绿色木霉菌株，以及利用该菌株制备生防菌剂的方法和该生防菌剂的应用。
背景技术：
植物病害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织(FAO)统计每年因植物遭受病害 造成的减产平均损失为总产量的10% 15%。几个世纪以来，化学农药在植物病虫草害的 防治工作中发挥着积极的作用，为农业的稳产、增产及挽回损失等做出了重要的贡献。但过 量施用和滥用农药业导致了许多负面影响，如地力衰退、环境污染、产生抗药性等。尤其近 年来，农产品中农药残留超标造成人畜中毒事件不断发生，严重威胁了人们的生活质量，限 制了我国农产品的外贸出口。随着社会文明的发展进步，人们对无污染、无公害绿色食品呼 声日益提高，生物防治已经成为植物病害防治的研究热点，它在生产方式、食品安全、营养 健康、生态平衡和生物多样性上都和人类未来的发展方向具有良好的相融性。生防菌作为生物防治的重要一环，一直是植物病害生物防治研究的热点。生防菌 的种类繁多，生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌等。其中木霉菌(Trichoderma. spp) 是被人们较早研究并被开发应用到生产中的生防微生物。它广泛存在于土壤、植物根际种 子表面等生态环境中，易于分离和培养，而且对许多病原真菌和病原细菌有拮抗作用，具有 良好的生防应用前景。该属真菌具有生长速度快，适应性强，产孢量大等优点，有的菌丝体 内还有厚垣孢子，易于工业化生产，并能产生多种抗生物质及酶类，抑制或减弱病原菌产生 抗药性。因此，在发展可持续农业呼声越来越高的今天，它作为一类资源丰富的拮抗微生 物，在植物病害生物防治中具有举足轻重的作用。据不完全资料统计，木霉至少对18个 属四种病原真菌在体外或体内有拮抗作用，已广泛用于多种植物真菌病害的防治，特别是 对丝核菌、镰刀菌、齐整小核菌、疫霉菌、腐霉菌、链格孢菌等引起的病害具有较好的防治效 果。国内外许多科研人员也已成功的利用木霉菌防治了许多重要的植物病害，如辣椒白绢 病，豇豆枯萎病，棉花立枯病及猝倒病等。近年来，采用木霉菌防治纹枯病的研究也屡见报 道。随着人类对生态环境的进一步重视以及农业可持续性发展的需要，生物防治技术 势必将进一步发展，特别是现代生物技术的应用必然会开拓生防科技的新领域。微生物农 药的研究和应用在新世纪之初迎来一个前所未有的历史机遇和技术挑战，产业发展前景十 分广阔。因此，微生物农药在未来的10 20年里将迅速发展，在保护环境、保证人类健康， 在促进农业可持续发展进程中发挥愈来愈重要的作用。
发明内容
本发明旨在为多种植物病害提供一种可用于生物防治的具有高效、广谱杀菌活性 的绿色木霉菌株，以及利用该菌株制备生防菌剂的方法，此外，还提供了这种绿色木霉在植 物病害防治上的应用。
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本发明的目的是通过以下方案实现的。本发明的绿色木霉真菌菌株命名为绿色木霉(Trichoderma viride)菌株^S6， 该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 3538，保藏日期为2009年12月23日。其菌落在PDA培养平板上圆形或近圆形，菌丝 生长初期为白色绒状，后期呈现同心轮纹状的浓绿产孢区。显微镜下观察，菌丝纤细无色， 具分隔，多分枝；分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，呈环状排列，具几次重复分枝，着生分生 孢子的小梗瓶形或锥形；分生孢子多为球形，绿色或蓝绿色。本发明所提供的生防菌剂，由绿色木霉(Trichoderma viride)菌株制备而 成，为液态或固态菌剂。上述生防菌剂的制备方法为(1).液态菌剂制备方法将保存的绿色木霉菌株^se移入PDA培养基平板上，光暗交替培养4d，无菌 条件下刮取分生孢子，用无菌水配制ι χ IO7的分生孢子悬浮液，按Iml孢子悬浮液/IOOml PDB培养基进行接种，置于，150rpm条件下振荡培养3d，电动搅拌器以2000rpm转速搅 拌aiiin，与1.9L磷酸缓冲液混合(内含0. 的助剂吐温100和0. 2%的防腐剂苯甲酸)， 即得到液态生防菌剂。(2).固态菌剂制备方法将保存的绿色木霉菌株移入PDA培养基平板上，光暗交替培养4d，无菌 条件下刮取分生孢子，用无菌水配制ι χ IO7的分生孢子悬浮液，按2ml孢子悬浮液/IOOg基 质培养基进行接种，26°C光暗交替培养8-lOd后，混勻即得固态生防菌剂。所述的基质培养基物质配成为麦麸，玉米粉，稻糠，水，质量比为2 1 2 5， 即IOOg基质培养基中含有20g麦麸，IOg玉米粉，20g稻糠及50g水，混勻后高压湿热灭菌本发明所述生防菌剂的施用方法为液态菌剂通过常规的灌根、浸种、喷雾等方法 施用。固态菌剂主要通过根施、穴施等方法使用。可单独使用，也可以与对本生防菌株无副 作用的其它杀菌剂、植物调节剂混合使用。一般在作物播种期或病害始发期施用。播种前， 采用液态菌剂与种子拌种，或直接根施、穴施；或在病害始发期，通过灌根施入作物根际或 通过叶面喷雾，花蕾和果实表面喷雾施用。本发明所提供的绿色木霉真菌菌株抑菌谱广，对包括小麦赤霉病菌，西瓜枯萎病 菌，黄瓜灰霉病菌，梨黑星病菌，小麦全蚀病菌，黄瓜疫病菌，苹果褐斑病菌，芝麻枯萎病菌， 山药炭疽病菌，小麦纹枯病菌，棉花黄萎病菌，辣椒枯萎病菌、水稻纹枯病菌和苹果腐烂病 菌等植物病原菌均有较好的抑菌作用，除对山药炭疽病菌的抑菌率低于50%外，其余均在 70%以上，表现出竞争、重寄生作用，对部分病菌还表现出拮抗作用。本发明提供了由绿色木霉菌株^se制备而成的生防菌剂，室内和田间试验证明 对多种作物病害，如黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病、水稻纹枯病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、小麦 白粉病等具有显著的防治效果。本发明的优点在于绿色木霉^se菌株抑菌谱广泛，抑菌效果明显，生防菌剂种 类多，施用方法范围广，对多种病害在室内及田间均有较好的抑菌效果。同时，对人畜安全， 对环境没有污染，对生物多样性及生态平衡没有影响，具有很好的相融性。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
具体实施例方式下述实施例中所用方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1 绿色木霉菌株的分离筛选(1)木霉的分离纯化将采来的土样阴干、研磨后，称取5g，放入150ml盛有45ml生 理盐水的三角瓶中。采用土壤稀释分离法，吸取ImL的稀释液加入到含有9mL水的试管中， 振荡混勻，制得10_2 土壤稀释液。取0. Iml 土壤稀释液涂布于含有丙酸钠及硫酸链霉素的 PDA培养基中，倒置在25°C的恒温培养箱中培养3d。挑取分离到的木霉菌落，进行单孢分离 纯化后，转入PDA斜面培养基，待菌丝及孢子长满斜面后，加入灭菌石蜡油进行封存备用。( 供试病原菌包括小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，西瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporium)，黄瓜灰霉病菌(Botrytis cirerea)，梨黑星病菌(Venturia nashicola)，小麦全烛病菌(Gaeumannomyces grami)，黄瓜疫病菌(Phytophthora melonis)，苹果褐斑病菌(Marssonina coronaria)，芝麻枯萎病菌(Fusarium oxysporum)， 山药炭疽病菌(Colletotrid umgloeosporiodes),小麦纹枯病菌(Rhizocto-nia cerealis),棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae),辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和苹果腐烂病菌(Valsmali Miyabe et Yamada)。(3)拮抗木霉的筛选对分离纯化到的木霉菌株，以供试病原真菌为靶标，采用平板 对峙培养法进行初步筛选。具体方法为在9cm PDA平板上对峙接种活化3d的全蚀病菌 及木霉菌饼(d = 0. 8cm)，两者各距培养皿边缘lcm，25°C明暗交替培养，以单独接种病原菌 的平板作为对照，每处理重复3次，培养4d，定时观察，记录菌落半径及寄生率，并计算生长 速率及平板培养4d时木霉对病原菌的抑制率。抑制率(％)=[(对照菌落半径-对峙培养菌落半径)/对照菌落半径]X 100(4)结果从小麦田土中共分离获得12株木霉，分别编号为^S1_ZBS12。木霉菌株 在PDA培养基上生长菌落呈近圆形，初期为白色绒状，后期呈现绿色至深绿色，部分木霉呈 现同心轮纹状密实的产孢区。生长速度快，4d左右即可长满全皿并大量产孢。本实施例中，以小麦全蚀病菌等12个病原菌为靶标菌，通过对峙筛选，获得了一 株对各种被测试病害均有较强抑菌效果的木霉菌株mS6，具体抑菌效果见表1。表1木霉菌株^se对各病原菌的抑菌效果
权利要求
1.一种绿色木霉真菌菌株，其特征在于该菌株命名为绿色木霉(Trichoderma viride)菌株 ZBS6，菌种保藏号为 CGMCC No. ；3538。
2.根据权利要求1所述的绿色木霉真菌菌株，其特征在于该菌株的菌落在PDA培养 平板上圆形或近圆形，菌丝生长初期为白色绒状，后期呈现同心轮纹状的浓绿产孢区；显微 镜下观察，菌丝纤细无色，具分隔，多分枝；分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，呈环状排列， 具几次重复分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形；分生孢子多为球形，绿色或蓝绿色。
3.利用权利要求1所述的绿色木霉真菌菌株制备的液态或固态生防菌剂。
4.制备权利要求3所述液体生防菌剂的方法，其特征在于(1).液态菌剂制备方法将保存的绿色木霉菌株^se移入PDA培养基平板上，光暗交替培养4d，无菌条件 下刮取分生孢子，用无菌水配置1 X IO7的分生孢子悬浮液，按Iml孢子悬浮液/IOOml PDB 培养基进行接种，置于26°C，150rpm条件下振荡培养3d，电动搅拌器以2000rpm转速搅拌 2min，与1. 9L磷酸缓冲液混合(内含0. 的助剂吐温100和0. 2%的防腐剂苯甲酸)，即 得到液态生防菌剂。(2).固态菌剂制备方法将保存的绿色木霉菌株移入PDA培养基平板上，光暗交替培养4d，无菌条件 下刮取分生孢子，用无菌水配置1 X IO7的分生孢子悬浮液，按2ml孢子悬浮液/IOOg基质 培养基进行接种，26°C光暗交替培养8-lOd后，混勻即得固态生防菌剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的基质培养基，物质配成为麦麸，玉 米粉，稻糠，水，质量比为2 :1:2: 5，即IOOg基质培养基中含有20g麦麸，IOg玉米粉， 20g稻糠及50g水，混勻后高压湿热灭菌备用。
6.权利要求3所述的生防菌剂的施用方法，其特征在于液态菌剂通过常规的灌根、浸 种、喷雾等方法施用，固态菌剂主要通过根施、穴施等方法使用。可单独使用，也可以与对本 生防菌株无副作用的其它杀菌剂、植物调节剂混合使用。
7.根据权利要求6所述的施用方法，其特征在于一般在作物播种期或病害始发期施 用，播种前，采用液态菌剂与种子拌种，或直接根施、穴施；或在病害始发期，通过灌根施入 作物根际或通过叶面喷雾，花蕾和果实表面喷雾施用。
8.权利要求1所述的绿色木霉真菌菌株在抑制小麦赤霉病菌，西瓜枯萎病菌，黄瓜灰 霉病菌，梨黑星病菌，小麦全蚀病菌，黄瓜疫病菌，苹果褐斑病菌，芝麻枯萎病菌，山药炭疽 病菌，小麦纹枯病菌，棉花黄萎病菌，辣椒枯萎病菌，水稻纹枯病菌和苹果腐烂病菌上的应 用。
9.权利要求1所述的绿色木霉真菌菌株在防治黄瓜霜霉病上的应用。
10.权利要求1所述的绿色木霉真菌菌株在防治小麦白粉病上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种绿色木霉真菌菌株及其生防菌剂制备方法和应用，该菌株命名为绿色木霉(Trichoderma viride)菌株ZBS6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3538。所述微生物菌剂为液态或固态菌剂，是利用绿色木霉ZBS6菌株制备而成。本发明的ZBS6菌株及其菌剂抑菌谱广、抑菌效果好，对黄瓜灰霉病菌、水稻纹枯病菌、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、苹果褐斑病菌、辣椒枯萎病菌等有较强的抑制作用；该菌剂可用于黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病、水稻纹枯病菌以及小麦土传病害和小麦白粉病的防治，高效无毒、使用简单、不造成环境污染。
文档编号A01N63/04GK102071145SQ201010277098
公开日2011年5月25日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者全鑫, 刘明源, 姚刚林, 孙虎, 杨丽荣, 武超, 薛保国 申请人:河南省农业科学院